全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
黑曲霉脂肪酶盖子结构域突变对其活性的影响
薛龙吟 林瑞凤 舒正玉 黄建忠
(福建师范大学生命科学学院 福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心 福建省现代发酵技术工程研究中心,福州 350108)
摘 要: 比较黑曲霉脂肪酶与黑曲霉酯酶的 3D结构发现二者在盖子结构域存在显著差异。根据已解析的酯酶的 3D
结构信息, 运用重叠延伸 PCR技术,对黑曲霉脂肪酶的 4个位点进行突变,以期获得开盖型黑曲霉脂肪酶。4个突变位点分别
为形成黑曲霉脂肪酶盖子结构的 螺旋与酯酶对应区域的 螺旋相互置换; Ser84突变为 Gly; A sp99突变为 P ro; Lys108突变
为 Glu。 4个重组质粒导入毕赤酵母 GS115菌株进行异源表达后, 仅 pPCI9KanlD99P和 pPCI9Kan lK108E实现了活性表达。
关键词: 黑曲霉 脂肪酶 盖子结构域 突变 活性
Effect ofM utation at the Lid Domain of
Aspergillus niger Lipase on Activity
Xue Longy in L in Ruifeng Shu Zhengyu Huang Jianzhong
(Engineering Research Center of IndustrialM icrob io logy, M inistry of Education, Engineering Research
C enter of Fujian M odern Ferm entation T echnology, College of L ife Sciences, FujianN ormal University, Fuzhou 350108)
Abstrac:t There ex isted obv ious d ifference at the lid doma in betw eenA. niger lipase andAniger feru loy l esterase by supe rim po
sing the pred icted 3D m o lecular structure o fA niger lipase on the Xray threed im ensiona l structure o fAniger feruloyl esterase Four
sites o fAniger lipase we re mutated to design the lipasem o lecularw ith a pe rm anently open lid conform ationThe four sites w ere as fo l
low s, a mutual exchange o f the am ino ac id residues fragm ent be tw een the lid dom ain ofA niger lipase and the co rrespondinghelix do
m ain o fAn iger feruloy l esterase; Ser84 was m utated to G ly; A sp99 w as muta ted to P ro; Lys108 was m utated to G luThe muta ted li
pase genes w ere transform ed intoP ichia pastoris GS115 and on ly tw om utated lipase genes, pPC I9Kan lD99P and pPC I9Kan lK108E,
w ere functiona lly expressed
Key words: A sperg illus niger L ipase L id dom ain M utation Activ ity
收稿日期: 20091105
基金项目:国家 863!计划资助项目 ( 2007AA100703) ,国家自然科学基金资助项目 ( 30870545) ,福建省自然科学基金 (杰青 )项目 ( 2009J06013) ,
福建省科技平台资助项目 ( 2005Q007)
作者简介:薛龙吟,男,在读研究生,研究方向:酶工程; Em a i:l inxu e@ foxma il com
通讯作者:黄建忠, Em ai:l hjz@ f jnu edu cn;舒正玉, Em ai:l shuzhengyu@ gm ail com
除枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)脂肪酶等少
数微生物脂肪酶分子外, 绝大多数微生物脂肪酶均
有一段 螺旋形成的盖子结构覆盖在活性中心的上
方,阻止底物分子进入到活性中心 [ 1]。该 螺旋为
两亲性肽链环 ( amph iph ilic peptidic loop), 脂肪酶分
子一旦处于油水界面, 螺旋的疏水区域与油水界面
上的疏水性脂分子相互作用,盖子结构域的构像发生
结构性重排,盖子结构打开, 底物通过一个 缝隙!进
入酶分子内与活性中心的氨基酸残基接触, 脂肪酶表
现出催化活性。脂肪酶的催化活性在油水界面迅速
提高的现象即为界面激活。自从 1936年首次发现脂
肪酶界面激活现象以来,脂肪酶的盖子结构和以脂肪
酶作为研究对象的界面激活的分子机制一直是研究
的热点,并逐渐发展出现代的界面酶学 [ 2]。微生物脂
肪酶盖子结构除了与脂肪酶催化的界面激活有关外,
还与脂肪酶的底物特异性 (链长选择性 )、立体选择
性、稳定性等酶学性质有关 [ 35 ]。
脂肪酶分子的界面激活催化特性, 使脂肪酶的
催化活性受底物的团聚状态、底物乳化分散的程度
及油水界面质量的影响。同时,大量试验结果表明,
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
油水界面容易导致脂肪酶的变性失活 [ 2]。构建开
盖型脂肪酶分子,保留脂肪酶的盖子结构,降低盖子
结构缺失对脂肪酶产生的负面影响。同时, 使脂肪
酶的催化活性不受底物团聚状态的影响, 有助于提
高脂肪酶的催化效率和稳定性, 具有较大的应用
价值。
从先前的研究中发现, 酯酶分子的 3D结构在
与脂肪酶盖子结构对应的区域, 也可以形成 螺旋
结构, 但酯酶分子的该 螺旋结构远离活性中心的
上方 [ 6]。因此,比较脂肪酶和酯酶盖子结构两侧的
铰链区氨基酸序列差异,对脂肪酶分子盖子结构两侧
的铰链区进行突变,有可能获得开盖型脂肪酶分子。
本试验针对黑曲霉脂肪酶盖子结构及其两侧的铰链区
构建了一系列脂肪酶突变体基因,并检测了突变体脂
肪酶分子的活性, 为筛选开盖型脂肪酶分子奠定了
基础。
1 材料和方法
11 材料与试剂
质粒 pFJNUL01 (携带黑曲霉脂肪酶编码基因
cDNA )和 pPIC9K, 菌株 E scherichia coli DH5和
P ichia pastoris GS115均由本课题组保藏; 各种限制
性内切酶、连接酶及聚合酶均购自 TaKaRa公司 (大
连 ) ;各种引物序列 (上海生工生物工程技术服务有
限公司合成 )及用途如表 1。
表 1 各种寡聚核苷酸引物
引物编号 引物序列 ( 5∀- 3∀)
F1
GCGAATTCCATCACCATCACCATCACAGT
GTCTCGACTTCCACGTTGG
R1 CGGCGGCCGCTTATAGCAGGCACTCGGAAATC
L idF CCTACAGCTCGATACT CTCGGCTTCATCCTGCAA
L idR GCTGTAGGTTTGTGTCGGTGCTACTGCCTCGGAA
S84GF CGAGGCAGTGGTACCATCAAG
S84GR CTTGATGGTACCACTGCCTCG
D99PF TCCTGCAACCAAACGATGACC
D99PR GGTCATCGTTTGG TTGCAGGA
K108EF GCTGCGAAGTTCACACTGGAT
K108ER TGAACTTCGCAGCCAGTACAG
注:下划线的序列为酶切位点,斜体序列为引入的突变点
12 方法
121 黑曲霉脂肪酶基因突变位点的引入 利用
重叠 PCR技术, 以黑曲霉脂肪酶编码基因 cDNA
( pFJNUL01)作为出发材料, 以表 2中的各种引物对
及扩增条件进行 PCR扩增。分别将组成黑曲霉脂
肪酶盖子结构的氨基酸序列与黑曲霉酯酶对应的氨
基酸序列相互置换、黑曲霉脂肪酶 48位的丝氨酸突
变为甘氨酸、99位的天冬氨酸突变为脯氨酸和 108
位的赖氨酸突变为谷氨酸。
122 重组质粒的构建 分别用限制性内切酶
E coR I和N o t I酶切上述脂肪酶基因全长的 PCR扩
增产物和 pPIC9K质粒, 酶切产物纯化回收后,用 T4
DNA连接酶将 PCR产物分别插入到 pPIC9K质粒上,
获得的重组质粒依次编号为 pPIC9Kan llid, pPIC9K
anlS84G, pPIC9Kan lD99P和 pPIC9Kan lK108。重
组质粒转化 Ecoli DH5,转化子交由上海生物工程
技术有限公司测序验证。
123 重组质粒的转化、转化子的筛选及诱导表达
重组质粒的转化、转化子的筛选及诱导表达参见
Inv itrogen公司的 Mu ltiCopyP ichia Expression K it操
作手册进行。
124 脂肪酶活性的定性定量检测 脂肪酶酶活性
的定性检测采用罗丹名 B平板检测法 [ 7]。脂肪酶酶
活性的定量检测采用碱性滴定法 [ 8]。在 45# pH75
的条件下,每毫升酶液每分钟催化底物释放出 1 mo l
的游离脂肪酸,定义为一个脂肪酶活力单位 (U )。
2 结果与分析
21 突变位点的确定和引物的设计
前期研究结果表明,黑曲霉脂肪酶盖子结构域
与黑曲霉阿魏酸酯酶的对应结构域存在显著差异,
阿魏酸酯酶分子上与脂肪酶盖子结构对应的 螺
旋区域远离活性中心,与酯酶没有界面激活的催化
特性相对应 [ 9]。因此,将黑曲霉脂肪酶盖子结构的
氨基酸残基与酯酶对应的氨基酸残基相互置换, 有
可能获得新型开盖型脂肪酶。比较脂肪酶盖子结构
羧基端氨基酸残基序列, D99和 K108与酯酶对应的
氨基酸残基有显著差异 [ 6 ]。在脂肪酶盖子结构氨
基端氨基酸残基序列, Derew enda[ 10] 报道 S84对
Rh izomucorm iehei脂肪酶盖子的构象有重要影响,黑
曲霉脂肪酶在此对应位置也有一个 S84残基。因此,
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2010年第 2期 薛龙吟等:黑曲霉脂肪酶盖子结构域突变对其活性的影响
表 2 重叠 PCR技术突变脂肪酶编码基因使用得引物、模板及 PCR扩增条件
试验目的 引物对 模板 PCR扩增条件 目标产物及大小
脂肪酶盖子结
构与酯酶对应
结构域的置换
F1 /L idR pFJNUL01 94# 5 m in 1个循环; 94# 1 m in, 56# 1 m in, 72#
1m in, 25个循环; 72# 10m in 1个循环 L id1( 297 bp)
R1 /LidF pFJNUL01 同上 L id2( 563 bp)
F1 /R1
L id1和 L id2混
合物
94# 5 m in 1个循环; 94# 1 m in, 67# 1 m in, 72#
1m in, 25个循环; 72# 10m in 1个循环 an llid ( 849 bp )
S84G F1 /S84GR pFJNUL01 94# 5 m in 1个循环; 94# 50 s, 569# 45 s, 72#
1 m in, 25个循环; 72# 10m in 1个循环
S84G1
( 287 bp) R1 /
S84GF pFJNUL01 同上
S84G2
( 583 bp)
F1 /R1
S84G1和 S84G2
的混合物
94# 5 m in 1个循环; 94# 1 m in, 67# 1 m in, 72#
1 m in, 25个循环; 72# 10m in 1个循环
ANLS84G
( 849 bp)
D99P
F1 /D99PR pFJNUL01 94# 5 m in 1个循环; 94# 50 s, 55# 45 s, 72# 1 m in,
25个循环; 72# 10m in 1个循环
D99P1
( 333 bp)
R1 /D99PF pFJNUL01 同上 D99P2
( 537 bp)
F1 /R1
D99P1和 D99P2
的混合物
94# 5 m in 1个循环; 94# 1 m in, 67# 1 m in, 72#
1 m in, 25个循环; 72# 10m in 1个循环
ANLD99P
( 849 bp)
K108E
F1 /K108ER pFJNUL01 94# 5 m in 1个循环; 94# 50 s, 55# 45 s, 72# 1 m in,
25个循环; 72# 10m in 1个循环
K108E1
( 355 bp)
R1 /K108EF pFJNUL01 同上 K108E2
( 507 bp)
F1 /R1
K108E1和 K108E
2的混合物
94# 5 m in 1个循环; 94# 1 m in, 67# 1 m in, 72#
1 m in, 25个循环; 72# 10m in 1个循环
ANLK108E
( 849 bp)
本试验中选择 S84、D99和 K108作为突变位点, 替
换的氨基酸残基为酯酶对应位置的氨基酸残基。
在确定突变及置换氨基酸残基之后, 根据毕赤
酵母的密码子偏爱性, 确定编码置换的氨基酸的脱
氧核苷酸,设计出的引物对如表 1。
22 突变脂肪酶基因的获得
以 pFJNUL01质粒为模板, 分别以 F1 /L idR和
R1 /L idF为引物对, 扩增出脂肪酶基因片段 L id1
和 L id2(图 1A ),片段大小与预期一致;以 Lid1和
L id2混合物为模板, 以 F1 /F2为引物对,扩增出脂
肪酶盖子结构与酯酶对应结构置换后的脂肪酶基因
全长序列 anllid, 片段大小与预期一致 (图 1B )。
依据同样的原理和操作, 分别获得 S84G、D99P和
K108E位点突变的黑曲霉脂肪酶基因全长序列 (图
2A,图 2B )。
23 突变脂肪酶基因的测序验证
黑曲霉脂肪酶突变基因的测序结果与原始黑曲
霉脂肪酶基因序列比对结果如图 3, 比对结果表明,
在原来预期的位置都已引入突变的核苷酸。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
A: 1Lid1片段; 2L id2片段; B: 1盖子结构域置换后的
黑曲霉脂肪酶全长基因
图 1 黑曲霉脂肪酶盖子结构与
酯酶对应结构的相互置换
A: 1, 2. S84G; 3, 4. D99P; 5, 6. K108E; B: 1. S84G;
2. D99P; 3. K108E
图 2 黑曲霉脂肪酶盖子两侧氨基酸残基
S84、D99和 K108的定点突变
1S84G突变位点; 2ANLL id换盖; 3D99P突变位点; 4K108E突变位点
图 3 黑曲霉脂肪酶突变基因序列与原始黑曲霉脂肪酶基因序列比对
24 突变脂肪酶基因的表达及活性分析
突变脂肪酶基因在 P ichia pastoris GS115中诱
导表达后,发酵上清液用罗丹明 B定性检测结果如
图 4A。定性检测结果表明, 仅 D99P和 K 108E脂
肪酶基因突变体有活性, 而另外两个重组脂肪酶突
变体丧失酶活。定量检测结果表明, D99P和 K108E
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2010年第 2期 薛龙吟等:黑曲霉脂肪酶盖子结构域突变对其活性的影响
突变对重组脂肪酶活性有轻微影响; 而换盖和 S84G
对重组脂肪酶活性有严重影响,直接导致重组脂肪
酶完全丧失活性 (图 4B )。
图 4 脂肪酶突变体活性的定性检测 ( A)
和定量检测 ( B)
3 结论与讨论
本研究通过构建一系列黑曲霉脂肪酶盖子结构
域发生突变的脂肪酶基因突变体, 以期获得不依赖
油水界面激活的脂肪酶突变体。通过试验获得了两
个具有活性的突变体,但还有待进一步纯化并测定其
在油水界面的催化动力学,以判断其盖子结构是否处
于一种开盖状态; 对没有表现出活性的脂肪酶突变
体,还有待进一步深入分析突变失活的具体原因。
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