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生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
筛选 dba t启动子顺式元件结合蛋
白的酵母单杂交文库的构建
姚瑞枫　张蒙　张鹏　李书涛　陈丽　付春华　余龙江
(华中科技大学生命科学与技术学院 ,武汉 430074)
　　摘 　要 : 　旨在构建酵母单杂交文库用于筛选与 dbat基因启动子顺式元件结合的转录因子。首先 ,分离 dbat启动子上的
顺式作用元件 ,并进行 3个拷贝的重复后 ,和报告质粒 pH is 2. 1连接构建诱饵载体 pH is 2. 12dp3。然后 ,从茉莉酸甲酯诱导的
红豆杉细胞中提取总 RNA,以纯化出的 mRNA为模板 ,依次完成 ss cDNA和 ds cDNA的合成 ,并将纯化的 ds cDNA、线性化载
体 pGADT72Rec2和诱饵载体 pH is 2. 12dp3共转化酵母细胞 Y187,各取 100μl分别涂布于 SD /2leu和 SD /2leu /2trp平板 ,用于
计算重组效率和转化效率 ,剩余转化液涂布于 SD /2leu /2trp /2his/20 mM 32AT平板 ,用于筛选阳性克隆。结果表明 ,重组效率
为 1. 49 ×106 CFU /μg,共转化效率为 1. 93 ×105 CFU /μg;对阳性克隆质粒进行酶切、测序分析 ,得到 6个可编码结合蛋白的基
因。以上工作为筛选调控紫杉醇合成关键酶基因 dba t表达的转录因子奠定了基础。
关键词 : 　红豆杉细胞 　dba t基因 　酵母单杂交文库 　结合蛋白 　转录调控
Construction of Yeast One2hybrid L ibrary for Screen ing
the Binding Prote ins of dba t Promoter C is2element
Yao Ruifeng　Zhang Meng　Zhang Peng　L i Shutao　Chen L i　Fu Chunhua　Yu Longjiang
( College of L ife Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, W uhan 430074)
　　Abs trac t: 　 It was to screen the binding p roteins of dba t p romoter cis2element, a yeast one2hybrid library was constructed. Firstly,
the dba t p romoter cis2elementwas cloned and repeated three cop ies, then ligated with reporter vector pH is 2. 1 to construct the bait vec2
tor pH is 2. 12dp3. Secondly, total RNA was extracted from Taxus m edia cells induced by methyl jasmonate, and the mRNA purified
from total RNA was used as temp late to synthesize ss cDNA, then the ss cDNA was used as the temp late to synthesize ds cDNA. The
purified ds cDNA, lined pGADT72Rec2 and pH is 2. 12dp3 were transformed into yeast strain Y187 together by L iAc2mediated method.
100μl of the transformation liquid was respectively coated on SD /2leu agar p late and SD /2leu /2trp agar p late to calculate the recombi2
nation efficiency and the transformation efficiency, and the residual transformation liquid was coated on SD /2leu /2trp /2his/20 mM 32AT
agar p lates to screen positive clones. The results showed that the recombination efficiency of the library was 1. 49 ×106 CFU /μg, and
the co2transformation efficiency was 1. 93 ×105 CFU /μg, and the restriction analysis and sequence analysis results showed that six
genes encoding binding p roteins of dba t p romoter cis2elementwere obtained. These results have laid a foundation for screening the tran2
scrip tion factors that regulate the exp ression of dbat gene, which is a key gene involved in the biosynthesis of Taxol.
Key wo rds: 　Taxus cells　dbat gene　B inding p roteins　Yeast one2hybrid library　Transcrip tion regulation
收稿日期 : 2009207202
基金项目 :国家自然科学基金面上项目 (NSFC 20776058) , 2006年教育部新世纪优秀人才支持计划 (NCET20620646) ,国家大学生创新性实验计
划项目 (2008055)
作者简介 :姚瑞枫 (19882) ,男 ,在读本科生 ,研究方向 :植物分子生物学 ; E2mail: rfyao@yahoo. cn;张蒙与第一作者对本文具有同等贡献
通讯作者 :余龙江 (19662) ,男 ,教授 ,研究方向 :生物技术与制药 ; Tel: 027287792264, E2mail: yulj@mail. hust. edu. cn　　紫杉醇 ( Taxol)是最先从红豆杉属 ( Taxus)植物中分离出的一种具有广谱抗癌药效的二萜类化合物 [ 1 ] ,实现红豆杉细胞培养稳定高产合成紫杉醇是 其产业化的关键 [ 2, 3 ]。红豆杉中紫杉醇生物合成途径已初步阐明 ,包括一系列关键步骤 [ 4 ] ,需要调控一系列关键酶的活性才能使紫杉醇合成途径的代谢
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
流畅通 ,显著提高紫杉醇产量 ,因此 ,研究调控紫杉
醇合成的转录因子具有重要意义。102去乙酰巴卡
亭 III210β2O2乙酰转移酶 ( 102deacetylbaccatin III210
β2O2acetyltransfrase, DBAT)是紫杉醇生物合成的重
要关键酶 ,催化紫杉醇侧链基团的连接 ,将 102去乙
酰巴卡亭 III催化为巴卡亭 III[ 5 ]。
前期研究已证明 DBAT酶是紫杉醇生物合成关
键酶 ,其基因转录水平是决定红豆杉细胞紫杉醇产
量的关键 [ 6 ] ,可见 ,研究调控 dba t基因表达的转录
因子十分重要。在克隆 dba t启动子并通过缺失分
析获得顺式作用元件的基础上 ,开展了酵母单杂交
文库构建的研究 ,筛选得到了 dba t启动子顺式元件
的结合蛋白 ,以期为获得调控 dba t基因表达的转录
因子并研究其调控机理奠定基础。
1　材料与方法
111　材料
植物材料为经茉莉酸甲酯 (methyl jasmonate,
MJ)诱导 [ 7 ] 10 d的曼地亚红豆杉 ( Taxus m edia )细
胞。细胞总 RNA提取溶液 TrizolTM Reagent购自 In2
vitrogen公司 ; mRNA纯化系统 polyA tractÓ mRNA iso2
latation system购自 Promega公司 ;酵母单杂交文库构
建系统 MatchmarkerTM One2hybrid L ibrary Construction
& Screening Kit (Cat. No. PT352921)购自 Clontech公
司 ;酵母质粒提取试剂盒 Yeast Plasm id Kit (Cat. No.
DP12202)购自 TIANGEN公司 ; Taq酶、DNA maker等
购自 TaKaRa公司 ,引物由上海捷瑞生物工程有限公
司合成。其他试剂均为国产分析纯。
核酸定量仪为 BeckMan DUÓ 7500紫外分光光
度仪 ; PCR仪为 B io2Rad公司生产的 S1000TM Ther2
mal Cycler。
112　方法
11211　总 RNA的提取及 mRNA的分离 　称取 5 g
经 100μg/m lMJ诱导 10 d的曼地亚红豆杉细胞 ,在
液氮中磨碎成粉末 ,按照 TrizolTM Reagent操作说明
加入适量 Trizol提取总 RNA,并用琼脂糖凝胶电泳
检测分析。之后 ,用 polyA tractÓ mRNA isolatation
system从总 RNA中分离 mRNA ,并用 BeckMan DUÓ
7500进行核酸定量。
11212　cDNA 的合成及纯化 　首先利用 Clontech
公司提供的 oligo ( dT) ( CDSIII)引物 ( 5′2ATTCTA2
GAGGCCGAGGCGGCCGACATG23′)进行 ss cDNA的
合成。在 0. 25 m l的离心管中加入 1μg mRNA模
板、1 μl CDS III引物 ,并补充 ddH2O 至 4 μl,于
72℃孵育 2 m in,冰浴 2 m in后 ,瞬时离心。然后 ,依
次加入 2 μl 5 × First2Strand Buffer、1 μl 20 mM
DTT、1 μl 10 mM dNTP M ix、1 μl MMLV Reverse
Transcrip tase,用手指轻弹混匀。42℃孵育 10 m in,
加入 1. 0μl SMART III引物 ,并轻弹混匀 ,继续在
42℃下孵育 1 h后 , 75℃孵育 10 m in终止反应。
ds cDNA 的合成采用 LD2PCR ( long2distance
PCR)扩增的方法。以 ss cDNA为模板 ,用 5′2p rimer
( 5′2TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTG
G23′)和 3′2p rimer (5′2GTATCGATGCCCACCCTCTAG
AGGCCGAGGCGGCCGACA23′)进行扩增。 PCR 扩
增程序 : 95℃、30 s; 95℃、10 s, 68℃、6 m in, 30个循
环 ;之后 , 68℃, 5 m in。扩增产物经 CHROMA SP IN
TE2400树脂层析柱 ( Clontech 公司 ) 纯化后 , 用
1. 2%的琼脂糖凝胶电泳检测。
11213　酵母感受态的制备 　依据 Yeastmaker Yeast
Transformation System 2 (Cat. No. 630439)使用说明
书 ,采用 L iAc方法制备酵母菌 Y187的感受态细胞。
11214　酵母单杂交文库的构建 　将 20μl ds cD2
NA , 3μg Sm aΙ线性化的 pGADT72Rec2和 5μg构
建好的诱饵质粒 pH is 2. 12dp3混合后 ,按照 Yeast
maker Yeast Transformation System 2 ( Cat. No. 6304
39)说明书共转化酵母菌 Y187感受态细胞后 ,对酵
母细胞悬液按 1 /10、1 /100、1 /1 000比例进行稀释 ,
并各取 100μl稀释液分别涂布在 SD /2leu平板和
SD /2leu /2trp平板上培养 ,用于计算重组和转化效
率 ,然后 ,将剩余的酵母细胞悬液按 100μl /皿涂布
在 SD /2leu /2trp /2his/20 mM 32AT平板上进行阳性
克隆的筛选。重组效率计算公式 :
重组效率 = CFU ×15 m l涂板体积 ×3μg ×稀释倍数
转化效率计算公式 :
转化效率 = CFU ×15 m l涂板体积 ×8μg ×稀释倍数
11215　文库的筛选 　对 1. 2. 4中在 SD /2leu /2trp /2
his/20 mM 32AT平板上筛选到的阳性克隆做进一步
的鉴定。提取平板上酵母克隆中质粒 ,电转化大肠
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2009年第 9期 姚瑞枫等 :筛选 dba t启动子顺式元件结合蛋白的酵母单杂交文库的构建
杆菌 DH5α,之后 ,从大肠杆菌中提取相应质粒 ,并
进行 H ind III酶切分析 ,将酶切产物大于 1 kb的相
应克隆进行测序。
2　结果与分析
高质量的 RNA提取及 mRNA的纯化是成功构
建酵母单杂交文库的关键之一 [ 8 ]。从 MJ诱导后的
曼地亚红豆杉细胞中提取总 RNA后 ,凝胶电泳分析
结果表明 , RNA条带完整 ,无降解现象 , 28S和 18S
条带清晰 ,比例恰当 ,约为 2∶1 (图 1) , OD260 /OD280
为 1. 86,说明总 RNA质量良好 ,总 RNA浓度约为
1. 1μg/μl。从总 RNA中分离 mRNA后 ,凝胶电泳
分析表明 mRNA为弥散状条带 ,质量良好 ,可用于
反转录构建文库。
1～4. 从曼地亚红豆杉细胞提取的总 RNA
图 1　从曼地亚红豆杉细胞提取的总 RNA的电泳分析
用 1μg mRNA做模板反转录合成 ss cDNA后 ,
以 ss cDNA为模板 ,用 LD2PCR扩增合成 ds cDNA,并
对扩增产物进行纯化和琼脂糖凝胶电泳分析 ,结果表
明 ,扩增产物 ( ds cDNA)主要集中在 0. 5～5 kb之间
(图 2) ,呈明亮的弥散状条带 ,符合文库构建要求。
M. 250 DNA ladder p lus; 1, 2. 纯化的 ds cDNA
图 2　ds cD NA PCR产物纯化后的电泳分析
之后 ,将 ds cDNA、线性化的 pGADT72Rec2质
粒和诱饵质粒 pH is 2. 12dp3共转化酵母菌 Y187感
受态细胞。转化后的酵母细胞悬液按 1 /100稀释后
在 SD /2leu平板上长出 298个克隆 ,依据公式计算
重组效率为 1. 49 ×106 CFU /μg,在 SD /2leu /2trp平
板上长出 103个克隆 ,依据公式计算转化效率为
1. 93 ×105 CFU /μg (按照 1 /100的稀释倍数得出的
数据进行计算 )。
转化产物在 SD /2leu /2trp /2his/20 mM 32AT平
板上共长出 80个候选酵母克隆 ,分别提取质粒并电
转化大肠杆菌 ,之后 ,从大肠杆菌中提取相应质粒并
进行酶切分析。结果表明 ,酶切产物大于 1 kb的质
粒共有 6个 (图 3)。对这 6个质粒用 T7引物进行
测序分析 ,结果表明 ,都有完整的 ORF框 ;然后进行
GenBank /BLAST同源分析 ,发现这 6个序列都有可
能编码结合蛋白。对这 6个质粒进行一对一酵母单
杂交验证试验 , 转化子可在 SD /2leu /2trp /2his/20
mM 32AT平板上生长 ,说明这 6个质粒含有可编码
dba t启动子顺式元件结合蛋白的基因。
M. 250 DNA ladder p lus; 1～6. 阳性克隆质粒的酶切产物
图 3　阳性克隆质粒的酶切分析
3　结论
利用 Clontech公司的酵母单杂交文库构建系统
构建了筛选 dba t启动子顺式元件结合蛋白的酵母
单杂交文库。该文库的重组效率为 1. 49 ×106
CFU /μg,共转化效率为 1. 93 ×105 CFU /μg,与试剂
盒上介绍以及文献报道 [ 9 ]的数量级相当。对文库
的筛选共获得 80个酵母阳性克隆 ,提取质粒并经过
特异限制性内切酶 H ind III酶切、测序和 GenBank /
BLAST同源分析 ,以及一对一酵母单杂交验证试
验 ,最终获得了 6个含有完整 ORF框的阳性克隆 ,
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外源片段的长度分布在 0. 7～1. 5 kb。由此可见 ,所
构建的酵母单杂交文库符合要求 ,满足实验需要。
对以上 6个基因的研究正在进行中 ,以期获得调控
dba t基因表达的转录因子 ,有助于进一步研究 dba t
基因的转录调控机理。
参 考 文 献
1　 W ani MC, Taylor HL, W all ME, et al. J Am Chem Soc, 1971,
93: 2325～2327.
2　 Yu LJ, Lan W Z, Q in WM, et al. ProcessB iochem, 2001, 37: 477
～482.
3　 Mondher J, Abdesslam Z, Yan2W en G, et al. Plant Cell, Tissue
and O rgan Culture, 1996, 46: 59～75.
4　 Jennewein S, W ikdung MR, Chau M, et al. Proc Natl Acad Sci
USA, 2004, 101 (24) : 9149～9154.
5　 W akler K, Croteau R. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97 ( 2 ) :
583～587.
6　 刘智 , 余龙江 , 赵春芳 , 等 . 西北植物学报 , 2005, 11: 2213
～2218.
7　李丽琴 ,付春华 ,赵春芳 ,等. 植物生理学通讯 , 2009, 45 ( 3) : 253
～257.
8　栾慎顺 ,张敬武 ,刘恒贵. 生物技术通报 , 2007, 6: 135～137.
9　邓少林 ,权毅 ,潘显明 ,等. 南方医科大学学报 , 2007, 27 ( 12 ) :
1912～1914.
走好每一步
———青年科学家职业生涯实用指南
〔美〕巴勒斯·韦尔卡姆基金会　霍华德·休斯医学研究所　编
闻朝君　张蕾　译　陈竺　主审
97827203202501729　　  36. 00　　　　　2009年 7月出版
内容简介 :科学事业生涯处于起步阶段的青年生物医学科学家
可能面临诸多挑战 ,需要同时做好研究、教学、管理以及临床工作等
多方面的工作。本书针对这些挑战 ,根据美国众多知名大学教授的
亲身经验 ,在应聘求职、时间管理、实验室管理、申请基金、发表论文
等多方面给青年科学家提出了实用的建议和方法 ,指导他们如何走
好自己科学生涯的每一步 ,从而获得事业的成功。
本书是生物医学领域青年科学家职业生涯的实用指南 ,适合科
研院所及高校相关专业的教学科研人员、研究生以及本科生参考
阅读。
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