全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
漆酶及其应用的研究进展
王祎宁 赵国柱 谢响明 邸晓亮
(北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083 )
摘 要: 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶, 白腐真菌普遍能分泌该酶。有氧条件下, 漆酶能催化多种高分子化合物降解,
利用该性质漆酶已经广泛应用于生物制浆、污染物生物降解、生物漂白等领域。介绍了目前漆酶在农业和工业各个领域中的
应用。
关键词: 漆酶 应用 环境保护
Advances in Laccase and ItsApplications
W angY in ing Zhao Guozhu X ieX iangm ing DiX iaoliang
(College of B io log ical Sciences and B iotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083)
Abstrac:t Laccase as a kind o f copperconta ined po lypheno l ox idase secreted byw hite rot fung, can degradem any kinds of mac
romo lecu la r compound in aerob ic env ironm ent Laccase have been app lied in many areas such as pulp, b iodegrading, b iobleach ingThis
paper fo cused on recent reports on laccase and its applications in va rious ag ricu ltura l and industria l fie lds
Key words: Laccase App lications Env ironm enta l protec tion
收稿日期: 20090211
基金项目:国家自然科学基金 ( 30700647 )
作者简介:王祎宁 ( 1983) ,男,硕士研究生,研究方向:资源与环境微生物; Em ai:l hen ry621@ s ina com
通讯作者:赵国柱,男,副教授, Em ai:l zhaogz@ im. ac. cn;谢响明,男,教授, Em ai:l x iangm ingx@ s ina com cn
漆酶 ( Laccase, EC 11032)是一种多酚氧化
酶,属于蓝色氧化酶家族, 是重要的木质纤维 ( ligno
ce llu lose)降解酶之一, 最初发现于漆树漆液中, 随
后发现某些高等真菌也能分泌该酶 [ 1]。漆酶能催
化降解多种芳香族化合物特别是酚类, 是一种天然
环保型酵素 [ 2 ]。利用漆酶对木质纤维及一些高分
子化合物的降解作用,进行合理的开发利用,可减少
化学药品的使用量,降低生产成本和保护环境。
1 漆酶的基础研究
11 漆酶的来源
漆酶 1883年由日本人吉田首次在漆树漆液里
发现, 随后人们发现某些高等真菌也能分泌这种酶,
这些蛋白由于来源不同, 表观分子量也有很大的差
异, 59~ 390 kD。部分菌株产生的漆酶由数种同工
酶组成,糖蛋白含糖量 10% ~ 80% ,都为单体酶,酶
分子中一般都含有 4个铜原子。适宜反应温度较
低,酸性 pH催化效率较高, 具有底物专一性。分泌
漆酶的主要真菌有黄孢原毛平革菌、彩绒革盖菌、变
色栓菌、射脉菌、凤尾菇、香菇等, 这些真菌都属于担
子菌门 [ 3]。漆酶在植物中主要起到合成木质素的
作用,而真菌所分泌的漆酶作用恰恰相反,主要起降
解木质素的作用, 因此真菌漆酶对木质素的降解作
用使漆酶具有广泛的潜在应用价值。
12 漆酶的检测
目前最常用的漆酶检测方法是利用漆酶和特定
物质反应,在短时间内产生颜色变化的直观方法,多
用滴定法及与 PDA培养基连用的变色圈反应法。
例如,漆酶可以与丁香醛连氮 [ 4] , 愈创木酚 [ 5] , 萘
酚 [ 6] , 焦性没食子酸 [ 7 ] ,鞣酸 [ 3]等物质发生反应, 并
快速产生特定颜色的物质, 根据漆酶与这些物质的
特定变色反应确定菌种是否产生漆酶,并且可以根
据在相同时间内产生的颜色深浅及变色圈大小初步
估计漆酶的产量。
121 漆酶与丁香醛连氮反应 漆酶在与丁香醛
连氮反应时 20m in内可以使丁香醛连氮变蓝紫色,
该方法灵敏度高、反应迅速、色效明显,相同时间内
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
显色越快、色度越深产漆酶量越高。
122 漆酶与愈创木酚反应 漆酶与愈创木酚反
应可以使愈创木酚生成红色至棕色的物质, 该物质
一般在 30m in内产生,另外可以利用愈创木酚 PDA
平板对比变色圈大小的方法确定漆酶产量。
123 漆酶与 萘酚反应 通常使用 萘酚 PDA
平板变色圈实验来检测漆酶的存在, 所产生的紫色
物质, 配置终浓度为 5 mmo l/L的 萘酚 PDA平板
即可检测漆酶。
124 Bavendamn氏显色反应 配置终浓度为 04
mmo l /L的焦性没食子酸或鞣酸 PDA平板进行变色
圈反应,产生棕褐色颜色物质的为产漆酶菌株。以
上为目前较常用的准确、快速检测漆酶方法。笔者
推荐分别使用 2种以上不同方法同时鉴定产漆酶菌
株,结果更加准确。
13 漆酶的发酵条件
K irk等 [ 8]通过对漆酶的大量研究得到产漆酶
真菌在发酵过程中的最佳产酶条件, 此研究确定的
基本培养基已被国内科研工作者广泛使用。另外,
研究还发现漆酶发酵过程中氮源的种类并不能显著
影响漆酶产量,而氮源用量才是影响漆酶产量的关
键因子之一, 限氮培养可以显著提高漆酶的产
量 [ 9]。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,因此 Cu2+对
漆酶的合成及其活性是至关重要, 且结构和木质素
相似的低分子芳香族化合物或者木质素降解后的碎
片也可诱导漆酶的产生并且显著提高漆酶的产量,
主要有愈创木酚、苯甲醇、黎芦醇、香草酸和吐温等。
限制碳含量也可以显著提高漆酶产量 [ 10]。法国人
Galliano等 [ 11]通过比较固体和液体培养基,用 14 C放
射性标记法测得固体培养基中木质素降解比液体培
养基中显著,产漆酶量高 5倍。
14 漆酶的基因克隆
漆酶基因已经从众多木质素降解真菌和一些非
木质素降解真菌以及细菌和植物中克隆并进行了性
质分析。1988年 Frohman等 [ 12]首次利用快速扩增
cDNA技术从白腐菌 (P leurotus ostreatus )中克隆得
到漆酶基因,后来的研究者多用 RTPCR技术来获
得漆酶基因。目前, 已有几十种不同来源漆酶基因
得到克隆。通过基因序列测序并结合生物信息学研
究发现真菌漆酶整体的序列同源性并不高,但是,不
同酶蛋白中结合铜原子区域的保守性相当高。研究
漆酶编码基因及漆酶基因的表达调控机制, 有助于
阐明不同来源的漆酶在物种发育进程中所起的作
用, 同时还有助于揭示菌种进化过程和菌种间的亲
缘关系。
141 漆酶的基因表达 通过发酵使真菌分泌产
生的漆酶蛋白含量较低, 实现漆酶基因的高表达是
一个重要目的,因此对漆酶基因的克隆和序列分析
并通过异源高效表达一直是科学家近年的研究热
点。已经有很多基因在不同受体菌中得到了表达。
1990年 Kojima[ 13]将 Coriolus hirsutus的漆酶基因进行
了克隆并首次成功在酵母系统 Scerevisiae中得到
表达。
2 漆酶的应用研究
21 制浆漂白
制浆过程是将植物纤维素从木质素的中分离出
来,这就必须去除纸浆中的木质素 [ 14 ]。生物制浆主
要是依靠微生物发酵产生的各种酶去除木质素从而
达到降低化学药剂使用、环保、降低生产成本等目
的。漆酶可以选择性地降解木质素, 并消除机械制
浆工艺的弊端,使生产在常温、常压的温和条件下进
行, 并能节约设备和能耗 [ 15] ,缩短纸浆生产周期, 降
低生产成本。纸浆中的有色物质主要来自木质素的
芳香化合物,研究发现木聚糖酶仅起助漂作用,不能
真正替代化学漂剂。所以近 10多年来,直接用木素
降解酶进行生物漂白已引起人们的广泛关注。漆酶
作为一种主要纸浆漂白的木质素降解酶,应用于纸
浆漂白的研究是最晚的, 但研究最多、进展最显著,
成为最具潜在应用前景的酶 [ 16 ]。目前国外已有很
多企业在制浆和纸浆漂白过程中引入漆酶, 并取得
了良好的生产效果,国内也有部分企业开始研发相
关生产技术。
22 生物燃料
能源问题已经成为国内外讨论的重点话题,目前
广泛应用的石油、天然气、煤炭为非可再生能源,无论
储量多丰富总有枯竭的一天。绿色植物占地球陆地
生物量的 95%以上, 对绿色植物合理利用是解决能
源问题的有效途径。植物中的木质素,纤维素和半纤
维素分别占植物干重的比率为 15%~ 20%, 45%和
20%。其中木质素的降解及利用最为困难,要彻底降
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2009年第 5期 王祎宁等:漆酶及其应用的研究进展
解并利用这些生物质资源首先必须解决的问题就是
木质素的降解问题。利用漆酶对木质素的分解作用
将木质素分解为小分子物质从而进行生物发酵,产生
生物酒精等新能源。有研究表明彩绒革盖菌漆酶降
解小麦秸秆木质素的能力较强 [ 17] , 20 d可以使小麦
秸秆失重 2985%、木质素含量降低 1845%。
23 污染物的降解
随着人类经济的发展,越来越多的污染物正侵
蚀着人们赖以生存的环境, 对污染物的治理迫在眉
睫。例如, 石油及其产品的广泛使用, 特别是其开
采、运输等环节过程中产生严重的污染,其污染的治
理及这些污染物的回收再利用成为急需解决的问
题。近年来木质素已广泛运用于石油钻井泥浆中,
该泥浆中含有大量高分子化合物, 对地层土壤污染
较严重。另外,石油的形成与木质素有密切关系,从
化学组成上看石油中许多结构单元与木质素组成相
类似, 木质素生物降解过程与石油利用以及污染物
的清除有必然的联系 [ 18]。DDT作为上世纪普遍使
用的一种高效杀虫剂,化学性质稳定,常温下不能分
解,但土壤中残留的 DDT对人畜的生命安全存在着
极大的隐患。目前, 已经有研究表明漆酶可以有效
地降解修复土壤中残留的 DDT[ 19]。
24 绿色有机物合成
漆酶除了可以有效降解大分子有机物质外,其
合成有机物的能力也很强。一部分漆酶具有很强的
生物合成能力,可以把两种小分子化合物高效聚合
成新的大分子化合物。利用漆这种能力可以在常温
下生产高分子聚合物, 比目前高温高压的化学催化
方法大大节约能源及成本。因此, 利用漆酶进行如
抗生素、氨基酸、抗氧化物等大分子化合物的生产,
是一种绿色的环境友好型的新方法 [ 20 ]。
25 食品工业中的应用
漆酶在食品工业中也已普遍应用,增加葡萄酒
的稳定性是漆酶在食品工业中的一个主要应用。漆
酶的加入可以很好的提高葡萄酒的稳定性, 从而减
少二氧化硫的使用量 [ 21 ]。另外, 漆酶在果汁生产中
也能起到很好的作用, 由于酚类的过度氧化会影响
产品的质量,而漆酶能除去果汁中的儿茶素等酚类
物质。因此,不需要额外增加澄清剂就能够产品稳
定澄清 [ 22]。
26 生物传感器
目前依据漆酶的催化特性已经开发出漆酶电
极 [ 23] , 它具有众多优点, 如测量范围宽、准确度高、
稳定性好等。漆酶和葡萄糖脱氢酶构建的双酶电极
能够检测到纳摩尔级和皮摩尔级的肾上腺素。
27 生物检测
20世纪 90年代初, 漆酶作为标记酶首次出现
在免疫检测中 [ 24]。以漆酶为标记酶, 其抗原漆酶
的接合灵敏度有很大提高, 同时对培养基中变价金
属离子的含量具有更低的敏感性。
3 展望
越来越多地研究开始转向阐述漆酶的作用机
理,部分漆酶的蛋白质结构已被确定 [ 25]。随着分子
生物学方法的快速发展及漆酶研究的不断深入, 必
将有更多的漆酶蛋白的结构及作用机理被阐明。另
外, 漆酶固定化方法的研究对于延长漆酶的稳定性、
延长作用时间起到至关重要的作用。这些研究都为
更深入的进行漆酶的应用研究打下坚实的基础。
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