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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
MXR1 基因对毕赤酵母工程菌代谢调控的影响
袁围 叶燕锐 林影
(华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510000)
摘 要: 为了研究毕赤酵母中转录因子 Mxr1p在毕赤酵母代谢调控中所起的作用，构建一株以南极假丝酵母脂肪酶 B
基因(CALB)作为报告基因，MXR1 基因完全缺失的毕赤酵母基因工程菌株。将重组质粒 pPIC9K-CALB转化毕赤酵母 GS115，
利用三丁酸甘油酯平板筛选得到分泌表达 CALB的重组菌 GS115 /pPIC9K-CALB。通过重叠延伸 PCR方法获得一段中间含有
博来霉素抗性基因 sh ble，两翼大约各有 1 200 bp与毕赤酵母 MXR1 基因上下游同源的基因片段，将此片段用氯化锂法转化
毕赤酵母细胞 GS115 /pPIC9K-CALB后，利用博来霉素抗性及 CALB酶活力丧失双重筛选的方法得到一株 MXR1 基因完全缺
失的毕赤酵母基因工程菌株。该菌株在以甲醇为唯一碳源的培养基中不生长，在以乙醇、葡萄糖或者甘油为唯一碳源的培养
基中生长缓慢。结果表明转录 Mxr1p因子在毕赤酵母中的多条代谢途径中起着关键性的作用，主要涉及甲醇、乙醇、甘油和
葡萄糖等代谢途径。
关键词: 毕赤酵母 代谢调控 基因敲除 转录因子 Mxr1p 南极假丝酵母 脂肪酶 B
The Effect of MXR1 Gene on Metabolic Regulation in Pichia pastoris
Yuan Wei Ye Yanrui Lin Ying
(School of Bioscience ＆ Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510000)
Abstract: To investigate the effect of transcriptional factor Mxr1p on metabolism regulation in P． pastoris，we constructed a recom-
binant strain which was knocked out the gene of MXR1 with Candida antarctica Lipase B (CALB)as a report gene，then transformed P．
pastoris GS115 using plasmid pPIC9K-CALB，obtained recombinant strain GS115 /pPIC9K-CALB by screening with Butanoic acid，1，2，
3-propanetriyl ester as substrate． A large fragment was obtained by connecting the gene sequence of the upper stream and lower stream
of MXR1，and the gene sequence of sh ble gene using overlap extension PCR was transformed into P． pastoris GS115 /pPIC9K-CALB by
LiAc method，then the transformants were selected through the resistance of zeocin and the enzyme activity of CALB． A transformant
with a characteristic of litter growth using methanol as sole carbon source and low growth using glycerol，glucose，alcohol as sole carbon
source was obtained． The study indicated that Mxr1p may play a key role in many metabolism pathways，including methanol metabolism，
glycerol metabolism，glucose metabolism and ethanol metabolism．
Key words: P． pastoris Metabolism regulation Gene knock-out Transcription factor Mxr1p Candida antarctica Lipase B
收稿日期:2011-04-18
作者简介:袁围，男，硕士，研究方向:毕赤酵母代谢调控;E-mail:yuan． wei05@ mail． scut． edu． cn
通讯作者:林影，女，教授，博士生导师，研究方向:酶学与酶工程;E-mail:feylin@ scut． edu． cn
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是
目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的主要
工具之一［1，2］。目前已经有超过 600 个目的蛋白
在毕赤酵母中表达［3］。巴斯德毕赤酵母是一种嗜
甲基酵母，可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培
养基中快速生长，但是目前其甲醇调控机制尚未
清楚。
在毕赤酵母中，甲醇代谢调控中一个由 MXR1
基因所编码的关键转录因子 Mxr1p(甲醇表达调控
因子 1)已经被鉴定［4］，MXR1 编码的转录因子
Mxr1p与酿酒酵母中的一个激活 ADR1 基因(乙醇
脱氢酶)编码的转录因子 Adr1p 在很多功能上具有
相似性。敲除转录因子 Adr1p导致酿酒酵母包括油
酸、甘油、乙醇和葡萄糖等多条代谢途径受到影
响［4，5］。同时，Mxr1p与 Adr1p在结构上也具有较大
的相似性，它们在靠近 N 端的 70 个氨基酸区域内
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都含有两个 C2H2型的锌指结构域，在这个结构域内
它们的氨基酸序列 70%相同，83%是相似的。而且
在它们内部都含有 3 个潜在的磷酸化位点。由
ADR1 基因编码的 Adr1p作为一个在酿酒细胞中的
多条代谢途径起重要调控作用的转录因子目前得到
广泛的研究，包括它结合并激活 PIP2(过氧化物酶
体诱导途径)的启动子，同时它也能被其他因子
激活［6，7］。
目前的研究进展表明，Mxr1p 与乙醇氧化酶基
因(AOX1)以及甲醇代谢途径中的几个关键酶基因
的启动子特异性结合［8，9］，但是它在甘油、乙醇以及
乙醇代谢调控中如何起作用还不清楚。为了确定
Mxr1p影响甘油、乙醇和葡萄糖代谢等途径中哪些
关键酶基因的表达，进一步了解 Mxr1p 在各代谢途
径中的作用，需要获得敲除 Mxr1p 转录因子的突变
株，进行代谢调控研究。
本试验利用抗性基因和报道脂肪酶基因沉默
双重筛选的方法获得敲除突变体。主要包括通过
重叠 PCR 技术［10］获得一段带有博来霉素抗性筛
选标记和酵母同源区域的目的基因，转化后使筛
选标记与酵母 MXR1 基因发生同源重组，利用博
来霉素筛选出完全敲除 MXR1 基因的毕赤酵母突
变株，并研究突变株在以甘油、甲醇、葡萄糖和乙
醇为唯一碳源的培养基中细胞生长状态，为进一
步深入研究 MXR1 对毕赤酵母甘油、乙醇和葡糖
糖代谢途径的影响奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 菌株与质粒 毕赤酵母 GS115 及克隆用的
载体 pPICZA和 pPIC9K 购自 Invitrogen 公司;大肠
杆菌 Top10，质粒 pICAS-CALB［11］由本实验 室
保存。
1． 1． 2 培养基 YPD培养基:1% 酵母提取物、2%
蛋白胨、2%葡萄糖。115℃灭菌 20 min，用于酵母菌
的活化和培养。MD 培养基:0． 67%无氨基酸酵母
氮源、2%葡萄糖、1%蛋白胨、2%琼脂用于组氨酸营
养缺陷型筛选。YPDS:1%酵母提取物、2%蛋白胨、
2%葡萄糖，0． 1 mol /L 山梨醇，用于基因敲除后筛
选。MM培养基的组成和配制参见 Invitrogen 公司
(美国)毕赤酵母操作手册，115℃灭菌 20 min，用于
敲除后的表型鉴定。
YND培养基:0． 67%无氨基酸酵母氮源、0． 4%
葡萄糖。YNM培养基:0． 67%无氨基酸酵母氮源、
0． 5%甲醇。YNG 培养基:0． 67%无氨基酸酵母氮
源、0． 5%甘油。YNE 培养基:0． 67%无氨基酸酵母
氮源、0． 5%乙醇。115℃灭菌 20 min 用于敲除后生
长情况的研究。
1． 1． 3 试剂与工程酶 Ex Taq 聚合酶，250 bp
DNA Ladder Marker、DL15000 DNA Marker，限制性
内切酶 EcoR I、Not Ⅰ、Sal Ⅰ购自大连宝生物工程
公司;基因组抽提试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒、
胶回收试剂盒等购于 Qiagen公司(美国)。无氨基
酸酵母氮源和蛋白胨购自 Difco 公司(美国) ;酵母
提取物购自 Oxoid 公司(英国)。对硝基苯酚丁酸
酯(pNPB)购于Sigma公司(美国) ，葡萄糖购自天
津市大茂化工有限公司(中国)。其他试剂均为分
析纯。
1． 1． 4 仪器与设备 PCR 扩增仪，Eppendorf Mas-
tercycler gradien;全自动凝胶成像系统，AlphaImager
HP;蛋白电泳系统，Biorad MiniProtein;台式高速离
心机，Eppendorf 5810;紫外可见分光光度，Varian
Cary 300;恒温水浴系统，HMT200。
1． 2 方法
1． 2． 1 PCR扩增 为了将 CALB 基因在毕赤酵母
中实现表达，对酵母表达载体 pPIC9K 的限制性酶
切位点分析，并参考质粒 pICAS-CALB 测序结果设
计特异性引 5CALB 和 3CALB(表 1)。为了在重
组菌中敲除 MXR1 基因，设计了 3 对引物，分别为
L1 和 L2，Z1 和 Z2，L3 和 L4。为了通过 PCR 验证
敲除是否成功，设计了引物 L5 和 L6。其中 L1 和
L2 参照 NCBI 公布的 MXR1 上游序列设计，扩增
后的片段大约有 1 200 bp;L3 和 L4 参照 MXR1 下
游序列设计，扩增出来的片段大约有 1 200 bp;Z1
和 Z2 参照 pPICZA 载体上的 sh ble 序列以及
MXR1 上下游序列设计，扩增出的片段约有 1 100
bp;L5 和 L6 分别在 L1 上游 100 bp 处，L4 下游
100 bp设计;L2 的 5端和 Z1 的 5端有 22 bp特异
互补，Z2 的 5端和 L3 的 5端有 20 bp 特异互补，
序列见表 1。所有的引物由上海生工生物工程有
限公司合成。
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2011 年第 8 期 袁围等:MXR1 基因对毕赤酵母工程菌代谢调控的影响
表 1 本研究所用引物
引物名称 引物序列 (5→3)
5CALB CATGGAATTCTTGCCATCTGGTTCTGATCC
3CALB TGCAGCGGCCGCTTATGGAGTAACAATACCAGAACA
L1 GTGCTACAGCTGAGTTTATTGC
L2 TGTGCGTGGGATAAAGTCATCAAAC
Z1
TGATGACTTTATCCCACGCACACCCACACACCATAG-
CTT
Z2
ACTAGACACCACCATCTAGTCGAGCTTGCAAATTAA-
AGCCTTCGAGCG
L3 CGACTAGATGGTGGTGTCTAGTTAATGAATTATG
L4 GTCATTTAAGCAAACAGTTCTAC
L5 TCGGCCATAACCTCCTGCTCGCTC
L6 CGTAGACCCATAAGACGACT
1． 2． 2 CALB表达载体的构建 回收 PCR产物，用
EcoRⅠ和 NotⅠ对回收的 PCR 产物和质粒 pPIC9K
分别进行双酶切。将分别回收载体和目的基因的双
酶切产物用 T4DNA连接酶在 16℃下过夜连接，将连
接产物转化大肠杆菌 Top10，用 LB琼脂平板(含 Am-
picillin 100 g /mL)筛选，构建表达载体 pPIC9K-
CALB。
1． 2． 3 酵母转化 为了构建重组菌 GS115 /
pPIC9K-CALB，用 SalⅠ线性化质粒 pPIC9K-CALB，
然后用氯化锂法转酵母 GS115，然后再 MD平板上进
行筛选，并提取基因组 DNA进行验证报告基因 CALB
是否成功整合。为了敲除重组菌 GS115 /pPIC9K-
CALB中的 MXR1 基因，用氯化锂法将重叠延伸的
PCR片段转入酵母，然后在 YPDS平板上进行筛选。
1． 2． 4 GS115 /pPIC9k-CALB-ΔMxr1p 菌株的鉴定
为了鉴定敲除是否成功，首先将 GS115 /pPIC9K-
CALB-ΔMxr1p 与 GS115 /pPIC9K-CALB 点在含有三
丁酸甘油酯的平板上进行表型鉴定。同时提取初步
筛选出来转化子的基因组，以此为模板，利用引物 L5
和 L6进行 PCR 鉴定。为了研究 MXR1 基因对毕赤
酵母代谢的影响，将两株菌 GS115 /pPIC9k-CALB-
ΔMxr1p 与 GS115 /pPIC9k-CALB 分别培养在 YNM、
YNG、YND和 YNE培养基中观察其生长情况。
2 结果
2． 1 CALB表达载体的构建
以质粒 pICAS-CALB 为模板，扩增出 CALB 基
因，构建重组表达质粒 pPIC9K-CALB 转化大肠杆菌
Top10 感受态细胞，获得重组菌，提取质粒进行双酶
切鉴定。电泳结果(图 1)显示，表达质粒 pPIC9K-
CALB经 EcoRⅠ，NotⅠ酶切后出现两条带，一条为
1 kb 的 CALB 基因，另一条为载体。测序结果表明
该转化菌的质粒中确实含有 CALB 片段，表明质粒
构建成功。
M． DL15000 DNA Marker;1．质粒 pPIC9K-CALB的双酶
切产物
图 1 重组质粒经 EcoRⅠ＆ NotⅠ双酶切鉴定
2． 2 MXR1 基因缺失的毕赤酵母基因工程菌株构
建与筛选
以 GS115 基因组为模板，以 L12 和 L34 为模板
分别扩增出 MXR1 上下游序列;以 pPICZA 为模板，
以 Z1 和 Z2 为引物扩增出 sh ble基因。将扩增出的
L12、L34 和 sh ble以浓度 1∶ 1∶ 1 混合后添加特异性
的引物 L1 和 L4 进行扩增，扩增出的结果如图 2 所
示。L12，sh ble和 L34 大小分别为 1． 2 kb，1． 1 kb，
1． 2 kb，重叠延伸后的 DNA 片段大小在 3 － 4． 5 kb
之间，与理论上的 3． 5 kb 相符。测序结果表明重叠
延伸成功。
用氯化锂法转化的方式将线性化后的质粒
pPIC9K-CALB转入毕赤酵母 GS115，利用组氨酸营
养缺陷型 MD平板筛选，挑选转化子于含三丁酸甘
油酯的 MM平板进行表型鉴定，获得重组毕赤酵母
GS115 /pPIC9K-CALB。将重叠延伸的 DNA片段，转
入重组 GS115 /pPIC9K-CALB，利用含博来霉素抗性
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
的 YPDS平板进行筛选，挑选转化子于含三丁酸甘
油酯的 MM平板进行表型鉴定，结果如图 3 所示。
重组毕赤酵母 GS115 /pPIC9K-CALB 能正常产酶，
而敲除菌丧失了产脂肪酶能力。提取敲除菌的基
因组利用特异性引物 L5 和 L6 进行 PCR 鉴定，结
果如图 4 所示。以重组菌 GS115 /pPIC9K-CALB
为模板，以 L5 和 L6 为引物扩增出来的 DNA 片段
约为 6 kb，而以敲除菌 GS115 /pPIC9k-CALB-ΔMxr1p
为模板，以 L5 和 L6 为引物扩增出的 DNA片段约为
3． 7 kb。测序结果表明 MXR1 基因被敲除成功。
2． 3 不同碳源对重组敲除菌 GS115 /pPIC9k-CALB-
ΔMxr1p生长的影响
将两株菌控制初始 OD600为 0． 05，分别培养在
YNG，YNE，YND 及 YNM 培养基中观察其生长情
况，测其 OD600。在 YNG 培养基中两株菌的生长情
况如图 5-A 所示:MXR1 基因被敲除后，GS115 /
pPIC9k-CALB-ΔMxr1p在以甘油为唯一碳源时生长
明显要滞后于重组菌 GS115 /pPIC9K-CALB。在
YNE培养基中两株菌的生长情况如图 5-B 所示:
MXR1 基因敲除后，GS115 /pPIC9k-CALB-ΔMxr1p 利
用乙醇的速率也降低。在 YND 培养基中两株菌的
生长情况如图 5-C 所示:MXR1 敲除后对葡萄糖的
利用并没大的影响。在生长前期，开始滞后于重
组菌 GS115 /pPIC9K-CALB，但在生长后期生长状
况趋于一致。在 YNM 培养基中两株菌的生长情
况如图 5-D 所示:MXR1 敲除后，GS115 /pPIC9k-
CALB-ΔMxr1p丧失了甲醇的利用能力，在 YNM 基
本上没生长。结果表明，两株菌分别在以甘油、乙
醇、葡萄糖和甲醇为唯一碳源的培养基中的生长
情况不同。
M． 250 bp DNA Ladder Marker;1 － 4．分别
为 PCR产物 L12，Z12，L34 以及重叠延伸
后的 PCR片段
图 2 重叠延伸 PCR结果
1．菌株 GS115 /pPIC9k-ALB-ΔMxr1p;2 － 4．
菌株 GS115 /pPIC9K-CALB
图 3 菌株 GS115 /pPIC9k-CALB-
△Mxr1p在三丁酸甘油酯平
板上的表型鉴定
M． DNA Marker DL15000;1，2分别为以 GS115 /
pPIC9K-CA-LB-ΔMxr1p，GS115 /pPIC9K-CALB
基因组为模板扩增的 PCR产物
图 4 菌株 GS115pPIC9K-CALB-
△Mxr1p的 PCR鉴定
3 讨论
本研究通过重叠延伸 PCR 方法，成功地敲除了
毕赤酵母中的 MXR1 基因。通过将重组菌 GS115 /
pPIC9K-CALB 及敲除菌 GS115 /pPIC9K-CALB-ΔMxr1p
在以甲醇、甘油、葡萄糖以及乙醇为唯一碳源的培养
基中培养，发现两者生长具有明显的差异性，这说明
该转录因子在乙醇、甲醇和甘油代谢途径中起着重
要的调控作用。而在以葡萄糖为唯一碳源的培养基
中，两株菌生长在前期具有差异，但是在后期基本一
致，这可能是因为在后期受到培养基中碳源限制的
原因造成。
转录因子 Adr1p 与 Mxr1p 在结构与功能上相
似，但是它们在某些方面还是存在着差异。敲除
ADR1 基因的酿酒酵母在以甘油、乙醇为碳源的培
养基表现出不生长，而敲除 MXR1 基因的毕赤酵母
在这些培养基中只是表现出生长缓慢。尽管目前
的研究进展发现Mxr1p与甲醇代谢途径中的乙醇氧
化酶启动子，甲醛脱氢酶以及二羟基丙酮合酶结合，
说明该转录因子通过与这些基因的启动子特异性的
结合从而影响了在甲醇调控中起着重要作用［8，9］，
091
2011 年第 8 期 袁围等:MXR1 基因对毕赤酵母工程菌代谢调控的影响
■．菌株 GS115 /pPIC9K-CALB;▲．菌株 GS115 /pPIC9K-CALB-ΔMxr1p
图 5 GS115 /pPIC9K-CALB与 GS115 /pPIC9K-CALB-△Mxr1p分别在
YNG(A)、YNE(B)、YND(C)、YNM(D)培养基中的生长情况
但是 Mxr1p 与其他代谢途径(乙醇、甘油和葡萄糖)
中的哪些关键酶基因结合目前还不清楚。进一步的
研究将通过鉴定 Mxr1p 与各代谢途径中关键酶基因
的启动子的特异性结合位点，从而了解 Mxr1p对这些
基因的调控作用，进一步深入了解 Mxr1p在各种碳源
利用的代谢途径中的作用。而且，通过突变该转录因
子与启动子的结合位点有可能提高外源蛋白在毕赤
酵母中的表达量。本研究为今后 MXR1 基因对毕赤
酵母中多条代谢途径的调控机制研究奠定了基础。
参 考 文 献
［1］Cregg JM，Cerehino JL，Shi J，et al． Recombinant protein expression
in Pichia pastoris． Mol Biotechnol，2000，16(1) :23-52．
［2］Cereghino JL，Cregg JM． Heterologous protein expression in the meth-
ylotrophic yeast Pichia pastoris． FEMS Microbiol Rev，2000，24(1) :
45-66．
［3］ Cregg JM，Tolstorukov I，Kusari A． Expression in the yeast Pichia
pastoris． Methods Enzymol，2009，463:169-189．
［4］Lin-Cereghino GP，Godfrey L，de la Cruz BJ． Mxr1p，a key regulator
of the methanol utilization pathway and peroxisomal genes in Pichia
pastoris． Mol Cell Biol，2006，26(3) :883-897．
［5］ Simon M，Adam G，Rapatz W． The Saccharomyces cerevisiae ADR1
gene is a positive regulator of transcription of genes encoding peroxi-
somal proteins． Mol Cell Biol，1991，11(2) :699-704．
［6］Young ET，Dombek KM，Tachibana C． Multiple pathways are co-reg-
ulated by the protein kinase Snf1 and the transcription factors Adr1
and Cat8． J Biol Chem，2003，278(28) :26146-26158．
［7］Young ET，Kacherovsky N，Van Riper K． Snf1 protein kinase regula-
ted Adr1 binding to chromatin but not transcription activation． J Biol
Chem，2002，277(41) :38095-38103．
［8］ Kranthi BV，Kumar R，Kumar NV． Identification of key DNA ele-
ments involved in promoter recognition by Mxr1p，a master regulator
of methanol utilization pathway in Pichia pastoris． Biochimica et Bio-
physica Acta，2009，1789:460-468．
［9］ Kranthi BV，Kumar HR，Rangarajan PN． Identification of Mxr1p-
binding sites in the promoters of genes encoding dihydroxyacetone
synthase and peroxin 8 of the methylotrophic yeast Pichia pastoris．
Yeast，2001，27(9) :705-711．
［10］蔡富强，韩钰，王艳林．鸟氨酸脱羧酶抗酶 1 突变基因的克隆与
原核表达．生物技术通报，2010(2) :149-153．
［11］Han SY，Pan ZY，Huang DF． Highly efficient synthesis of ethyl hex-
anoate catalyzed by CALB-displaying Saccharomyces cerevisiae
whole-cells in non-aqueous phase． J Mol Catal B Enzym，2009，59
(1-3) :168-172．
(责任编辑 李楠)
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