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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
SPE2HPLC法快速检测发酵液中紫杉醇的含量
李勇超 许桂芳 杨靖 孟丽
(河南科技学院生命科技学院 ,新乡 453003)
　　摘 　要 : 　针对红豆杉内生真菌发酵液中紫杉醇的含量测定进行探讨 ,以建立快速高效低耗的检测方法。采用 C18固相
萃取柱对紫杉醇进行吸附 ,用不同浓度的甲醇 2乙酸铵和甲醇分别作为洗脱剂对其进行洗脱 ,比较两者的洗脱效果 ,洗脱液用
HPLC进行检测 ;色谱条件为 :流动相甲醇 ( v) ∶水 ( v) ∶乙腈 ( v) = 20∶45∶35,流速 : 0170 m l/m in,检测波长 : 227 nm。结果表明 ,
浓度为 80%的甲醇溶液洗脱效果较好 ,紫杉醇的回收率为 8716%。
关键词 : 　紫杉醇 固相萃取 高效液相色谱 分离纯化
Determ ination of Paclitaxel in Fermentation Broth by
Solid2phase Extraction and RP2HPLC
L i Yongchao Xu Guifang Yang J ing Meng L i
( Henan Institu te of Science and Technology, Departm ent of B iotechnology, X inx iang 453003)
　　Abs trac t: 　A simp le, rap id and sensitive method for the determ ination of paclitaxel in endophytic fungi fermentation broth using
solid phase extraction and high performance liquid chromatography was established1 Paclitaxel was extracted with CH2 Cl2 1 After being
purified by C18 solid phase extraction, the purified extractwas analyzed directly by high performance liquid chromatography on a Cl8 col2
umn and UV detector at 227 nm, with m ixtures of methanol∶water∶acetonitrile ( 20∶45∶35) as mobile phase1 The results show that
methanol with content of 80% as eluant can gain high recovery with 8716% 1
Key wo rds: 　Paclitaxel Solid phase extraction ( SPE) H igh performance liquid chromatography (HPLC) Extract and Purifi2
cation
收稿日期 : 2009208227
基金项目 :河南省重点科技攻关 (082102330006) ,校科研启动基金 (6024)
作者简介 :李勇超 (19782) ,男 ,硕士 ,讲师 ,主要从事植物药用成分提取 ; E2mail: yongchaoli@hist1edu1cn
通讯作者 :孟丽 ,教授 ,硕士生导师 , E2mail: histm l@1631com　　紫杉醇 ( Paclitaxel或 Taxol)是 W ani 等 [ 1 ] 于1971年从短叶红豆杉 ( Taxus brevifolia Nntt1)的树皮中提取的一种具有抗肿瘤活性的四环二萜类化合物。目前紫杉醇主要从红豆杉的树皮中提取 ,其含量甚微 (一般在干树皮中的含量只有 0101% ) ,且资源紧缺。自从 1993年 Stierle与 Stroble[ 2 ]首次报道了从太平洋紫杉树中分离出一种可产紫杉醇的内生真菌 ( Taxom yces andreanae)以来 ,利用产紫杉醇内生真菌进行大规模发酵生产紫杉醇被认为是具有广阔的前景的方法之一 ,也将是紫杉醇来源的重要途径 [ 3 ]。利用内生真菌发酵生产紫杉醇的一个关键步骤是筛选并构建高产紫杉醇的菌株。筛选过程往往是先对其进行 PDA培养 ,然后用有机溶剂提取发 酵物中的紫杉醇 ,最后用 HPLC法对提取物进行紫杉醇检测 [ 4, 5 ] 。但是由于在发酵过程中不同种属的微生物会产生有不同吸收波长的色素、小分子量蛋白等杂质 ,致使色谱柱损耗大、效率低 ,也影响液相色谱的精确度 ,因此很有必要对提取液进行预处理。本研究以产紫杉醇内生真菌的发酵液为研究对象 ,用商品化的 C18固相萃取柱对紫杉醇提取液进行纯化预处理 ,以降低提取液中色素及其它杂质的含量 ,并探讨不同洗脱液对其的洗脱效果。旨在建立一套针对内生真菌发酵液的紫杉醇提取检测方法 ,为产紫杉醇内生真菌的高效低耗筛选奠定方法基础 ,同时也为发酵生产紫杉醇提供参考。
2009年第 12期 李勇超等 : SPE2HPLC法快速检测发酵液中紫杉醇的含量
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1 供试菌株 从太行红豆杉根部分离获得的
产紫杉醇内生真菌。
1. 1. 2 器材及试剂 HPLC22010C色谱仪 (日本岛
津 ) ,色谱柱为 C18柱 , Clean2Up C18萃取柱 (500 mg/6
m l,美国 UCT公司 ) ; 紫杉醇标准品 (美国 Sigma
公司 )。
1. 2 方法
1. 2. 1　培养基的制备 固体培养基为 PDA 培养
基 :马铃薯 200 g,葡萄糖 20 g,琼脂 20 g,水 1 L,
pH710。配制方法是马铃薯去皮切条 ,水煮 30 m in,
4层纱布过滤 ,溶入琼脂、葡萄糖 ,然后加水定容 ,
121℃灭菌 30 m in,在超净工作台内倒平板。
液体培养基制作方法与固体培养基相同 ,不加
入琼脂。分装至 250 m l三角瓶中 ,每瓶 60 m l,
121℃灭菌 30 m in。
1. 2. 2　内生真菌的液体培养 将分离纯化后得到
的内生真菌菌株接种到 PDA 液体培养基中 ,培养
3 d后取 6 m l接入 250 m l三角瓶中 , 28℃, 220 r/
m in,每瓶 60 m l培养 7 d。
1. 2. 3　紫杉醇粗提 纱布过滤发酵物 ,将滤液部分
用等体积的二氯甲烷萃取 ,取水相部分再用等体积
的二氯甲烷萃取 1次 ,菌丝部分经液氮研碎 ,超声
30 m in,静置过夜后用等体积的二氯甲烷萃取 ,重复
处理 1次 ,将所有的二氯甲烷萃取液合并 ,加入无水
硫酸钠干燥 ,过滤后用旋转蒸发器在 35℃下减压蒸
馏至干 ,溶解于 3 m l甲醇中 ,用 0145μm滤膜过滤 ,
定容至 10 m l,避光冷藏 ,备用。
1. 2. 4　紫杉醇粗体液预处理 　用 5 m l纯甲醇以 5
m l/m in的流度对 C18固相萃取柱进行活化。用 512
m l 50%的甲醇溶液与 018 m l发酵液相混匀 ,并取同
样的样品共 12份。将稀释后的样品加入 C18固相萃
取柱中 , 5 m l/m in的流度流下。
首先用 20%的甲醇溶液加入柱中的两份样品
进行淋洗 ,方法同 11214;然后用 50%的甲醇 2乙酸
铵水溶液 (100%甲醇与 012 mol/L乙酸铵溶液的体
积比为 40∶60,以下甲醇 2乙酸铵溶液均为此法配
制 )对第 1份样品进行洗脱。并将洗脱液收集于离
心瓶中 ,将其标记 ①;用 60%甲醇 2乙酸铵水溶液对
第 2份样品进行洗脱 ,将洗脱液收集于离心瓶中 ,标
记为 ②;用 70%甲醇 2乙酸铵水溶液对第 3份样品进
行洗脱 ,将洗脱液收集于离心瓶中 ,标记为 ③;用
80%甲醇 2乙酸铵水溶液对第 4份样品进行洗脱 ,将
洗脱液进行收集于离心瓶中 ,标记为 ④;用 90%甲
醇 2乙酸铵水溶液对第 5份样品进行洗脱 ,将洗脱液
进行收集于离心瓶中 ,标记为 ⑤; 50%甲醇溶液对第
6份样品进行洗脱 ,将洗脱液进行收集于离心瓶中 ,
标记为 ⑥; 60%甲醇溶液对第 7份样品进行洗脱 ,将
洗脱液收集于离心瓶中 ,标记为 ⑦;用 70%甲醇溶
液对第 8份样品进行洗脱 ,将洗脱液进行收集于离
心瓶中 ,标记为 ⑧; 80%甲醇溶液对第 9份样品进行
洗脱 ,将洗脱液收集于离心瓶中 ,标记为 ⑨; 90%甲醇
溶液 (即 012 mol/L的乙酸铵的甲醇溶液 )对第 10份
样品进行洗脱 ,将洗脱液收集于离心瓶中 ,标记为⑩;
同时将等浓度的未处理的样品溶液也进行标记。将
①～⑩和未处理的洗脱液放入冰箱中等待检测。
1. 2. 5　HPLC检测 ( 1)标品溶液配制 :精确称取
紫杉醇标准品 110 mg,用 10 m l甲醇溶解 ,配成 100
mg/L母液备用。将母液稀释成 100μg/L , 200μg/
L , 400μg/L , 800μg/L , 116 mg/L的系列标准品溶
液。 (2)色谱条件 :岛津 HP 2010C高效液相色谱
仪 , VP2ODS C18柱 (150 mm ×46 mm ) ;流动相为甲
醇 : ( v)水 ∶( v) ∶乙腈 ( v) = 20∶45∶35;流速 017 m l/
m in,检测波长 227 nm,灵敏度 , 011 AUFS, 柱温
35℃,进样量 20μl。
2　结果与分析
2. 1　标准曲线的确定
依次取所配的紫杉醇标准品溶液进样 ,以峰面
积对浓度进行回归得出标准曲线 ,紫杉醇浓度 ( x )
与峰面积 ( y)的直线回归方程为 : y = ( 31305 504 e
- 005) x, R2 = 01999 771 3,结果表明 ,紫杉醇在 200
～800μg/L范围内呈良好的线性关系 ,紫杉醇标准
品及标准曲线如图 1和 2所示 ,其中紫杉醇的保留
时间为 2419 m in。
2. 2 不同洗脱剂处理的 HPLC检测结果
2. 2. 1 紫杉醇粗提液的含量测定 测定结果如图
3所示 ,粗提液在 2419 m in时出峰 ,和标准品出峰时
间一致 ,说明粗提液中含有紫杉醇。利用外标法测
定其浓度为 72194μg/m l。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
2. 2. 2　甲醇洗脱结果 由不同浓度的甲醇作为洗
脱剂对紫杉醇进行洗脱 ,洗脱结果如表 1 所示。
80%的甲醇溶液的洗脱能力要比 50%、60%和 70%
的强 ,但比 90%甲醇的差。由此可计算出 80%洗脱
剂的回收率为 8716%。同时 ,由图 3和图 4相比较
可知 , 80%甲醇洗脱液中处于 2～10 m in之间的杂
质峰要远比其它浓度的乙醇溶液少 ( 90%甲醇洗脱
液的色谱图和紫杉醇粗提液色谱图基本一致 ,故省
略 ) ,说明 80%的甲醇溶液不仅洗脱能力强且起到
了去除杂质的作用。
表 1　洗脱剂浓度对紫杉醇洗脱效果的影响
洗脱剂
浓度 ( % )
洗脱液中紫杉醇浓度 (μg/m l)
甲醇 2乙酸铵 甲醇
50 1613 1719
60 3014 3418
70 4919 5114
80 6115 6319
90 6810 6817 2. 2. 3　甲醇 2乙酸铵溶液洗脱结果 由表 1可知 ,洗脱剂甲醇 2乙酸铵对紫杉醇进行洗脱与乙醇洗脱所呈现的规律相同 ,均是在 80%的浓度时有较大回收率 ,且能够去除相当一部分杂质。但由图 5看出 ,甲醇 2乙酸铵的洗脱效果没有甲醇的洗脱效果好。图 5　洗脱剂和洗脱浓度对回收效果的影响3　讨论3. 1　固相萃取柱的选择利用 SPE2HPLC法对紫杉醇检测已有相当多的
研究 ,如张志强 [ 6 ]和韩丽萍等 [ 7 ]应用填料为 A l2 O3
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2009年第 12期 李勇超等 : SPE2HPLC法快速检测发酵液中紫杉醇的含量
的自制固相萃取柱 ,分别建立了一套完整的 SPE2HPLC
方法 ,检测结果令人满意 ;庞欣等 [8 ]证明了 SPE2HPLC
良好优越性 ;雒丽娜 [ 9 ]和吴江等 [ 10 ]各自利用自制的
PRP26固相萃取柱和 A l2 O3固相萃取柱对粗提液进
行预处理 ,起到良好的效果。综观上述研究 ,虽都通
过 SPE2HPLC对紫杉醇检测取得了良好的效果 ,但
其所用固相萃取柱的型号及填料种类与填量多少都
存在较大差异 ,且大多固相萃取柱尚未实现商品化 ,
使得要求精确的紫杉醇检测难以保证有较高的重现
性 ,对于大批量的检测不太适宜。本研究选用的是
商品化的 C18固相萃取柱 ,其重复性良好 ,可以避免
多个处理间因为固相萃取柱不同而产生的差异 ;而
且 ,固相萃取柱的填料和 HPLC色谱柱的填料是一
致的 ,可以对色谱柱起到有效的保护作用 ,延长良好
柱效时间。
3. 2 洗脱剂的选择
固相萃取紫杉醇用到的洗脱剂有甲醇 [ 9 ] ,其最
佳洗脱浓度为 80% ,与本研究一致 ,但其回收率超
过 90% ,略高于本试验所得的 8716% ,原因可能是
填料不同。也有用三氯甲烷 2甲醇 [ 7, 10 ] ,其回收率也
超过了 90%。还有用 8∶1的甲醇 /乙酸铵 [ 11 ]缓冲液
(0101 mol/L , pH510) ,回收率在 90%左右 ,也与本
研究一致。回收率的高低与洗脱剂的种类、浓度和
流速 ,以及填料的种类和床体积等因素有着密切的
关系 ,要进一步提高回收率可通过尝试改变流速和
床体积等。
参 考 文 献
1　 W aniMC, Taylor HL, Monro CF, et1al1 Jam Chem Soc, 1971, 93:
2325～23271
2　 Stierle A, Strobel GA, Stierle D1 Science, 1993, 260 ( 5105 ) :
214～2161
3　赵凯 ,平文祥 ,周东坡 1微生物学报 , 2008, 48 (3) : 403～4071
4　程龙 ,马奇明 ,陶冠军 ,等 1工业微生物 , 2007, 37 (4) : 23～301
5　孙端方 ,冉雪琴 ,王嘉福 1微生物学报 , 2008, 48 (5) : 58925951
6　张志强 ,田桂莲 ,魏新桂 ,等 1中草药 , 1999, 30 (3) : 179～1811
7　韩丽萍 ,刘演波 ,张强 1解放军军需学学报 , 2003, 19 ( 5 ) : 373
～3751
8　庞欣 ,张光明 ,张瑞萍 ,等 1色谱 , 2004, 22 (2) : 1851
9　雒丽娜 ,董慧茹 ,郑云 ,等 1分析实验室 , 2005, 24 (7) : 80～841
10　吴江 ,卢永昌 ,朱小军 1青海师范大学学报 (自然科学版 ) ,
2006, 28 (3) : 71～731
11　张志强 ,王云山 ,田桂莲 ,等 1药物生物技术 , 2000, 7 ( 3 ) :
157～1601
(上接第 179页 )
纤维残胶率的要求 (残胶率 ≤210% ) ,但是可以通
过再进一步育种处理提高菌株的脱胶能力以及进一
步优化脱胶工艺使脱胶麻纤维含胶率降低 ,为更好
地应用现代生物科技制备高品质麻纤维材料 ,实现
绿色加工创造良好条件。
参 考 文 献
1　杜兆芳 ,曹建飞 ,张强 1苏州大学学报 (工科版 ) , 2008, 28 ( 2 ) :
27～291
2　肖丽 ,王贵学 ,陈国娟 1微生物学通报 , 2004, 31 (5) : 101～1051 3　刘正初 ,彭源德 ,冯湘沅 ,等 1纺织学报 , 2001, 22 (2) : 27～2914　胡国全 ,张辉 ,邓宇 ,等 1中国沼气 , 2003, 21 (4) : 10～1215　钟安华 ,谭远友 ,王成国 1印染助剂 , 2004, 21 (3) : 24～2616　黄俊丽 ,王贵学 1微生物学通报 , 2005, 32 (3) : 62～6717　曾莹 ,钟晓凌 ,夏服宝 1生物技术 , 2003, 13 (5) : 21～2218　韩铭海 ,黄俊 ,余晓斌 1无锡轻工大学学报 , 2004, 23 (6) : 9～1219　林捷 ,郑华 ,石木标 ,等 1微生物学杂志 , 2004, 24 (1) : 5～7110　李市场 ,白爱枝 ,姚建铭 ,等 1激光生物学报 , 2003, 12 (2) : 149～151111　李德舜 ,颜涛 ,宗雪梅 ,等 1山东大学学报 (理学版 ) , 2006, 41(5) : 151～154112　肖丽 ,王贵学 ,陈国娟 1重庆大学学报 , 2004, 27 (6) : 48～501
381