全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
脂肪酶的特异性折叠酶
程蓝骍 舒正玉 吴继光 陈的 蒋咏梅 李欣 黄建忠
(福建师范大学生命科学学院 福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心
福建省现代发酵技术工程研究中心，福州 350108)
摘 要: 以 Pseudomonas aeruginosa为代表的 I． 1 亚家族脂肪酶和以 Burkholderia cepacia 为代表的 I． 2 亚家族脂肪酶具
有优良的手性化合物拆分性能，在绿色化工领域具有良好的开发潜力及其应用前景。I． 1 亚家族脂肪酶和 I． 2 亚家族脂肪酶
均采用 II型分泌机制进行分泌，其分泌依赖于一种分子伴侣———脂肪酶的特异性折叠酶(lipase specific foldase，Lif)的协助。
从 Lif蛋白的分类、结构特点、介导对应脂肪酶折叠的特异性及机制、lif基因表达调控机制及尚待探讨的问题等方面系统介绍
Lif蛋白的研究进展。
关键词: 脂肪酶 脂肪酶特异性折叠酶 伴侣蛋白
Study of Lipase-specific Foldase
Cheng Lanxing Shu Zhengyu Wu Jiguang Chen De Jiang Yongmei
Li Xin Huang Jianzhong
(Engineering Research Center of Industrial Microbiology，Ministry of Education，Engineering Research Center of
Fujian Modern Fermentation Technology，College of Life Sciences，Fujian Normal University，Fuzhou 350108)
Abstract: Due to excellent enantioselective activity，lipases from subfamilies I． 1，such as Pseudomonas aeruginosa lipase，and
subfamilies I． 2，such as Burkholderia cepacia lipase displayed great potential for organic synthesis in green chemistry fields． The struc-
tural components of the type II secretion pathyway adpoted by lipases from subfamilies I． 1 and subfamilies I． 2 contained an important
protein moleculat chaperon lipase specific foldase(Lif) ，which was indispensable for the lipase correct folding and secrection． This arti-
cle will systematically reviewed the classification，structural characteristic，the specificity to the corresponding lipase，and molecular
mechanism of the lipase-Lif interaction of the lipase specific foldase．
Key words: Lipase Lipase-specific foldases Chaperone proteins
收稿日期:2010-10-15
基金项目:国家“863”计划项目(2007AA100703) ，国家自然科学基金项目(30870545) ，福建省自然科学基金(杰青)项目(2009J06013) ，福建省
科技平台资助项目(2005Q007)
作者简介:程蓝骍，女，硕士研究生，研究方向:酶工程;E-mail:123444516@ qq． com
通讯作者:黄建忠，E-mail:hjz@ fjnu． edu． cn;舒正玉，E-mail:shuzhengyu@ gmail． com
脂肪酶(1ipase，E． C． 3． 1． 1． 3，甘油三酰酯水解
酶)是一类在生物技术与有机合成化学领域具有重
要应用价值的生物催化剂，除了能催化长链甘油三
酰酯的水解反应外，在非水介质中，它还能催化酯
化、转酯化、醇解及胺解等多种化学反应［1］。以
Pseudomonas aeruginosa为代表的 I． 1 亚家族脂肪酶
和以 Burkholderia cepacia为代表的 I． 2 亚家族脂肪
酶，因其具有良好的有机溶剂耐受性，严谨的对映体
立体选择性，能高效催化多种对映体，如醇、胺及羧
酸的手性拆分，在各类有机合成中应用得尤为广
泛［2，3］。I． 1 亚家族脂肪酶和 I． 2 亚家族脂肪酶均
采用 II型分泌途径分泌至胞外，在其分泌过程中，
需要一种定位于细胞膜内膜上的伴侣蛋白———脂肪
酶的特异性折叠酶(lipase-specific foldase，Lif)的协
助，形成有活性的天然构象，然后才能通过 II 型分
泌途径分泌至胞外［4］。
1 I． 1 亚家族和 I． 2 亚家族脂肪酶的分泌机
制与 Lif家族
1． 1 I． 1亚家族和 I． 2亚家族脂肪酶的 II型分泌机制
脂肪酶的折叠和分泌是一个高度特异的过程。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
采用 II 型分泌机制分泌的细菌脂肪酶，首先在 Sec-
移位酶(Sec translocase)复合物协助下，通过细胞膜
内膜到达周质空间。Sec-移位酶定位于细胞膜内
膜，是一个多亚基的蛋白质复合体，由 1 个可溶性的
SecA二聚体和 5 个嵌入细胞内膜的亚基 SecY、E、
D、G和 F 组成。在周质空间内，脂肪酶在 Lif 蛋白
和 Dsb蛋白介导下，折叠成具有生物学活性的天然
构象后，才能进一步分泌到细胞外的基质中，错误折
叠的脂肪酶将被周质间隙的蛋白酶所降解。获得具
有分泌能力的分子构象后的脂肪酶蛋白，在定位于
细胞膜上的分泌子(Secreton)协助下，通过细胞膜
的外膜，分泌到细胞外的基质中。分泌子是由定位
在内外膜上的 12 种不同 Xcp 蛋白质亚基组成的多
亚基复合体，其中 XcpQ 蛋白在外膜上形成了一个
直径为 9. 5 nm 的孔状通道［5］。
1． 2 Lif家族
Lif是一类独特的、与其他蛋白质没有显著同
源性的蛋白质家族。比对已报道的 Lif 蛋白的氨
基酸序列，根据其相似性大小，Lif 蛋白可以分为
4 种不同的家族。家族 I 包含 P． aeruginosa、
Pseudomonas mendocina、Pseudomonas wisconsinen-
sis 与 Pseudomonas alcaligene 菌株产生的 Lif 蛋
白;家族 II 包含 B． cepacia、Burkholderia glumae、
Pseudomonas fragi、Xylella fastidosa 与 Ralstonia
metallidurans 等菌株产生的 Lif 蛋白;家族 III 包
含 Acinetobacter calcoaceticus 等菌株产生的 Lif 蛋
白;Vibrio cholerae 与 Vibrio vulnificus 等菌株产生
的 Lif蛋白构成了家族 IV。不论是哪一个家族的
Lif蛋白，在一级结构上，均含有 Rx1 x2 FDY(F /C)
L(S /T)A 保守序列的结构特征;在二级结构上，
几乎都是由 α-螺旋(70%)与无规卷曲(30%)这
两种二级结构成分组成的。所不同的是，家族 IV
的 Lif蛋白的分子量(约为 32 kD)略小于其他 3
个家族的 Lif蛋白的分子量(约为 38 kD)［4］。
1． 3 Lif-脂肪酶的互作及其特异性
基因水平和蛋白质水平的诸多试验均证实
Lif与对应的脂肪酶之间可发生相互作用，而且
Lif与对应脂肪酶之间的相互作用还具有一定的
特异性。Lif编码基因的异源表达产物与对应脂
肪酶编码基因的异源表达产物纯化后按照一定
的比例混合，可以形成稳定的复合物，这个复合
物可以共纯化、共免疫沉淀［6］。体外复性试验也
表明，Lif与对应同源脂肪酶有很高的亲和性，化
学变性后的脂肪酶在对应 Lif 蛋白的介导下可以
复性［7，8］。至于 Lif 与对应脂肪酶需要以多大的
比例发生相互作用，目前还存在一定的争议。从
基因结构看，Lif 蛋白编码基因与其上游对应的
脂肪酶编码基因由同一个操纵子调控，基因结构
组成比例为 1 ∶ 1;体外复性试验也证明，Lif 蛋白
只能与对应的脂肪酶分子按照 1 ∶ 1 的比例结
合［6］。在大肠杆菌体内进行的 Lif 蛋白编码基因
和脂肪酶编码基因共表达试验中，当这两个基因
分别用不同的启动子调控时，只有在先诱导合成
Lif蛋白后，才能获得有活性的脂肪酶;当停止对
Lif蛋白编码基因的诱导后，脂肪酶激活的动力
学曲线呈 S 形，这一现象表明在脂肪酶折叠过程
中，如果不持续合成 Lif 蛋白，先前合成的 Lif 蛋
白就会被消耗完［9］。上述一系列试验结果均表
明，Lif蛋白协助对应脂肪酶正确折叠后，不能再
继续协助另一个脂肪酶分子的折叠，是单周转的
催化剂(single-turnover catalysts)。但 Northern 杂
交试验分析 Lif基因与对应脂肪酶基因的转录及
mRNA 加工结果却表明，虽然 Lif 基因与对应脂
肪酶基因同步完成等比例的转录，但在转录后加
工的过程中，编码 Lif 蛋白的 mRNA 有相当部分
被降解，因此最后翻译出来的 Lif 蛋白的量也远
小于对应脂肪酶的表达量［10］。这一结果表明，
Lif蛋白协助对应脂肪酶正确折叠后，与该脂肪
酶分子分离，可以继续协助下一个对应脂肪酶分
子的折叠，是多周转的催化剂(multiple-turnover
catalysts)［10，11］。
Lif只能协助对应脂肪酶的正确折叠与激活，
对亲缘关系较近的不同种菌株脂肪酶的激活作
用效率较低，对亲缘关系较远的不同种菌株的脂
肪酶不具有激活作用。如来自于 P． aeruginosa 的
Lif蛋白可以高效率地协助与其对应脂肪酶的折
叠与激活，低效率地协助 P． alcaligenes 脂肪酶正
确折叠与激活，对 B． glumae 脂肪酶的正确折叠
与激活完全不具备任何活性。进一步试验表明，
Lif蛋白羧基端的 138 个氨基酸残基决定了这种
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2011 年第 4 期 程蓝骍等:脂肪酶的特异性折叠酶
特异性识别［10］。
2 Lif的结构与作用机制
Lif家族成员之间的氨基酸序列同源性水平较
低。比对所有已知的 Lif 蛋白的氨基酸序列，只有
8 个氨基酸残基相对保守，为 Rx1x2FDY(F /C)L
(S /T)A［4］。根据已解析的 B． glumae Lif-脂肪酶复
合物的晶体结构，Lif 蛋白采用了一种先前从未观
察到的特殊的折叠方式:由 11 个 α-螺旋构成一个
伸展的 α-螺旋复合体，包围着脂肪酶分子(图 1-a
和图 1-b) ，这与先前根据氨基酸序列预测出的 Lif
蛋白二级结构组成成分基本一致(均是由 70%的
α-螺旋与 30% 的无规卷曲这两种二级结构组成
的)［4］。N端的 α1 － α3 和 C 端的 α9 － α11 各自
分别形成了小型球状结构域(图 1-a) ，Lif 蛋白多
肽链中所有的芳香族氨基酸残基(3 个 Try，5 个
Tyr和 6 个 Phe)都位于球状结构域内。连接这两
个球状结构域的是富含 Pro 与 Ala 的 α4 － α8。如
若不与对应脂肪酶形成复合物，Lif 将不能形成有
特定构型的三级结构［12］。
图 1 Burkholderia glumae 的 Lif-脂肪酶
复合物的晶体结构
Lif蛋白羧基端的球形结构域决定了 Lif蛋白介
导对应脂肪酶折叠的功能及其特异性。将 P． aerug-
inosa Lif蛋白 C端的 29 个氨基酸残基(分布于α9 －
α11 结构域上)替换为 B． glumae Lif 蛋白对应的氨
基酸残基，形成的 P． aeruginosa Lif 蛋白突变体失去
了激活 P． aeruginosa脂肪酶的功能［10］。对 P． aerug-
inosa的 lif基因进行随机诱变获得的失活的 Lif 突
变体，其发生突变的部位也均位于 C 端结构域内
(如 S102R和 R115C 等)［13］。Lif 蛋白 N 端的部分
疏水性氨基酸残基以无规则的卷曲形成松散的未定
型结构，依赖 N 端的这些疏水性氨基酸残基将 Lif
蛋白锚定在细菌细胞膜的内膜上。N端被部分删除
(如删除 N端 21 个氨基酸残基或 N端 61 个氨基酸
残基)的 Lif 突变体在体内或体外仍然保持介导对
应脂肪酶折叠的功能，但缺乏膜锚定结构域的 Lif
突变体将随脂肪酶一同分泌到周质空间。Lif 蛋白
的这部分 N 端残基本身并非其介导对应脂肪酶折
叠复性所必需的，其在体内的功能主要是阻止 Lif
同脂肪酶一同分泌。Lif 蛋白的保守氨基酸残基序
列 Rx1x2FDY(F /C)L(S /T)A 组成了 α1 螺旋，定点
突变试验结果证明该结构域直接参与了介导脂肪酶
的激活［14］。连接 N端和 C端两个球状结构域的 α4
－ α8，占据了整个 Lif 蛋白表面积的 20%。不同的
Lif蛋白家族之间，这部分结构存在高度的种族差异
性，如家族 IV的 Lif蛋白在该区域缺失了相当大的
一部分区段。α4 － α8 结构域的主要功能可能仅仅
是使 Lif蛋白 C端的结构域从细胞膜内膜上更充分
地伸展到周质空间中，从而方便与脂肪酶的相互
作用［4］。
B． glumae Lif蛋白与脂肪酶相互作用的界面是
一个非极性平面，面积达 54002。除了疏水作用力
外，Lif 蛋白与脂肪酶之间还可以形成 20 个氢键。
此外，B． glumae 脂肪酶的 Glu63与 Lif 蛋白的 Arg343
之间可以形成盐桥［12］。在上述作用力下，Lif 蛋白
和脂肪酶形成折叠中间体的复合物，Lif 蛋白的二级
结构和三级结构均发生显著变化。Lif 蛋白未与脂
肪酶结合之前，不能形成有特定构象的三级结构。
与脂肪酶结合后，Lif 蛋白的 α-螺旋组分含量会增
加，并最终形成三级结构(图 1-b)［10］。体外折叠复
性试验表明，在缺乏 Lif蛋白的情况下，B． glumae 脂
肪酶能够折叠成稳定的、类似于活性脂肪酶的构象，
并且该构像的脂肪酶较活性脂肪酶具有更高的热稳
定性，但却没有脂肪酶活性。在 Lif 蛋白作用下，没
有活性的脂肪酶转变为有活性的脂肪酶。在 Lif 蛋
白与脂肪酶形成的折叠中间体复合物中，脂肪酶的
构象同活性脂肪酶的构象已经完全相同。据此试验
结果，El Khattabi等［6］推测 Lif蛋白与脂肪酶相互作
用过程中，Lif蛋白主要是协助脂肪酶克服折叠过程
中存在的能障。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
3 lif基因的表达调控
在 P． aeruginosa 菌中，编码 Lif 蛋白的 lif 基因
受到双重调节，分别调控脂肪酶 LipA 和脂肪酶
LipC的合成。
在 lipA / lif操纵子中，二组分系统(two compo-
nent-system)调控 lipA和 lif基因的转录。lipA / lif操
纵子的启动子是 δ54依赖型启动子。利用 Tn5 插入
突变分析，筛选到能作用于该启动子的转录激活因
子 LipR的编码基因 lipR;在 lipR 的上游，还有一个
信号转导传感激酶(signal transducing sensorkinase)
的编码基因 lipQ，其编码产物 LipQ 与 LipR 协同作
用于启动子，启动并促进 lipa 和 lif 基因的转录［5］。
除了 LipQ与 LipR，球状激活蛋白 GacA也参与了脂
肪酶基因的表达调控［15］。试验证实，GacA 能够有
效激活转录激活因子 RhIR 的转录与表达［15］。
Rosenau［5］推测，RhIR 可能与 LipQ /LipR 二组分系
统的调控部位结合，继而激活 LipQ-LipR 二组分系
统的转录与表达，从而提高脂肪酶的表达水平。到
目前为止，RhIR与 LipQ /LipR二组分系统结合的具
体部位尚未证实。
P． aeruginosa 除了可以分泌产生脂肪酶 LipA
外，还可以分泌产生脂肪酶 LipC。lipC 基因序列与
lipA基因序列有 51%的相似性，在 lipC 基因序列附
近虽然没有对应的 lif 基因序列，但有活性的 LipC
蛋白的合成却严格依赖于 lipA / lif 操纵子中的 Lif
蛋白质的合成。lipC 基因的表达调控机制有别于
lipA / lif操纵子，脂肪酶 LipC 仅在脂肪酶 LipA 的合
成完全受抑制的情况下才得以合成。进一步分析发
现，在 lipA-lif基因之间的间隔区内，含有一个 49 bp
的 DNA 片段，可以形成发卡结构，发挥启动子的功
能，独立调控 lif基因的转录与表达［16］。
试验表明，在构建 I． 1 亚家族和 I． 2 亚家族的
产脂肪酶工程菌时，当脂肪酶基因的拷贝数高于 10
时，对应 Lif 的表达量将成为进一步提高脂肪酶产
量的制约因素。提高 Lif 的表达量，提高 LipQ /
LipR、GacA等调控蛋白的表达量均可显著提高胞外
脂肪酶的产量［8，17］。
4 有关 Lif尚待深入探讨的问题
虽然对 Lif 蛋白的生理功能、作用机制及其基
因表达调控等有了深入的了解，但仍有许多未解之
谜尚待解答。
Lif蛋白对 I． 1 亚家族和 I． 2 亚家族脂肪酶的正
确折叠是否是不可或缺的前提条件。已有试验表
明，在缺乏 Lif 蛋白的情况下，部分 I． 2 亚家族的脂
肪酶在特定的环境下，可以折叠成具有活性的天然
构象。利用甘油具有促进未折叠蛋白质分子之间发
生疏水作用的功能［18］，在缺乏 Lif蛋白的情况下，向
脂肪酶复性缓冲溶液中添加 40%的甘油，B． glumae
和 B． cepacia脂肪酶可以折叠成天然构象。遗憾的
是这一现象不具有通用性，在相同的复性条件下，变
性的 P． aeruginosa 脂肪酶未能实现有效复性［6，19］。
一个更有意义的发现是:同为 I． 1 亚家族的 Acineto-
bacter calcoaceticus 脂肪酶和 Pseudomonas fragi 脂肪
酶(P． fragi 脂肪酶与 P． aeruginosa 脂肪酶和 B． ce-
pacia脂肪酶的同源性分别高达 45%和 38%) ，其正
确折叠根本无需 Lif蛋白的介导［20，21］。即使是依赖
Lif折叠的脂肪酶，其多肽链上的一个或多个氨基酸
残基突变形成的脂肪酶突变体，可以转变为不依赖
于 Lif折叠的脂肪酶。Pseudomonas sp． KFCC 10818
菌株产生的脂肪酶，其 112 位的 Pro 突变为 Glu 后
形成的脂肪酶突变体，将不再依赖对应 Lif 的介导
即可形成有活性的构象。缺乏 Lif 介导自发折叠形
成有活性构象的脂肪酶突变体，其恢复的活性可达
天然脂肪酶的 63%［22］。上述不依赖 Lif 蛋白介导
的脂肪酶正确折叠均是孤立的试验结果，根据试验
结果推测的分子机制，对整个 I． 1 亚家族和 I． 2 亚
家族脂肪酶而言，尚缺乏通用性。Lif 蛋白在介导
I. 1 亚家族和 I． 2 亚家族脂肪酶折叠中的作用，有待
进一步深入研究。
除了介导对应脂肪酶的折叠，Lif 蛋白是否还具
有其他生理功能，如脂肪酶的分泌，I． 1 亚家族和I． 2
亚家族脂肪酶是否均是采用Ⅱ型分泌机制进行分泌
的，但到目前为止，还没有有关这类脂肪酶的分泌信
号的任何报道。体外试验表明，Lif-脂肪酶的复合物
不可能自发解离。在体内，Lif-脂肪酶的复合物如何
分离的;是否 Lif 蛋白、脂肪酶或 Lif-脂肪酶复合物
作为一种结构成分，发挥了分泌信号的功能，与Ⅱ型
分泌体系的某个或某几个蛋白质相互作用，导致
Lif-脂肪酶复合物的自发解离，脂肪酶从而分泌到胞
外，由于还没有获得参与解离的分泌蛋白的报道，这
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一假设尚存争议［23］。
对上述问题的解答，将有利于深入了解 I． 1 亚
家族和 I． 2 亚家族脂肪酶的折叠机制，I． 1 亚家族和
I． 2 亚家族脂肪酶折叠与分泌偶联的机制，解决制
约 I． 1 亚家族和 I． 2 亚家族脂肪酶异源大量表达的
瓶颈，为 I． 1 亚家族和 I． 2 亚家族脂肪酶的工业化
生产及其应用奠定基础。
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(责任编辑 李楠)
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