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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
草莓 G6PDH基因片段的克隆与序列分析
袁明英  汤浩茹  于定群  张勇
(四川农业大学园艺学院,雅安 625014 )
  摘  要:  根据不同植物 G6PDH同源基因的保守区设计合成简并引物, 采用 PCR技术从草莓基因组中分离出一个 DNA
片段并克隆到 pMD18
T载体中。序列测定和分析表明, 该片段长 717 bp, 与拟南芥等植物的 G6PDH 基因的核酸序列具有
83% - 87%的同源性。结果表明,克隆的片段为草莓 G6PDH 基因片段。
关键词:  草莓  G6PDH 基因  简并引物  克隆  序列分析
Molecular Cloning and Sequence Analysis of G6PDH Gene
from Strawberry
YuanM ingying TangH aoru Yu D ingqun ZhangYong
(College ofH orticulture, Sichuan Agriculture University, Ya an 625014)
  Abstrac:t  A DNA fragm ent w as amp lified from geome o fPoncirus triforliata by po lyme rase chain reaction us ing a pair of prim ers
designed from the conserved sequences of repo rted G6PDH genes, and cloned in to the vector pMD18
T. Sequence m easurem ent and
analysis showed that the nucleo tide acid sequence o f the c loned 717 bp fragm entw ere 83% - 87% iden tica l to theA rabidop s is G6PDH
genes respective ly. These resu lt indicated tha t a strawberry G6PDH gene fragm ent was obta ined in this study.
Key words:  Fragaria ! ananassa G6PDH gene Degenera te pr im ers C lon ing Sequence analysis
收稿日期: 2010
05
21
基金项目:四川省教育厅重点项目 ( 09ZB050) ,四川农业大学 ∀校级大学生创新性实验计划 #经费 ( 00309203)
作者简介:袁明英,女,主要从事生物技术在果树上的应用研究; E
m ai:l yingz ibeibe@i qq. com
通讯作者:汤浩茹,教授,博士, E
m ai:l h tang@ sicau. edu. cn
低温逆境是影响植物生长发育和分布的主要因
素之一 [ 1] ,每年因冻害或冷害造成的作物特别是园
艺植物的减产和品质下降是目前园艺植物生产中亟
待解决的一大难题。由于植物的抗寒性状一般受多
基因控制,且与品质优劣性状紧密连锁,采用常规的
育种方法来提高植物抗寒性十分困难, 难以获得抗
寒性强的优良新品种。随着分子生物学的发展,通
过基因工程手段为改良植物的抗逆性开辟了新途
径,但高效抗逆基因的分离与克隆成为限制植物抗
逆基因工程的主要因素。
植物戊糖磷酸途径已被证明与植物的生长发育
和对多种环境胁迫的应答有关 [ 2 ]。戊糖磷酸途径
( pentose phosphate pathw ay, PPP)是植物体中糖代谢
的重要途径,其主要功能是产生供生物合成所需的
还原力 NADPH 以及核酸合成的戊糖 ( W ood,
1986)
[ 3]。完整的 PPP发生在植物的质体中, 但在
胞质中发现葡萄糖
6
磷酸脱氢酶 ( g lucose
6
phos

phate dehydrogenase, G6PDH, EC 1. 1. 1. 49) 是戊糖
磷酸途径的关键性调控酶, 是催化 6
磷酸葡萄糖脱
氢酶 PPP途径的限速步骤 [ 4 ]。目前已在紫花苜
蓿 [ 5]、黑麦草 [ 6]、香蕉 [ 7 ]、毛白杨 [ 8 ]和大豆 [ 9]等少数
几种植物的低温锻炼中发现了 G6PDH 活性的提
高, 可能与植物抗冻性的提高有相关, 但有关
G6PDH的结构与作用机制及其与植物抗冻性的关
系至今未见报道。
为丰富植物抗逆基因资源,本研究拟采用 PCR
技术从低温锻炼的草莓中分离克隆 G6PDH基因片
段, 并利用生物信息学手段对该基因片段进行结构
分析及功能预测, 为进一步利用该基因改良某些有
经济价值的农作物和园艺作物的抗冻性奠定重要的
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 10期
基础, 具有一定的应用价值和现实意义。
1 材料与方法
1. 1 材料
草莓幼叶取自四川农业大学园艺植物生物技术
实验室离体保存的草莓栽培品种 ∃丰香 % (Fragaria !
ananassa cv. Toyonaka)。
大肠杆菌 JM 109由本实验室保存。 pMD18
T
V ector购自宝生物工程 (大连 )有限公司;琼脂糖凝胶
DNA回收试剂盒购自天根生化科技 (北京 )有限
公司。
1. 2 基因组 DNA的提取与引物设计
基因组 DNA的提取参照张勇 [ 10]的方法进行。
根据 GenBank中登录的其它物种 G6PDH基因的氨基
酸序列, 利用 CODEHOP[ 11] ( Consensus Degenerate
Hybrid O ligonucleo tide Primers)在线软件程序化进行
同源比对 [ 12] ,得到高度保守的连续氨基酸区域后设
计一对简并引物, 上游引物: 5
ACAGAATCGATCAC

TACCTGggnaargaryt
3 ;下游引物: 5
GGCACATCCTT

GAACTGAACTckdaty tcngc
3 ,引物由上海英骏生物技
术有限公司合成。
1. 3 PCR扩增
PCR反应体系为 25
L 反应体系: ddH2O
8. 5
L, M ix 12. 5
L, cDNA 2
L, 上下游引物各 1

L。采用热启动降落 PCR扩增目的片段。扩增程
序:预变性 94& 3m in; 94& 1 m in, 60& 1m in, 72&
1 m in;然后每循环退火温度降低 1& , 反应 10个循
环;再按 94& 1m in, 50& 1m in, 72& 1 m in反应 30
个循环;最后 72& 延伸 10 m in, 15& 保存。扩增结
束后取 5
L扩增产物,以 200 V电压在 1. 0%琼脂
糖 0. 5 !TBE电泳缓冲液中电泳。
1. 4 PCR产物的克隆、测序与分析
PCR产物经 1. 0%琼脂糖电泳分析后, 按照琼
脂糖凝胶 DNA回收试剂盒说明回收目的片段, 回
收 PCR产物以 pMD18
T V ector为载体, 16& 连接过
夜,然后转化到大肠杆菌 JM 109感受态细胞, 在加
Amp的 LB平板上选择培养,挑取白斑单菌落培养,
提取质粒进行酶切鉴定和菌液 PCR鉴定。鉴定后
的菌液送上海生物工程公司测序。将测序得到的片
段序列登陆 NCB I进行 B last验证和检索 GenBank
进行同源性比对。
2结果与分析
2. 1 PCR产物的扩增与克隆
以草莓基因组 DNA为模板,用所设计的一对引
物进行 PCR扩增,扩增结果见图 1,扩增所得到的基
因片段约在 700- 800 bp之间,与预期的扩增片段的
大小相符。将经回收纯化的产物与 pMD18
T Vector
载体连接并转化大肠杆菌 JM 109感受态细胞,将筛选
出的阳性克隆送上海生物工程公司进行测序。
图 1 PCR扩增结果
2. 2 基因序列与同源性分析
测定重组质粒中插入片段的序列 ,结果 (图 2)
表明所克隆的基因片段长为 717 bp。 B last检索结
果表明,该片段与其它植物葡萄糖
6
磷酸基因相应
的片段具有较高的同源性, 初步表明所扩增的片段
为草莓 G6PDH基因片段。
在 GenBank中进一步进行 B lastx同源性比
对, 结果 (表 1)表明, 本研究克隆的草莓 G 6PDH
基因片段与蓖麻 G 6PDH ( XM 002514831. 1)的同
源性达到了 87% , 比对分值达 343; 与杨毛果
( XM 002297818. 1)和白桦 ( A J279688. 1)的同源
性均为 85% , 比对分值分别为 313和 268; 与拟
南芥 ( X84229. 1 )和马铃薯 ( AB061255. 1 )的同
源性也达到了 83%。
3 讨论
葡萄糖
6
磷酸脱氢酶是磷酸戊糖途径的关键
性调控限速酶,其主要功能是为脂肪酸合成、氮还原
和谷胱甘肽等生物分子合成提供还原力 NADPH,也
为核酸合成提供戊糖;此外, 还参加非生物逆境胁迫
应答反应 [ 13]。可见, G6PDH 在植物的生长发育过
程中发挥着非常重要的作用。
136
2010年第 10期 袁明英等 :草莓 G6PDH基因片段的克隆与序列分析
图 2 葡萄糖
6
磷酸脱氢酶片段测序结果
表 1 Blastx检索 GenBank同源性结果
 G enB ank登录号 比对基因 分值 期望值 同源性 (% )
 XM002514831. 1  R icinus commun isG6PDH 343 6 e
91 241 /275
 XM002297818. 1  P opu lu s trich ocarpa G6PDH 313 1 e
81 235 /276
 X99405. 1  N icotiana ta bacum G6PDH 311 4 e
81 235 /277
 AB061255. 1  Solanum tu berosum G6PDH 304 5e
79 236 /281
 X84229. 1  Arabidopsis thaliana G6PDH 293 1e
75 230 /27
 A J279688. 1  B etula pendu la G6PDH 268 4 e
68 199 /233
由于氨基酸简并性问题, 所设计的引物通常
由于简并性过高, 导致有效引物利用率过低,
PCR产物非特异性增高 [ 14 ] , 所以引物设计是简
并 PCR的关键环节。本研究利用 CODEHOP 设
计的简并引物, 引物 3 端为核心简并区, 5 端为
非简并性夹板结构, 5 端夹板结构是根据密码子
偏向性设计的一致性序列, 它最大程度地预测了
保守性氨基酸的编码序列, 既减少了引物的简并
度, 又保证了 PCR产物的特异性 [ 15 ] , 对于克隆未
知基因家族片段是非常有效的。使用简并引物
扩增存在着一定程度的简并性, 所以应该多挑取
一些单克隆进行测序, 基因序列和翻译的氨基酸
序列可能不尽相同, 便于发现并分析比较不同基
因家族的序列特征。
本研究采用 CODEHOP设计的简并引物进行
PCR扩增,得到大小为 717 bp特异性的 PCR产物,与
预测的片段大小基本一致。进一步的分析结果表明,
试验获得的目的基因片段与蓖麻、杨毛果、烟草等植
物的 G6PDH家族基因的保守区具有 83% - 87%的
同源性。本试验用 CODEHOP设计简并引物,再结合
Touchdown PCR和高引物浓度能较好地扩增目的片
段,减少非特异片段的扩增。另外, 本研究从草莓
(F ragaria ! ananassa cv. Toyonaka)基因组克隆出的
葡萄糖
6
磷酸脱氢酶基因部分片段, 为分离葡萄糖

6
磷酸脱氢酶全基因提供了可能。该 DNA片段的成
功克隆为进一步利用该基因改良某些有经济价值的
农作物和园艺作物的抗冻性奠定重要的基础,具有一
定的应用价值和现实意义。
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