全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第2期
收稿日期:2007-10-16
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.50678062)
作者简介:季冉(1981-),女,硕士研究生,研究方向为木质纤维素酒精发酵研究
通讯作者:袁兴中(1963-)男,教授,博士生导师,主要从事固体废物处理与处置,废物资源化,环境、生态与能源系统规划和评价的研究;
E-mail:yxz@hnu.cn
外加肌醇对嗜鞣管囊酵母发酵的酒精产量及其
耐酒精能力的影响
季冉 袁兴中 曾光明 刘佳
(湖南大学环境科学与工程学院,长沙 410082)
摘 要: 嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)是可以同时发酵葡萄糖和木糖为酒精的菌种,在其生长和发酵培
养基中分别添加不同浓度(0~200mg/L)的肌醇以及不同起始浓度的酒精,以考察外加肌醇对嗜鞣管囊酵母生长、产酒精
能力和耐酒精能力的影响。结果表明,添加肌醇前后,嗜鞣管囊酵母的生物量及发酵的酒精产量均有所增加。外加肌醇对
嗜鞣管囊酵母生长有轻微的刺激作用,酵母生长最适肌醇浓度为150mg/L;而对酵母生长的耐酒精能力却有明显的影响,
并且,菌种在YEPD培养基中的耐酒精能力高于在YEPX培养基中的耐酒精能力。经实验测定,肌醇对嗜鞣管囊酵母产
酒精能力及发酵的耐酒精能力均有显著的影响。发酵培养基中未添加起始浓度的酒精时,菌种发酵的最适肌醇浓度为
100mg/L,此时生成的酒精产量为45.20g/L。当分别添加起始酒精浓度为10%和12%时,随着肌醇浓度的增加,菌种发酵生
成的酒精浓度均呈上升趋势;肌醇浓度为 200mg/L时,两种起始酒精浓度下,酒精的净生成量均达到最大,分别为
17.18g/L和16.68g/L。
关键词: 嗜鞣管囊酵母 发酵 肌醇 耐酒精
TheEfectofInositolAdditiononEthanolProductionby
FermentedandEthanolToleranceinPachysolentannophilus
JiRan YuanXingzhong ZengGuangming LiuJia
(ColegeofEnvironmentalScienceandEngineering,HunanUniversity,Changsha410082)
Abstract: GlucoseandxylosecouldbefermentedbyPachysolentannophilusatthesametime.Inorderto
investigatetheefectsofadded inositolon cel viability,ethanolproduction and ethanoltoleranceofPachysolen
tannophilus,diferentconcentrations(0~200mg/L)ofinositolanddiferentconcentrationsofinitialethanolwereadded
respectivelyinthegrowthmediaorfermentationmedia.Theresultshowsthatinthepresenceofinositoltherearemore
yeastbiomasandmoreethanolproductionthanintheabsenceofinositol.Additionofinositolhaslitleefectson
growthofPachysolentannophilus,andthemostappropriateconcentrationofinositolforyeastgrowthwas150mg/L.
Furthermore,whentheyeastwasculturedinYEPD medium,ethanoltolerancewasmorepowerfulthaninYEPX
medium.Additionalinositolhasremarkableefectsonethanolproductionandethanoltolerance.Intheabsenceofinitial
ethanol,themostappropriateconcentrationofinositolforyeastfermentationwas100mg/L,whiletheethanolproduction
was45.20g/L.Themoreaddedinositol,themoreethanoltheyeastproducedwhenthefermentationmedium with10%
or12% initialethanol.Moreover,theyeastwereincubatedinthefermentationmedium inpresenceof10% and12%
initialethanol,producingthemaximum ethanolof17.18g/L and16.68g/L using200mg/L inositolassupplement,
respectively.Theseindicatethattheinositolcontentintheseyeastmediacanplayanimportantroleinethanol
productionandethanoltolerance.
Keywords: Pachysolentannophilus Fermentation InositolEthanoltolerance
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
始于 20世纪 70年代中期的石油危机给酒精行业带来了前所未有的良机,随着人们环保意识的不断
加强,酒精作为一种清洁的燃料越来越受到人们的重视[1]。酒精是酵母菌发酵糖的重要产物之一,但是当酒
精在培养基中累积达到一定浓度时,就会对酵母菌细胞产生有毒效应,因为过高的酒精浓度会抑制细胞生
长、存活和发酵。为了提高酵母菌耐酒精的浓度,研究人员进行了许多尝试,如从自然界筛选耐酒精突变株[2],
诱导耐酒精菌体[3,4]和改变菌体的营养条件[5]等等。
池振明等[6]发现磷脂酰肌醇(PI)在酵母菌耐高浓度酒精、产酒精速度和高产酒精过程中起着重要作
用;在酒精发酵过程中,当细胞 PI含量较高时,酵母菌产酒精的速率和培养基中累积的最终乙醇的产量都
较高。在酵母菌细胞中,CDP-二酰基甘油(CDP-DAG)在 PI合成酶催化下可以与肌醇起反应生成 PI[7]。而
且,Hanson等人[8]报道,如果酵母菌细胞中缺乏肌醇的话,PI、细胞壁、蛋白质、RNA的合成以及细胞分裂都
会受到不利的影响,由此将导致细胞失去生存能力。因此,为了维持酵母菌的最适生长和发酵条件,可以在
培养基中人工加入肌醇,使细胞中的 PI含量明显增加,以提高酵母菌耐酒精的能力。
目前用生物质生产燃料酒精是一项热门的新技术,木质纤维素含有丰富的纤维素、半纤维素和木质
素;而半纤维素的水解产物包括 2种五碳糖(木糖和阿拉伯糖)和 3种六碳糖(葡萄糖、半乳糖和甘露糖)。
迄今为止,国内外有关酵母菌耐酒精方面的研究,几乎都是以只能发酵六碳糖,不能发酵五碳糖的酵母菌
作为研究对象,以嗜鞣管囊酵母作为研究对象的尚未见诸报道。因此,选择可同时发酵葡萄糖和木糖为酒
精的嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)作为研究材料,并且比较系统地研究了外加不同浓度的肌醇对
嗜鞣管囊酵母生长、产酒精能力和耐酒精能力的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 嗜鞣管囊酵母 (Pachysolentannophilus)As2.1585购于中国科学院微生物研究所,于 4℃保
藏,并且每 2个月转移至新鲜的斜面培养基上。
1.1.2 培养基 斜面培养基[9]:葡萄糖 10g/L,酵母膏 3g/L,麦芽汁 3g/L,蛋白胨 5g/L,琼脂 20g/L;YEPD培
养基:葡萄糖 20g/L,酵母膏 10g/L,蛋白胨 20g/L;YEPX培养基:木糖 20g/L,酵母膏 10g/L,蛋白胨 20g/L;发
酵培养基[9]:MgSO41g/L,KH2PO42g/L,(NH4)2SO43g/L,蛋白胨 3.6g/L,酵母膏 4g/L,木糖 25g/L,葡萄糖 80g/L。
1.1.3 种子液的制备 取斜面菌体接入 50mlYEPX培养基中,在 30℃,150r/min的条件下培养 24h,之后
以 10%的接种量接入 100mlYEPX培养基中,在相同的条件下培养 18h,所形成的菌体悬液即可作为种子
液。
1.1.4 主要试剂和仪器 肌醇购自上海源聚生物科技有限公司,气相色谱仪(6890N)购自美国安捷伦科
技有限公司,配氢火焰离子化检测器。
1.2 研究方法
1.2.1 菌种生长能力的测定 比较不同浓度的肌醇对嗜鞣管囊酵母生长能力的影响时分别以 YEPD和
YEPX培养基作为两组生长培养基,然后每组培养基中均添加一系列浓度为 0、10、50、100、150和 200mg/L
的肌醇。接下来,均接入已制备完成的种子液,接种量为 6%(v/v),在 150r/min的振荡培养箱中于 30℃,培
养 48h。测定菌体的生物量。
1.2.2 菌种生长的耐酒精能力的测定 比较不同浓度的肌醇对嗜鞣管囊酵母生长的耐酒精能力的影响时
分别以 YEPD和 YEPX培养基作为 2组生长培养基,每组培养基中分别添加浓度为 0、10、50、100、150和
200mg/L的肌醇作为 6组不同的培养基。然后,在 YEPD的 6组培养基中均添加一系列起始浓度为 10%,
12%,14%和 16%(v/v)的酒精;在 YEPX的 6组培养基中均添加浓度为 6%,8%,10%,12%和 14%(v/v)的
酒精。接下来,均接入 6%(v/v)的种子液,培养条件同 1.2.1。测定菌体的生物量。
1.2.3 菌种产酒精能力的测定 比较不同浓度的肌醇对嗜鞣管囊酵母产酒精能力的影响时在发酵培养基
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图 1 肌醇分别在 YEPD和 YEPX培养基中对
嗜鞣管囊酵母生长能力的影响
中分别添加一系列浓度为 0、10、50、100、150和 200mg/L的肌醇,并且调 pH值为 4.8。然后,均接入 10%(v/
v)的种子液,在 100r/min的振荡培养箱[10]中于 30℃,培养 48h。测定发酵生成的酒精浓度和菌体的生物量。
1.2.4 菌种发酵的耐酒精能力的测定 比较不同浓度的肌醇对嗜鞣管囊酵母发酵的耐酒精能力的影响时
以发酵培养基为基本培养基,培养基中分别添加浓度为 0、10、50、100、150和 200mg/L的肌醇作为 6组不
同的培养基,并在这 6个实验组中均添加一系列起始浓度为 10%和 12%(v/v)的酒精,调 pH值为 4.8。然
后,均接入 10%(v/v)的种子液,培养条件同 1.2.3。测定发酵生成的酒精浓度和菌体的生物量。
1.2.5 生物量的测定[11] 用 721分光光度计在波长为 600nm条件下比色测定菌液 OD值,测定时添加了
起始浓度酒精的菌液稀释 5倍,未添加起始浓度酒精的菌液稀释 20倍。
1.2.6 乙醇浓度测定[12] 采用气相色谱法测定。色谱柱为 DB-FFAP30m×0.25mm×0.25μm,进样口和检测
器温度均为 180℃,柱温恒温控制为 130℃,采用氮气为载气,正丙醇为内标物。
1.2.7 数据分析 数据采用 SigmaPlot.v10.0软件进行统计分析。
2 结果与讨论
2.1 肌醇对嗜鞣管囊酵母生长能力的影响
如图 1所示,肌醇对嗜鞣管囊酵母的生长有微弱的促进作用,而且在 YEPD培养基中比在 YEPX培养
基中有稍强的促进作用。在这两种培养基中,随着肌醇浓度的
增加,嗜鞣管囊酵母的生物量均呈轻微的上升趋势,当肌醇浓
度为 150mg/L时,酵母的生物量最高,但当肌醇浓度增加到
200mg/L时,嗜鞣管囊酵母的生物量反而下降。而且,加入各相
应肌醇浓度下的菌体生物量均高于无肌醇时的生物量。但从
总体趋势来看,肌醇对嗜鞣管囊酵母生长能力的影响并不显
著。
从图 1可以看出,嗜鞣管囊酵母在 YEPD培养基中的生
物量明显高于 YEPX培养基中的生物量。这是因为酵母代谢
木糖的途径比代谢葡萄糖复杂得多,在代谢过程中部分木糖
没有转化成酒精而进行辅酶 NADPH的合成或转化成其他副
产物。因此,酵母代谢木糖的能力低于代谢葡萄糖的能力[9]。
2.2 肌醇对嗜鞣管囊酵母生长的耐酒精能力的影响
如图 2和图 3所示,适当浓度的肌醇能有效提高菌体生长的耐酒精能力,而且在 YEPD培养基中比在
YEPX培养基中有更加明显的提高作用,这是因为酵母代谢木糖的能力低于代谢葡萄糖的能力。在这两种
●YEPX培养基 ○ YEPD培养基
图 2 在 YEPD培养基中肌醇对嗜鞣管囊
酵母生长的耐酒精能力的影响
起始酒精浓度(v/v):● 10%,○ 12%,▼ 14%,△ 16%
图 3 在 YEPX培养基中肌醇对嗜鞣管囊
酵母生长的耐酒精能力的影响
起始酒精浓度(v/v):● 6%,○ 8%,▼ 10%,△ 12%,■ 14%
季冉等:外加肌醇对嗜鞣管囊酵母发酵的酒精产量及其耐酒精能力的影响 165
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
培养基中,添加一系列起始浓度的酒精后,随着肌醇浓度的增加,嗜鞣管囊酵母的生物量均呈上升趋势,这
表明随着肌醇浓度的增加,酵母生长的耐酒精能力有增强的趋势。当肌醇浓度为 150mg/L时,嗜鞣管囊酵
母的生物量最高,但当肌醇浓度增加到 200mg/L时,嗜鞣管囊酵母的生物量反而下降了。但在所有培养基
中加入各相应肌醇浓度下的菌体生物量均高于无肌醇时的生物量。
在 YEPD培养基中,当酒精起始浓度为 10%时,肌醇对嗜鞣管囊酵母生长的耐酒精能力有明显的提高
作用;当酒精起始浓度为 12%和 14%时,肌醇对酵母生长的耐酒精能力明显低于酒精起始浓度为 10%的
耐酒精能力。当酒精浓度为 16%时,菌液 OD值在培养前后没有变化,说明菌种在 YEPD培养基中不耐
16%的酒精。
在 YEPX培养基中,当酒精起始浓度为 6%时,肌醇对嗜鞣管囊酵母生长的耐酒精能力有比较明显的
提高作用;当酒精起始浓度为为 8%和 10%时,肌醇对酵母生长的耐酒精能力明显低于酒精起始浓度为
6%的耐酒精能力。当酒精起始浓度为 12%时,酵母的生物量极其微小,此时菌种耐酒精的能力极弱,只有
当加入肌醇浓度为 150mg/L时,菌液 OD值突然增大。当酒精浓度为 14%时,菌液 OD值在培养前后没有变
化,菌种在 YEPX培养基中不耐 14%的酒精。
由以上 3个图可以看出,肌醇添加量为 150mg/L时菌体量达到最大,而肌醇添加量为 200mg/L时菌体
量均有所下降,说明添加少量的肌醇对酵母的生长有促进作用,之后随着用量增加,其促进作用有所下降。
因此酵母对肌醇比较敏感,其加量需严格控制。
2.3 肌醇对嗜鞣管囊酵母产酒精能力的影响
如图 4所示,肌醇对嗜鞣管囊酵母产酒精能力有促进作用,发酵培养基中未添加肌醇时,发酵生成的
酒精浓度为 30.03g/L;随着肌醇浓度的增加,嗜鞣管囊酵母发酵生成的酒精产量呈上升趋势,当肌醇浓度
为 100mg/L时,发酵生成的酒精浓度最高,达到 45.20g/L;但当肌醇浓度继续增加时,酒精浓度反而下降趋
势。而且,在培养基中加入各相应肌醇浓度下发酵生成的酒精浓度均高于无肌醇时的酒精浓度。可见,适当
浓度的肌醇能有效提高菌体发酵活性对酒精的抗性。但是,菌体浓度却呈现出不同的变化趋势。如图 5所
示,随着肌醇浓度的增加,嗜鞣管囊酵母的生物量呈上升趋势,当肌醇浓度为 150mg/L时,酵母的生物量最
高;当继续增加肌醇浓度时,酵母生物量下降。
起始酒精浓度(v/v):●0,○10%,▼12%
图 4 肌醇对嗜鞣管囊酵母产酒精能力和
发酵的耐酒精能力的影响
图 5 在未添加起始浓度酒精的发酵培养基中
肌醇对嗜鞣管囊酵母生物量的影响
嗜鞣管囊酵母发酵生成的酒精浓度达到最大值与菌体生物量达到最大值时所分别对应的外加肌醇浓
度并不相同,前者对应的肌醇浓度小于后者。这可能是因为当菌体浓度继续增大时,酵母细胞开始利用酒
精作为碳源,消耗了部分酒精,致使酒精浓度降低[10]。
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2008年第2期
2.4 肌醇对嗜鞣管囊酵母发酵的耐酒精能力的影响
由于前期工作测定了嗜鞣管囊酵母在 YEPD和 YEPX培养基中最高分别耐 14%和 12%的酒精,所以
本次实验中选择添加酒精起始浓度为 10%和 12%。如图 4所示,外
加肌醇对嗜鞣管囊酵母耐酒精能力有明显的影响,当酒精起始浓
度分别为 10%和 12%时,随着肌醇浓度的增加,菌种发酵生成的酒
精浓度呈上升趋势;两种起始酒精浓度对乙醇产量的影响之间的
差别并不显著;当肌醇浓度为 200mg/L时,酒精的净生成量(测得的
发酵后培养基中的酒精浓度除去起始添加的酒精浓度)均达到最
大,分别为 17.18g/L和 16.68g/L。而且,随着肌醇浓度的增加,菌体
的生物量仍呈上升趋势(图 6)。
3 讨论
酒精的抑制作用是影响高浓度酒精发酵的重要因素之一。池
振明等人报道在酒精发酵过程中,PI对酵母细胞高产酒精和耐高
浓度酒精起着非常重要的作用;当在培养基中加入肌醇时,酵母细胞会利用肌醇合成 PI,从而能够更快更
多地发酵生成酒精。但是,PI如何发挥高产酒精和耐高浓度酒精的作用以及 PI在高浓度酒精下保护细胞
免受损伤的机制还不清楚。有人发现高浓度的 PI可能对质膜蛋白质,特别是质膜 ATP酶和质膜完整性起
保护作用,以免受高浓度酒精的有害影响,但这种假设需要实验来证实[13]。
研究结果证实了外加肌醇对嗜鞣管囊酵母产酒精能力、生长的耐酒精能力及发酵的耐酒精能力均有
显著的影响;随着肌醇浓度的增加,嗜鞣管囊酵母的生物量呈微弱的先上升后下降的趋势,表明外加肌醇
对嗜鞣管囊酵母生长有轻微的刺激作用。还确定了嗜鞣管囊酵母生长最适肌醇浓度为 150mg/L;在 YEPD
和 YEPX培养基中添加一系列的起始酒精浓度后,酵母生长的最适肌醇浓度仍为 150mg/L。发酵培养基中
未添加起始浓度酒精时,发酵最适肌醇浓度为 100mg/L,此时生成的酒精浓度为 45.20g/L。当分别添加起始
酒精浓度 10%和 12%时,随着肌醇浓度的增加,菌种发酵生成的酒精浓度均呈上升趋势;当肌醇浓度为
200mg/L时,两种起始酒精浓度下,酒精的净生成量均达到最大,分别为 17.18g/L和 16.68g/L。这一研究结
果表明,外加肌醇有助于提高嗜鞣管囊酵母产酒精和耐酒精的能力,对实现木质纤维素的高浓度酒精发酵
具有重要意义,从而促进了高产率、低成本、节约能量的适合工业化生产燃料酒精的工艺和技术的出现。
有研究表明,在培养基中加入一定量的不饱和脂肪酸[14]或者营养盐[15],它们被酵母细胞吸收之后,也
可以使酵母细胞在酒精发酵过程中耐酒精能力有很大提高。因此,在进一步的研究过程中,可以系统考察
培养基中无机盐含量对嗜鞣管囊酵母生长和发酵以及耐酒精能力的影响,进而可以通过调配外加肌醇与
无机盐的比例含量以提高嗜鞣管囊酵母发酵终点的酒精浓度。
参考 文献
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图 6 在发酵培养基中肌醇对嗜鞣管囊
酵母生物量耐酒精能力的影响
季冉等:外加肌醇对嗜鞣管囊酵母发酵的酒精产量及其耐酒精能力的影响 167
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!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
(上接第167页)
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A:rNS1fragment;B:rNS1-Nfragment;C:rNS1-80-200aafragment;D:rNS1-Cfragment
1:DV1immunizedratseraresponsetorecombinantNS1proteins
2:DV2immunizedratseraresponsetorecombinantNS1proteins
3:DV3immunizedratseraresponsetorecombinantNS1proteins
4:DV4immunizedratseraresponsetorecombinantNS1proteins
3 讨论
近年来,登革病毒的感染不仅在东南亚流行趋势加重,而且在世界许多国家和地区复燃,成为严重的
公共卫生问题。但目前登革病毒感染尚无有效的防治措施,登革疫苗的研制也未取得突破性进展,早期检
测诊断方法也正在逐步深入研究。
NS1蛋白是登革病毒的一种重要的非结构糖蛋白,高度保守,可能与病毒毒力有关,但确切功能尚未
阐明。在病毒感染哺乳动物细胞时,NS1蛋白主要有 3种存在形式,与细胞内的细胞器相连或通过选择性
运输途径分泌到细胞表面,或者以可溶性的糖基化方式释放到细胞上清中[6]。4型登革病毒在感染不同宿
主细胞时,由于翻译后处理过程可能存在差异,如糖基化、蛋白切割位点的差异,4个型别的 NS1蛋白分子
量也不相同,介于 35～53kD之间,且不同型别的 NS1蛋白的等电点不同。NS1蛋白包含群特异性和型特异
性决定簇,具有多种 T和 B细胞抗原表位,能够诱发细胞免疫和体液免疫应答。通过比较不同血清型的 4
种 NS1蛋白氨基酸系列,发现 80~200aa变异性最大,可能是型特异性抗原决定簇所在。实验证明,利用原
核系统表达的登革 2型病毒 rNS1蛋白、rNS1-N蛋白和 rNS1-C蛋白可以与 4型登革病毒免疫血清发生反
应,显示出良好的特异性。而 rNS1-80-200aa蛋白只跟 2型登革病毒免疫血清发生特异性反应,也证明了之
前的推测。
综上所述,成功获得了重组的登革 2型病毒 NS1蛋白,具有较好的免疫原性,为下一步制备登革病毒
抗 NS1蛋白型特异型单克隆抗体,以期建立登革病毒分型诊断的方法做好准备。亦为进一步 NS1的生物
学性质、免疫学特性以及亚单位疫苗的研制奠定基础。
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