全 文 ：生物技术通报
研 究 报 告 刀了口2万C 日N 口乙口 G Y B U 尤L E Z I, N 2 X 9 年 增 刊
高效液相色谱法测定红树林放线菌 D NA 的
(G +C )m ol% 含量
曲直 ,2 洪葵
.中国热带农业科学院生物技术研究所 .海口 571 101 ;海南大学食品学院 ,循州 5717 37)
摘 要: 应用高效液相色讲法浏定了放线菌的(G + C ) m ol % ,并就有关分析条件和 D N A 水解条件进行了优化选择 以
凡比亡 加. .印石 D H S 作为标准菌株 , 实脸室分离鉴定的8 株红树林放线菌作为待测菌株 ,采用流动相为2() ~ t几 K H尹q
竣冲液 (pH 5. 6) :甲醉(体积比90 :10 ),检浏波长为 260 nm ,流速为 I nil / mi n , 柱温为 35 ,分析时间 巧 mi n 时 4 种碱基进行
分离结果表明:标准城基溶液的pH 值 流动相的组成和 pH 值是影响各碱基色讲峰分离和峰形的主要因素 在优化选择的条
件下侧定 ,D N A 城基分 离效果好 ,无杂峰千扰 , 以峰面积计算得到标准菌株凡动币ch ia 石D H 5a 的(G十c )m ol % 为 54 .9694 %
与已经报遗的差异不显著;待侧菌株的(G十C )m ol% 均在菌株所在科或属下的 (G +C) m ol % 范围内;采用酸水解放线菌的D N A
可编姐鉴定时间 ,步赚简明 实脸结果充分显示高效液相色讲法测定放线菌(G十c )m ol % 快速 准确 结果德定 ,是放线菌分类
鉴定的一种可幸方法
关. 询: 高效液相色讲 (G +C )m ol % 分类鉴定
T h e ld en t苗ca ti on of th e G + C C o n ten t o f D N A b y H ig h P erfo rm a n ce
L iq ul d C h ro m a to g ra P h y fo r M a n g ro v e A cti n o m y cete s
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Key wo 山 : 肠 gh perfo rman ee Li明id C hro ma tog口p场(HP LC ) (G + C )mo l% 腼 ono叫
从 C oh n 发现放线菌至今 已有 10 多年的历
史 , 放线菌分类学作为研究放线菌的基础学科 , 已
经由以往的经典分类 化学分类 分子分类发展到
了现在的多相分类 , 从而建立了放线菌分子系统
学 1961 年 W aksm an 的专著 放线菌的属和种分类
鉴定和描述 的出版标志着放线菌分类学的形成
收稿 日期:2(X 拍一03 一02
墓金项目: 国家 86 3 海洋生物资薄开发利用技术 (2(X) 7AA09 24 15) ,国家自然科学基金重点项目一广东联合荃金(U肠3 0 8)
作者简介:曲直(1982一) ,女 ,硕士研究生 ,放线菌的分类鉴定
通讯作者:洪葵 ,女 ,博士 ,博导 ,研究员 ,应用徽生物
2 10 健物技术通橄习勿幼h"o 如盯 2(X 为 年 增 刊
这个时期的放线菌分类可称为经典分类或传统分
类 ,主要的依据是放线菌的形态特征 培养特征及
生理生化特性 从 20 世纪 70 年代开始 ,化学分类
被各国放线菌分类学者所接受 ,化学分类技术和方
法也日趋完善 ,放线菌分类学的研究内容从个体形
态水平深人到细胞化学水平 ,并总结了规律性的结
论 ,建立了放线菌的化学分类体系 化学分类是放
线菌属划分的主要方法之一川主要化学指征包括:
细胞壁化学组分分析 枝菌酸 脂肪酸 磷酸类脂
甲基蔡醛 全细胞蛋白及核搪体蛋白电泳分析等均
可用于属内的分群和鉴定 随着科学技术的快速发
展 ,尤其是分子生物学 分子遗传学以及生物信息
学的发展 ,放线菌分类学研究也从传统的表现水平
跨越到了分子水平 诸如 DN A (G +C )mo l% 含量
D N A 一D NA 体外杂交 165 :R N A 核昔酸序列分析
等分子分类的内容也逐渐成为放线菌分类学中不
可缺少的分类指征
每一种生物的 D N A 均有特定的(G十C )m ol % 含
量 ,不同生物的(G +C )m ol % 含量各不相同 若生物
种间亲缘关系较远 ,则(G +C )m ol % 含量差别较小 ,
反之亦然 由于每一种微生物的 (G十C )m ol % 含量
通常是恒定的 ,不受菌龄 生长条件等各种外界因
素的影响 ,故 (G +C )m ol % 含量测定在微生物分类
鉴定中有着较大的应用价值 ,所以 20 世纪 50 年代
此e 和 Belozers ky 等首先把 (G +C )m ol% 含量作为细
菌鉴定的一个重要遗传指标 20 世纪 60 70 年代
初, 国外对细菌的 (G +C )mo l% 含量进行了大量研
究和报道12一 , Storc k 系统测定了真菌 DN A 的(G +
C )mo l% 含量 , 确定 (G +C )m ol % 含量作为真菌分类
鉴定的遗传学参考标准之一l5] 国内主要从 70 年
代开始对细菌16一81 真菌等微生物的 DN A 的(G +C )
mo l% 含量进行了测定 目前 D NA 的(G +C )m ol % 含
量测定也已广泛用于放线菌的鉴定中 , 测定方法
也不断加以改进 国内外学者先后应用纸层析法
浮力密度法 热解链温度法(Tm )测定 DN A 的(G +
C )m ol % 含量 ,纸层析法是最早测定 (G +C )m ol % 含
t 的方法 , 它是利用层析滤纸上吸附的水作固定
相 , 有机溶剂作流动相 , 不同碱基在两相间分配系
数不同, 因此在滤纸上移动距离不同而得以分离 ,
但该法准确度低 阅 年代初人们开始使用浮力密
度法测定 (G +C )m ol % 含量 , 其原理是:Cs CI 超速
离心时形成密度梯度区带 , DN A 在其中的浮力密
度与其(G +C )m ol % 含量呈正比l9] , 利用公式 Q二1.
6 + 0. 09 8% (G + C ) 即可求 (G +C ) m ol% 含量 , 但
此法需使用超速冷冻离心机作长达科 h 的离心且
CsCI 试剂昂贵 1% 1 年国外学者 M ~ ur J 最先使
用 Tm 法进行 (G +C )m ol % 含量的测定 , 该法也是
比较流行的方法 , 因为它的重复性好 ,但是 Tm 法
是间接的测定方法 ,其精确度没有用高效液相色谱
法直接的测定高 高效液相层析法的主要优点就是
分辨率高于其他的层析 ; 速度快十几分钟可完成 ;
重复性高 ;高效相层析柱可反复使用 ;分析精确度
高
在前人工作的基础上 ,对高效液相色谱法分析
放线菌 (G +C )m ol % 含量的方法进行了摸索 , 找到
了分离分析的较佳条件 ,用此方法对本实验室分离
的 8 株红树林放线菌进行了 (G + C )mo l% 含量的测
定 ,实验结果表明 , D N A 碱基分离效果好 ,无杂峰
干扰 , 通过分析验证所测得的 (G +C ). 01% 含量与
预期值相符 ,且检测速度快 ,因此 ,高效液相色谱法
为直接测定(G +C )m ol % 含量提供了一种快速简洁
而精确的方法 在色谱分析条件摸索的同时 ,也对
DN A 水解的条件进行了实验 , 通常放线菌 (G +C )
m ol % 含量分析时 , DN A 的水解方式采用酶水解 ,本
实验选用了酸水解 ,不仅缩短了分析时间 ,也使鉴
定的步骤简明化
1 材料与方法
1.1 仪器 试剂与材料
戴安 P6 so 高效液相色谱仪 ;涡旋仪(上海青浦
沪西仪器厂 );高速离心机 (Ank e TG L一16G );ZF一I
型三用紫外分光光度仪(上海顾村电光仪器厂)
高抓酸购于天津大茂化学试剂厂 ;甲醉(色谱级)
购于美国 Te di a 公司;标准碱基鸟嗦吟( G) 胞啥
陡(c) 胸腺啥吮(T) 腺嗦吟(A) 均为生化试剂购
于 So lar bio 公司
样品瓶购于美国 A gilent公司 (5183一4534 )
标准菌为 Es 动e力泌 hie coIJ D H S ; 鉴 定菌株
stn争勿功 es sP . 06 13 24 采集文昌后港乡丹场村红
树 林 海 泥 ; S加, 句几少 ces sP . 219808 st脾pto 翻lyces
印. 21 98 20 采集三亚红树林的土壤 ;M cro 川on osp -
2仪玲 年 增 刊 曲直等 :高效液相色谱法测定红树林放线菌 D NA 的(G +C )m ol % 含量 2 1 1
rac eae sp. 211018 届cro bisP ora sp. 21102 0 采集文
昌气树植物海漆的根际土壤;届c拍石询叩阳sP
21 20 30 采集文昌红树植物海芒果的根际土壤 ;械-
~ on osl扣扭 ces e sP . 202 201 采集海南清澜港老 鼠筋根 ;A ssn oa sP . 21 012 1 采集文昌红树植物尖叶卤
蔗的根际土壤
1.2 标准碱基储备液的配制
分别用流动相配制浓度为 l ~ ol / L 的 C, 0. 3
m mo ll L 的 G , 1 m mo ll L 的 T 和 1 m m ol l L 的 A 储
备液(其中 G 应先用数滴磷酸溶解后再用流动相定
容)
1.3 标准碱基混合液的配制
分别准确吸取各碱基储备液 2 耐 混合 ,用 0. 2
m ollL N a0 H 溶液调节 pH 值约 7 左右,再定容至 10
nil ,摇匀即得
1.4 色语条件
色谱柱 :依利特 o D S一 Bp (4.6 m m x25o nu ,
中5卜m );流动相 :20 m m ol lL K H Zp0 4缓冲液(pH 5.6):
甲醇溶液(体积 比 90 :10) ;检测波长:260 lun ;柱温:
35 ;流速:1 耐/m in; 进样量: 20 闪
1.5 D N A 的提取
主要根据 Po 印ieeh & Neum an (19 5 ) 报道的
方法110 ,并做了少量改变 ,具体方案如下 :
1.5.1 将 50 nil 液体培养后的菌液离心得到的菌
丝用无菌水洗涤两次后 ,重新悬浮在 10 耐 的 STE
缓冲液中(含 20 mo llL Tri s H CI, pH7 .5 , 25 m m oll
L ED TA , 75 m mo l/L N aCI) , 加人 4(X) 林l溶菌酶溶
液(终浓度为 Z mg /nil ) , 37 水浴保温 60 一 90 m in
1.5.2 加人 1.2 ml 10% 的 SDS 溶液 , 再加人 2(X)
闪 蛋 白酶 K 溶液 (20 m g/耐) ,轻摇混匀后于 5
水浴保温 2一4 h
1.5.3 加人 4 Inl 5 m ol/L N aCI溶液 , 轻摇混匀后
冷却至室温
1.5. 4 加人 ro 耐 抓仿 , 轻摇混匀后于 20 水浴
保温 30 m in ,于 6 XX) :lm in ,20 离心 15 m in
1.5.5 将上清液转移到一个新的离心管中 ,加人一
倍体积的异丙醇 ,轻摇混合后 ,将沉淀出的 D N A 挑
取到一个新的离心管中 ,用 10 nil 70 % 的乙醉洗涤
两次 ,吹干后重新溶解于 2一3 ml 的花 缓冲液中
1.5.6 加人 RN as e 至 20 林g/m l, 37 水浴保温 30
n In o
1.5 .7 加人一倍体积的抓仿 :异戊醇(241 1) 轻摇混
匀后 , 8 XX) rlm in 离 心 10 m in
1.5.8 将上清液转移到一个新的离心管中 ,加人一
倍体积的异丙醇 ,轻摇混合后 ,将沉淀出的 D NA 挑
取到一个新的离心管中 ,用 10 m l 70% 的乙醉洗涤
两次 ,吹干后装人离心管置于-20 保存
1.6 D NA 水解
用高抓酸 ,沸水浴水解 D NA lh ,高抓酸与 DN A
比例 15 林glm g ,加水 50林l,离心取上清
2 结果与讨论
2.1 检测波长的选择
4 种碱基分子中都具有共扼离域大 二键 ,在紫
外区均有强烈吸收 ,最大吸收波长在 260 nm 左右
故分别在波长 250 254 26() 及 265nm 处测定 ,结果
本文选用 260 run 作为测定波长
2. 2 缓 冲液浓度
分别 在磷 酸盐缓 冲液 浓度 为 s m m ol /L 20
m m ol/L 和 30m m ol/L 进行标准碱基实验 图 l一a 结
果显示 ,在磷酸盐的浓度为 5 m m ol 几 时 ,各色谱峰
峰形欠佳 ;以后随着磷酸盐浓度的加大 ,对保留时
间的影响不太明显 , 在浓度大于 20 m m ol lL 后 ,峰
形均良好 为了不让磷酸盐浓度太高 ,故选用磷酸
盐浓度 20 m m ol/L 为宜
2. 3 缓冲液 pH 值
在 pH 3.6 pH S.2 和 pH 6.2 下考察了用不同 pH
值缓冲液对保留时间及分离情况的影响 结果表
明:虽然 C 和 G 的保留时间随 pH 的增加无显著增
加 , 但 T 和 A 的保留时间受 pH 变化的影响较大 ,
尤其 pH >4. 5 时 A 的保留时间有显著增加 , 当 pH
在 4. 5一6 时 , 4 种碱基能得到很好的分离 , 且总的
分析时间在 15 m in 之内 , 最终选用 pH S.6 的磷酸
盐缓冲液作流动相的组分
2.4 流动相比例
分别选用了缓冲液和甲醇 80/20 85/15 9() 八0
和 951 5 四个比例 图 1一b 和图 1一C 结果表明:若在
缓冲液和甲醉比例为 80/2 O 时 , 4 种碱基无法完全
分开 , 且峰形不好 ; 若在 85/ 15 时 C 和 T 的谱峰无
法分离 ;当比例变为 90 /ro 后 , 4 种碱基均能明显分
离 ,峰形良好 ;如果将二者比例调为 95巧 ,各碱基的
2 12 性物杖术通银忍勿奴 为肋枷盯 B uJ介材冰 2(X 刃 年 增 刊
保留时间明显增长 ,分离度虽然高 ,但色谱峰略有
展宽 ,同时分析周期加长 ,所以采取 o :10 的比例
最佳
结合以上各个指标 ,最终确定 (G +C )mo l% 含量
的分析条件为 20 m ollL K H ZP0 4 缓冲液(pH 5.6):
甲醉(体积比 ,o :10) ,图 1(d )则是该条件下所测定
的标准碱基的 H PI 刃分析图谱 ,用该图谱中的保留
时间作 为 对照 , 分 析标 准菌 Esc he richi a . oli
D H 5a 和 8 株待侧红树林放线菌的 (G +C )mo l% 含
t
2. 5 D N A 水解条件的选择
通常放线菌的 (G +C )m ol % 含量侧定采用核酸
酶水解 DN A , 用核酸酶 Pl 将 DN A 水解成单一的
脱氧核糖核昔酸后,再用碱性磷酸酶除去磷酸残基
,1因为醉的作用较温翻,所需时间较长,试剂选用
较多 ;而采用酸水解 DN A ,只需准备高抓酸 ,沸水
浴 lh 即达到较理想的水解效果 , H PLC 鉴定时也无
杂质峰出现 不过在用酸水解时需注意样品水解液
的 pH 值 ,应和流动相的 pH 相近为 pH 6 左右
2. 6 样品分析
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( d )
配制络滚中含有 Zx1o一, ~ 1胞啥吮(c) ,0.6 xl 0一, ~ 1 鸟吸岭( G) ,Zxl o一, ~ l 脚腺心院(T) 和 Zxl o一, ~ l旅
嗓吟(A ),分析条件(a )为柱沮 35 ,流动相 5 ~ llL KH 护O. 缓冲液 (pH 5.6):甲醉(vlv,如:10);(b )为柱沮 35 ,
流动相 20 ~ llL Kl 护0月级冲液(pH 5.6) :甲醉(vl v, so :20 ); (c) 为柱沮 35 ,流动相 20 ~ llL 朋 护D 月级冲液
(pH 5.6):甲醉(vlv, 85:15);(d)柱沮 35 ,流动相 20 ~ llL KH 尹O4 级冲液(pH 5.6):甲醉(vlv,o :10) ,从左到右依
次出峰顺序为 C , G , T , A
圈 1 标准砚荟的 H户LC 分离圈讼
2 (兀目 年 增 刊 曲直等 :高效液相色谱法测定红树林放线菌 DN A 的(G +C )m ol % 含量 2 13
根据表 1 可以计算出标准碱基的 K 值 , 计算
公式:碱基 K 值二毫摩尔数/碱基峰面积 样品中各
碱基的毫摩尔数就可以依据四种碱基的峰面积和
标准碱基的 K 值得出 计算公式: 碱基的毫摩尔
数二碱基峰面积x标准碱基 K 值
衰 l 标准碱井的 K 值
孩基 标准玻基
溶液浓度
(~ llL)
l
注人, 20 闪 峰面积 A K 值
(xlo~,~ l)
2
28 .262 1
9. 86() 2
35 .0 19 1
5 1.2894
(x10-:)
7. 07 6
6 .08 50
5 .7 111
3 .8卯 4
GC
T 0 .3
A l
以峰面积计算得到标准菌株 E叨石e成五 18 coli
D H 5a 的(G +C )m ol% 含量为 54.9694 % ,与文献值相
差为 2.% 叫 一般认为 ,两株细菌的(G +C )mo l% 含
量差别< 2% 是无意义的 ,含量差别在 2% 一5% ,判
定为同种内不同菌株网;差别在 5% 一15 % ,判定两
株细菌同属不同种 ,差别> 15 % ,判定两株细菌不
同属甚至不同科Is1 由表 2 可以看出 ,我们用 H PLC
测得的 G +C )mo l肠含量与文献值非常接近 ,虽有一
定的误差 ,主要是由于测定方法不同 ,且误差并不
大 , 说 明了在我们所 用条件 下 , H PLC 测定 Es -
ch erichia 01 D H 5a 的(G +C) m ol% 数据可靠
衰 2 H PLC 法洲得的 丑即石e对c石抽 coli D H SQ 喊甚峰面积
及(G +C ) m ol %
碱墓 峰面
积
孩基奄克分
子数(~ 1)
(G +C) 枷 % 文献 t 值
值
3 .5562
1.5238
0 .62 2 8
3 .5387
科 .% 只 % 52 % 2. 96 94
25403晰.750.210AGCT
由碱基的毫摩尔数可以得到 8 株红树林放线
菌 D N A 的 (G +c) m ol % 含量 ,计算结果见表 3 链霉
菌属的(G 十 c) mo l肠含量范围为 69 % 一78 % ;小单抱
菌科为 69% 一73 % ; 阿萨诺氏菌属为 71 .1% 一71 .5%
及小双抱菌属为 71 .3% 一73 % 13 所以测定的 8 株
待测菌的 D N A (G +C) m ol % 含量结果均在该菌所
在科或属下的(e +e) mo l% 范围内 (e +C) m ol% 结
果的准确性 , 很大程度上依赖于样品 D N A 的高纯
度和高抓酸水解 DN A 的适量 , 否则将明显影响实
验结果 R N A 中含有 D NA 的 3 种碱基 , 要求 D N A
样品中不能有 R N A 污染 , 否则影响 DN A (G 十C)
m ol % 含量的准确性 同时蛋白和盐对色谱柱有害,
建议 D N A 样品去除蛋白 根据 D NA 的最大吸收峰
在 Zo lun , 杂质和蛋白质的吸收峰分别在 23 0 nm
和 28 0 lun ,可用分光光度计测定吸光度检查放线菌
D NA 的纯度114]
3 结论
放线菌比细菌相对难以提取其 D NA , 所以尽
管测定时需要的 D NA 量很低 , 但为了操作的方便,
宜从 5 9 左右湿菌中提取和纯化 D N A
H pLC 法检测 (G +c) m ol % 含量的最大优点是结
果稳定可靠 , 但必要的前提是 DN A 必须高度纯化,
否则将明显影响试验结果
样品水解液和流动相应控制其 pH 值 , 即使选
取其他流动相组成测定 (G +C) m ol % 含量也要采取
合适的 pH 值和比例 ,尽可能无杂峰 峰型良好和
分析时间适中
放线菌的 (G +C )mo l% 含量在 50% 一79% 之间
可见 , 放线菌的 (G +C )m ol % 含量变化最多不超过
30 % 要用 30 % 来区分成千上万的菌种显然是困难
的 所以 (G +C )m ol% 含量在分类中应用受到很大
限制 但是 (G +C )m ol % 含量在不用生物种都是比
较恒定的 因此它确实可以作为诸多分类指征中不
可缺少的一个 (G +C) mo l% 含量测定主要作用在于
否定, 即(G +C) mo l% 含量不同的两个菌株 , 可肯定
回答不是同种放线菌, 但 (G +c) m ol % 含量相同的
放线菌 , 不能武断地认为是相同或相似的放线菌 ,
因为(G +c) m ol % 含量虽相同, 其碱基排列顺序(遗
传密码)不一定相同[l5 l, 尚需结合其他分类指标 总
之 ,选择适当的 D NA 水解条件 ,调节水解液的 pH
值 ,并选用合适的色谱分析条件进行高效液相色谱
分析 ,从而使测定 D NA 碱基组成具有直接 准确
灵敏 快速 稳定 可靠的优点
2 14 性物技术通稚习勿扭动彻甸盯 B u肠成. 2(X 拍 年 增 刊
衰3 H PLc 法洲得的8 株分离ON A 砚甚峰面积及(G +C ) m d %
苗株
编号
165 rD N A 侧序后
所在的科或属
峰面积 喊墓奄克分子数(血朋1 (G +C)
山 1%
伪 1324
2 19808
2 19820
202 20 1
2 11 0 18
2 10 12 1
2 1102 0
21 20 30
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