全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2007-12-24
基金项目:江苏省高校自然科学研究计划项目(05SJD24002),淮海工学院引进人才科研启动基金资助项目(KK01050)
作者简介:张波(1986-),男,江苏南京人,在读本科生
通讯作者:孟学平(1955-),男,教授,内蒙商都县人,研究方向:水生生物生化与分子生物学;E-mail:mxp2002@hotmail.com
通过设计合适的 ITS2引物,将帘蛤目 5种不同蛏类的 ITS2序列扩增出来,然后通过生物信息学的手
段对这 5种不同蛏类的 ITS2核苷酸序列进行分析研究,旨在通过这种分子生物学的手段,为这 5种贝类
的遗传进化关系和形态学分类提供分子学方面的依据,进而为蛏类的遗传育种和人工养殖提供相关的参
考价值。
1 材料与方法
1.1实验材料
实验用缢蛏、小刀蛏、细长竹蛏、总角截蛏来自连云港墟沟海鲜市场,长竹蛏来自福建长乐水产市场。
1.2实验仪器和试剂
1.2.1主要仪器 TGL-16M高速台式冷冻离心机,iCycle Bio-RADPCR仪,DY 602V稳流压电泳仪,UNIV.
HOODII-SN76S102996凝胶成像系统,DG-SHZ-82回旋式水浴恒温震荡器。
1.2.2主要试剂 SDS,酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混合液(上海生工生物工程有限公司),Taq DNA(上海
五种不同蛏类ITS2核苷酸序列分析
孟学平 1 张波 1 冒树泉 1,2
(1淮海工学院海洋学院 江苏省海洋生物技术重点建设实验室,连云港 222005;2山东省淡水水产研究所,济南 250117)
摘 要: 对5种不同蛏类的ITS2核苷酸序列进行扩增、测序及分析。结果表明:5种蛏类的509个序列位点中共有
49个保守位点,402个变异位点,318个简约信息位点,84个单突变位点。5种不同蛏类遗传距离在1.194~3.173之间,总角
截蛏和小刀蛏的遗传距离较近,而与其他3种蛏类的遗传距离较远,遗传距离在1.965~3.173之间。缢蛏、长竹蛏和细长竹
蛏3种蛏之间的遗传距离较其他2种蛏近,遗传距离在1.194~1.318之间。同种蛏类不同个体之间的遗传距离很近,遗传
差异很小。
关键词: 蛏类 ITS2序列分析
Sequencing Analysis on ITS2 Loci in Five Species of Razor Shell
Meng Xueping1 Zhang Bo1 Mao Shuquan1,2
(1Huaihai Institute of Technology Marine School,Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology,Lianyungang 222005;
2Fresh Water Fishery Research Institute of Shandong Province,Jinan 250117)
Abstract: This research amplified the five different species of razor shell’s ITS2 s quences,th equencing nd
analyzing. The results show that:there are 509 sequences loci which contain 48 conserved loci;402 variable loci;318
parsim-info loci and 84 singleton loci in the five species of razor shell. The genetic distance is 1.194 to 3.173 in the
five different species of razor shell,and the distance between Solecurtus divaricatus(Lischke)and Cultellus attenuatus
Dunker is closed,while is far from other three species of razor shell,th distance is 1.965 to 3.173. The distance among
Sinonovacula constricta(Lamarck) ,Solen gouldii Conrad and Solen gracilis Philippi is closed than other two species of
razor shell;the distance is 1.194 to 1.318. The genetic distance among the different individuals of razor shell is closed
and the genetic differences are small.
Keywords: Razor shell ITS2 Sequencing analysis
2008年第3期
生工生物工程有限公司),GoldView核酸染料(北京赛百盛基因技术有限公司),蛋白酶 K,其余试剂均为国
产分析纯。
1.3 基因组 DNA提取
剪取 50mg的蛏类的组织块,使用 SDS裂解液进行裂解,具体提取基因组 DNA的步骤参照分子克隆[4]
DNA提取方法。
1.4 基因组 DNA检测
将提出的 5种蛏类的基因组 DNA于 0.8%的琼脂糖凝胶上电泳,电压 5V/cm,电泳结束后,凝胶成像系
统拍照。
1.5 PCR扩增体系及程序
1.5.1 PCR扩增体系 10×缓冲液,5μl;Mg2+,5μl;Primer1(CACACTGAACATCGACATCTTG),1μl;
Primer2(GTTTCTTTTCCTCCGCTTACTG),1μl;dNTPs,1μl;模板,1μl;Taq酶,0.4μl(2U);加 ddH2O补足
50μl。
1.5.2 扩增程序 95℃预变性 5min;94℃变性 45s,52℃退火 30s,72℃延伸 1min;共 35个循环;72℃再次
延伸 10min;4℃永久保存。
1.6 序列测定及分析
将扩增好的 PCR产物送至上海生工生物工程有限公司纯化并双向测序,所测 ITS2核苷酸序列在
GeneBank注册,注册号(表 1)。利用 Mega3.1软件结合序列峰图对 ITS2核苷酸进行碱基排序、校正和组成
分析、进化分析。
表 1 5种蛏类、大刀蛏及蛤蜊科 3种贝类的 ITS2核苷酸组成比较
2 结果与分析
2.1 基因组 DNA和 PCR扩增质量
提取的 5种不同蛏类的 DNA质量很好,电泳条带清晰,可以用于 ITS2扩增。同时 PCR扩增的结果也
符合测序的要求。
2.2 5种蛏类 ITS2核苷酸组成及其序列分析
通过对帘蛤目 5种不同蛏类的 ITS2核苷酸序列进行扩增,测序后去除 ITS2序列两端的 5.8SrDNA和
28SrDNA序列(含引物序列),获得 313~444bp大小不等的核苷酸序列,明显存在碱基序列数目的多态性。
孟学平等:五种不同蛏类ITS2核苷酸序列分析 183
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
从表 1可以看出,长竹蛏和细长竹蛏的 ITS2序列大小在 415bp以上,而缢蛏、小刀蛏和总角截蛏的 ITS2序
列大小都在 370bp以下,缢蛏的 ITS2序列碱基数目最少,总角截蛏其次。但从表 1可以清楚的发现,除了
细长竹蛏 ITS2序列中的 G+C含量在 60%以下外,其余的蛏类的 G+C含量都在 61%以上,小刀蛏个体的
G+C含量甚至高达 69.1%。
利用 Mega3.1软件统计出,在 5种蛏类的 509个序列位点中,共有 49个保守位点,402个变异位点,
318个简约信息位点,84个单突变位点。由此可见,5种蛏类的遗传变异较大,保守位点较少,简约信息位
点较多。
2.3 5种蛏类的系统进化分析
根据已经测出的 5种蛏类的 ITS2核苷酸序列,通过使用 Mega3.1生物学分析软件中的 NJ法构建了这
5种蛏类的系统进化树(以大刀蛏和蛤蜊科的 3种贝
类为外群,见图 2)。通过图 2可以发现,外群大刀蛏
两个个体先和缢蛏聚为一支,其次和两个细长竹蛏个
体聚为一支,再和长竹蛏两个聚为一支。小刀蛏和总
角截蛏在进化树的另一支上,总角截蛏 3个个体先和
外群蛤蜊科 3种贝类聚为一支,再和小刀蛏聚为一
支。
2.4 遗传距离确定
根据 Mega3.1软件的 Kumara双参数模型 (转
换+颠换)计算 5种不同蛏类群体的相对遗传距离[5],
结果见表 2。
从表 2可以得出,5种不同蛏类遗传距离在
1.194~3.173之间,截蛏科的总角截蛏和小刀蛏的遗
传距离较近,而与其他 3种蛏类的遗传距离较远,遗传距离在 1.965~3.173之间。缢蛏、长竹蛏和细长竹蛏
3种蛏之间的遗传距离较其他两种蛏近,遗传距离在 1.194~1.318之间。同种蛏类不同个体之间的遗传距
离很近,遗传差异很小。
图 2 基于 5种蛏类和外群 4种贝类 ITS2序
列构建的系统进化树
表 2 5种不同蛏类 ITS2序列遗传距离
3 讨论
ITS2核苷酸序列的片段一般较短,容易扩增、测序和分析,广泛的应用在研究物种进化关系中。但是,
利用 ITS2这种分子手段研究海洋贝类遗传进化关系的报道比较少,目前已经报道的有西施舌、中国蛤蜊、四
角蛤蜊[6]、花纹文蛤[7]、珍珠贝[8]和太平洋牡蛎[9]等。目前研究较多的蛏类为缢蛏、长竹蛏、小刀蛏和细长竹蛏,
主要研究的是生理生化、核型、同工酶和分子标记等方面[3,10~15],而对总角截蛏的相关研究很少,鲜见报道。
184
2008年第3期
从表 1可以看出,5种不同蛏类中,除了细长竹蛏 ITS2序列中的 G+C含量在 60%以下外,其余的蛏类
的 G+C含量都在 61%以上,小刀蛏个体的 G+C含量甚至高达 69.1%。ITS2的高度变异性可能与其碱基组
成有关[8],5.8S和 28S的部分序列碱基组成中 GC含量较高,序列变异度低,而 ITS2的 GC含量低,序列变
异度高,故可以用作遗传进化分析。虽然本研究得出 5种不同蛏类的 ITS2核苷酸序列中 G+C在 60%左
右,含量较高,根据喻达辉等人[8]的观点,本研究中的蛏类 ITS2序列比较保守,变异位点较少,但通过生物
学软件的统计分析结果表明,在 509个序列位点中,只有 49个保守位点,却有 402个变异位点,由此可以
认为采用 ITS2这种分子手段对蛏类的遗传进化进行分析的方法是可行的,得出的数据结果是真实可靠
的。
刘相全等人[14]报道中的缢蛏 ITS2序列 G+C含量为 66.9%,而本研究中缢蛏的 G+C含量为 68.1%,高
于刘相全等人报道的数据。造成这种差异的原因可能是采样点的不同,其所用缢蛏采自青岛市场,而本研
究中的样品采自于连云港水产市场。牛东红等人[5]分析了不同种群缢蛏的 16SrRNA序列,其得出缢蛏 16S
rRNA序列中 G+C的含量在 37%左右,由此可以认为,不同的目的基因的保守程度有差异。
王冬群等人[12]研究了缢蛏、细长竹蛏和长竹蛏不同组织同工酶,得出了“细长竹蛏和长竹蛏的亲缘关
系近,这两种蛏和缢蛏的亲缘关系远”的结论,且其结论和形态学上的特征相符合。但是本研究的结果并不
是这样的,从图 2中的进化树可以看出,缢蛏和细长竹蛏先聚为一支,再和长竹蛏聚为一支,缢蛏较长竹蛏
来说,和细长竹蛏的亲缘关系较近。王冬群等人的研究是基于蛋白质水平的,而本研究是基于基因水平的,
可靠性更强,但是要真正弄清这 3种蛏之间的亲缘关系还需要辅助其他的分子生物学技术和生理生化等
方面的研究。
陈丽梅等人[10]的研究得出“小刀蛏和长竹蛏的遗传距离较远”的结论,这一结论和本研究的结果一致,
从而也可以反映出实验数据较可靠。通过分析进化树,可以发现在分类学上处于刀蛏科的大刀蛏和竹蛏科
的缢蛏、细长竹蛏和长竹蛏聚在了一起,而同是刀蛏科的小刀蛏却处在进化树的另一支上,要弄清其中的
关系需要进一步的研究。
参考 文献
1 施学兰,郑思敏.中国经济水产品原色图集[M].上海:上海科学技术出版社,2001.
2 蔡英亚,谢绍河.广东的海贝[M].汕头:汕头大学出版社,2006.
3 安贤惠.海洋湖沼通报,2005,(4):99~103.
4 J萨姆布鲁克,EF弗里奇,T曼尼阿蒂斯著.金冬雁 译.分子实验克隆实验指南(第 2版)[M].北京:科学出版社,1992.
5 牛东红,李家乐,汪桂玲,等.上海水产大学学报,2007,16(1):1~6.
6 孟学平,高如承,董志国,等.湛江海洋大学学报,2006,26(4):8~13.
7 李太武,张安国,苏秀榕,等.海洋与湖沼,2006,37,(2):132~137.
8 喻达辉,李有宁,吴开畅.南方水产,2005,1(2):1~6.
9 KongXiaoyu,ZhangLiusuo,YUZiniu,etal.中国水产科学,2002,9(4):304~308.
10 陈丽梅,孔晓瑜,喻子牛,等.海洋科学,2005,29(8):27~32.
11 王金星,赵小凡,周岭华,等.海洋学报,1998,20(2):102~107.
12 王冬群,李太武,苏秀榕.台湾海峡,2004,23(2):131~137.
13 李成华,李太武,宋林生,等.水产科学,2004,23(12):26~28.
14 刘相全,包振民,胡景杰,等.高技术通讯,2007,14(4):435~440.
15 孙虎山,王宜艳,武光全.鲁东大学学报(自然科学版),2006,23(3):216~220.
孟学平等:五种不同蛏类ITS2核苷酸序列分析 185