全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 4期
食品镉离子污染免疫检测技术的研究与应用
张海棠 1 王自良 1 刘耀东2
( 1 河南科技学院动物科学学院,新乡 453003; 2 山西农业大学动物科技学院,太谷 030801)
摘 要: 传统的理化分析方法在食品 Cd2+污染检测方面发挥了重要的作用, 但均存在一定的缺陷, 急需建立快速、高效
的检测方法。食品 Cd2+污染免疫检测是一种新型的分析方法,与理化分析方法相比, 具有省时省力、费用低廉、便于携带、操
作简便等优点, 已成为重要的检测手段。详细综述了目前国内外在食品 Cd2+污染免疫检测方面的研究方法和成果, 主要包括
Cd2+人工抗原的制备与鉴定、Cd2+单克隆抗体的制备及免疫学特性影响因素分析和 Cd2+ 免疫检测方法的建立及应用。在总
结这些研究的基础上 ,展望了食品 Cd2+污染免疫检测技术的发展方向。
关键词: 食品安全 镉离子污染 免疫检测
Research and Application of Immunoassay for
Cadm ium Ion Pollution in Food
ZhangH a itang
1 W ang Z iliang1 L iu Yaodong2
(
1
TheA nimal Science Co llege, H enan Institute of Science and T echnology, X inxiang 453003;
2
College of A nimal Science and Technology, Shanx iAgricultural University, Taigu 030801)
Abstrac:t The trad itional phys ica l and chem ica l m ethods w hich play an im po rtant ro le in detection of Cd2+ pollution in food,
have som e draw backs and sho rtcom ing s As new m e thods, immunoassays are of tim esav ing, laborsav ing, coste ffective, reasonab ly
portable and s imp le to per fo rm, thus have becom e importantm ethods for detec tion Cd2+ pollution in food Th is rev iew introduced seve r
a l kinds of a lternativ em ethods and progresses, inc lud ing preperation and iden tification o f Cd2+ artificia l antigen, preparation and influ
encing factors analysis of Cd2+ m onoc lonal an tibody, estab lishm ent and application of Cd2+ imm unoassays Based on these researches,
the development trend o f imm unolog ica l detections of Cd2+ po llution in food w as proposed as w ell
Key words: Food safe ty Cadm ium ion po llution Imm unoassay
收稿日期: 20081006
基金项目: 十一五 国家科技支撑计划重大项目 ( 2006BAK02A21 /1)
作者简介:张海棠 ( 1966) ,女,河南偃师人,副教授,研究方向为动物营养与饲料科学; Em ai:l zhanght_1966@ yahoo com cn
通讯作者:王自良 ( 1966) ,男,河南叶县人,博士, 教授,主要从事动物性食品安全生物技术研究; Te:l 03733693196, Em ai:l w angzl_2008@ ya
hoo com cn
重金属镉 ( cadm ium, Cd)以其良好的性能在电
镀、电池、汽车、航空、颜料、油漆、印刷、塑料等行业中
发挥着重要的作用,但也已成为环境污染的公害之
一 [ 1]。Cd主要以离子形式 ( Cd2+ )存在,可通过食物
链富集作用危害人类健康,对人体具有肾脏、骨骼、肺
脏、心血管等毒性作用和致癌、致畸、致突变等危害作
用 [ 2]。联合国粮农组织 ( FAO )和世界卫生组织
(WHO )将 Cd2+列为第 3位优先研究的食品污染物,
联合国环境署 (UNEP)、FAO和 WHO共同制定的食
品污染物监测和评价计划中将 Cd2+含量作为必测项
目之一,美国毒物和疾病注册处 ( ATSDR)把 Cd2+列
为第 6位危害人体健康的有毒物质。2005年我国制
定了食品 Cd2+最大残留限量标准 (MRL) ( GB2762
2005),粮食为 01~ 02mg /kg,肉类为 01mg /kg,蛋
类为 005mg /kg,蔬菜类为 005~ 02mg /kg,水果类
为 005mg /kg。
目前已建立的食品 Cd污染检测技术主要有石
墨炉原子吸收光谱法 ( g raph ite furnace a tom ic ab
sorption spectrometry, GFAAS)
[ 3]、火焰原子吸收光谱
法 ( flame atom ic absorption spectrometry, FAAS) [ 4]、
2009年第 4期 张海棠等:食品镉离子污染免疫检测技术的研究与应用
电感耦合等离子体质谱法 ( inductively coupled plas
mamass spectrometry, ICPMS) [ 5]、电感耦合等离子
体原子发射光谱法 ( induct ive ly coupled plasma atom
ic em ission spectrometry, ICPAES) [ 6]、氢化物发生
原子荧光光谱法 ( hydride generation atom ic fluores
cence spectrom etry, HGAFS ) [ 7] 以及电化学分析
法 [ 8]等。由于这些方法存在需要昂贵的仪器设备、
熟练的专业人员、烦琐费时、周期长、费用高、不能现
场操作、样品筛检量小等缺陷, 其应用受到了限制。
免疫检测技术具有简便、快速、敏感、特异、经济、筛
检量大等优势。自 1985年 R eardan等 [ 9]首次通过
金属鳌合剂人工抗原制备出重金属铟 ( ind ium, In)
单克隆抗体 (mAb) , 并建立免疫分析方法以来, 国
内外重金属污染免疫检测技术研究非常活跃。
1 Cd2+人工抗原的制备与鉴定
11 Cd2 +人工抗原的制备
敏感、特异的抗体是建立免疫分析方法的基础,小
分子物质人工抗原的制备是生产抗体的关键。M itchi
son
[ 10]
1971年发现了半抗原载体效应,提出了 T细胞识
别载体蛋白, B细胞识别半抗原,创立了半抗原免疫理
论,并在小分子化合物免疫分析领域得到了广泛应用。
Cd
2+结构简单,不具有 T、B两种细胞表位而无法直接
诱导机体产生特异性抗体,而且 Cd2+带有电荷,能与机
体内生物分子发生强烈的不可逆的反应而导致机体中
毒。因此,必须将 Cd2+连接到大分子蛋白质载体上合
成人工抗原,通过动物免疫才能制备针对 Cd2+的特异
性抗体。制备 Cd2+人工抗原的关键在于偶联剂的筛
选。Meares等 [ 11~ 13]的研究结果表明,作为金属离子人
工抗原的偶联剂必须满足 3个条件: ( 1)能够选择性结
合金属离子并减弱金属离子与生物分子之间的反应能
力; ( 2)能够与载体蛋白偶联; ( 3)偶联物能够被免疫系
统识别,具有免疫原性。大量筛选对比实验证明,大分
子双功能鳌合剂是最为理想的偶联剂。例如, 1955年
Scudie等 [ 14]使用乙二胺四乙酸 ( ethylenediam inetet
raacetic acid, EDTA)、1963年 Vo igt等 [ 15]使用二乙烯三
胺五乙酸 ( diethy lenetriam inepentaacetic ac id, DTPA)制
备出了 Cd2+鳌合物,主要用于 Cd2+中毒方面的研究。
1996年 B lake等 [ 16]通过制备的 Cd2+ EDTA载体蛋白
鳌合物作为人工抗原免疫 Ba lb /c小鼠,成功制备出抗
Cd
2+
mAb。1999年 Johnson[ 17]通过 DTPA衍生物二环
二酐 ( bicyclic dianhydride, BCD)制备的 Cd2+ BCD载
体蛋白鳌合物作为人工抗原免疫家兔,成功制备出抗
Cd
2+多克隆抗体 ( pAb)。目前常用的大分子双功能鳌
合剂主要包括 EDTA及其衍生物,硝基苯基EDTA ( ni
trobenzy lEDTA )、环己基EDTA ( cyc lohexy lEDTA )、异
硫氰酸苯基EDTA ( isoth iocyanobenzylEDTA, ITCBE ),
DTPA及其衍生物, 硝基苯基DTPA ( n itrobenzy lDT
PA)、环己基DTPA ( cyc lohexy lDTPA)、异硫氰酸苯基
DTPA( isothiocyanobenzy lDTPA, ITCBD) (图 1) [ 18, 19]。
12 Cd2+人工抗原的鉴定
鉴定重金属离子人工抗原常用的方法有紫外扫
描 ( UV )、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
图 1 Cd离子常用双功能鳌合剂
63
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
( SDSPAGE )、三硝基苯磺酸法 ( trin itrobenzenesulfo
n ic acid, TNBS)等。UV是根据载体蛋白的特征峰
以及 Cd2+鳌合物半抗原的特征峰均在 280 nm,但后
者位于高吸收值区域, Cd2+鳌合物半抗原与载体蛋
白偶联合成人工抗原后,其特征峰会发生飘移,依据
朗波比尔定律,计算其偶联率。 SDSPAGE是根据
载体蛋白与人工抗原的电泳条带, 通过凝胶成像系
统分析软件估测其分子量并计算其偶联率。TNBS
法是 1960年 Satake等 [ 20]建立的, 用来测定载体蛋
白中游离 氨基数目。Cd2+鳌合物半抗原是通过
双功能鳌合剂的残基与载体蛋白的 氨基反应偶
联,因此,偶联前后载体蛋白中 氨基的替换数目计
算偶联率, 可以得到较为准确的结果 [ 21 ]。经典的
Low ry法也可用测定人工抗原中载体蛋白的浓度,
理化分析法测定 Cd2 +的浓度, 进而计算其偶联率。
2 Cd2+单克隆抗体 (mAb)的制备及免疫学
特性影响因素分析
21 Cd2 + mAb的制备
相对 pAb而言, mAb均一性强,性能稳定, 可重
复生产,制备的检测产品便于标准化,是建立免疫检
测方法的理想试剂, 但用小分子半抗原制备高亲和
力、高特异性的 mAb极为困难。 1996年 B lake
等 [ 16]首次用制备的 Cd2+ EDTAKLH 作为人工抗
原,通过 Balb /c小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤筛选、
抗体纯化等常规的杂交瘤技术,建立了分泌抗 Cd2+
mAb的杂交瘤细胞株 2A81G5测定 2A81G5 mAb对
Cd
2 + EDTA复合物的 Kd为 21 nM, 对 Hg2+ EDTA
复合物的 Kd为 26 nM, 对 Mn2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、
Pb
2+、Mg2+、N i2+、In3 +、Fe3+、Au3+、Tb3+、Ga3+、
A l
3+、A g+等其它 14种金属EDTA复合物的 Kd要
低 20~ 40 000倍。2002年 Jones等 [ 22]用 Cd2+ EDTA
KLH制备出分泌抗 Cd2+ mAb的杂交瘤细胞株 A4和
E5,但其 mAb对 EDTA的亲和力几乎可以忽略。当
EDTA替换为 CyclohexylEDTA后, A4 mAb对 Cyclo
hexy lEDTA的亲和力较低, Kd为 0527 mM; E5 mAb
对 CyclohexylEDTA的亲和力较高, Ka为 227 nM。
2007年 Zhu等 [ 23]用 Cd2+ ITCBEKLH制备出分泌抗
Cd
2+
mAb的杂交瘤细胞株 Aa4、A a6、Ac4和 Ba2,这些
mAb均可用于建立 Cd2+快速检测的竞争 ELISA方法,
除与 Hg2+有轻微的交叉反应外,与其它金属离子的交
叉反应率均小于 1%,其中 A a6半数抑制浓度 ( IC50 )最
低为 419 g /L。
22 Cd2+ mAb免疫学特性影响因素分析
221 Cd2+对 Cd2+ mAb的影响 B lake等 [ 16 ]对
Cd
2+
mAb 2A81G5进行了分析, 认为 Cd2+大小直接
影响着 Cd2+ mAb的特异性和亲和力,两者之间具有
很好的相关性, 但其作用规律及机理尚待进一步
探索。
222 鳌合剂对 Cd2+ mAb的影响 鳌合剂的化学
结构和金属离子鳌合剂的三维结构对 Cd2 + mAb的
特异性和亲和力均产生较大的影响。例如, 2A81G5
与 Cd2+ EDTA复合物的 Kd值为 21 nM, EDTA上增
加 1个硝基苯基 ( n itrobenzy l)后 Cd2+ N itrobenzyl
EDTA复合物的 Kd值下降为 56 10- 10M, EDTA
上增加一个结构更为复杂的苯硫脲基 ( pheny lth io
ure ido )后, Cd2+ Pheny lth ioureidoEDTA 复合物的
Kd值下降为 72 10- 11M。 Jones等 [ 22]采用距离矩
阵法 ( d istancematrix, DM )比较不同金属 鳌合剂复
合物分子三维结构的差异, 以抗 Cd2+ mAb A4和 E5
结合力最高的 Hg2+ EDTA复合物和 Cd2+ EDTA的
晶体结构为标准, 用其它 4种不同的金属离子 ED
TA复合物晶体结构与之比较。其结论是,不同金属
离子 EDTA复合物三维结构的差异与 mAb对其亲
和力具有较好的相关性, 但不同的 mAb相关性不
同, A4的 R 2 = 097, E5的 R2 = 084。 1993年 Love
等 [ 24]的研究揭示了可能的作用机理, 鳌合剂与金属
离子通过化学键结合而使鳌合剂的构型发生改变,
鳌合剂结合不同金属离子具有不同的构型, 鳌合剂
的构型是决定抗原抗体识别的重要因素。
223 抗体氨基酸残基对 Cd2+ mAb的影响 在抗
原抗体反应相成抗原抗体复合物过程中,抗体对抗原
的识别及其亲和力受多种因素的影响,其中抗体某些
氨基酸残基起着非常重要的作用。例如, 2A81G5抗
体重链的 H is96对识别与结合 Cd2+ EDTA起重要
作用;重链的 Trp52对识别与结合 Cd2+ N itrobenzyl
EDTA中 benzy l起重要作用, 致使 2A81G5抗体与
Cd
2+ N itrobenzy lEDTA复合物的亲和力比对 Cd2 +
EDTA复合物的亲和力高 37倍。Delehanty等 [ 25]通
过位点突变实验进一步证实 E5抗体重链 H is96能
直接结合 Cd2+离子,当 E5抗体重链 H is96被突变
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2009年第 4期 张海棠等:食品镉离子污染免疫检测技术的研究与应用
为 Leu(H96L), E5抗体失去了识别 Cd2+离子的能
力。此外还证实, A rg96、Lys58等氨基酸残基也不
同程度的参与了抗原抗体的识别。
3 Cd2+免疫检测方法的建立及应用
免疫分析方法 ( immunoana lysis, IA )是以抗原抗
体特异性、敏感性、可逆性反应为基本原理, 以不同
的抗原抗体反应载体为技术建立起来的分析方法,
包括荧光偏振免疫测定法 ( fluo rescence po larizat ion
immunoassay, FPIA )、酶联免疫吸附测定法 ( enzyme
linked immunoso rbent assay, ELISA )、一步竞争免疫
测定法 ( onestep compet itive immunoassay, OC IA )、
K inExA免疫测定法 ( K inExA immunoassay, K IA )、胶
体金免疫层析试验测定法 ( gold immunochromatogra
phy assay, G ICA )和微悬臂梁免疫传感器 ( m icrocan
t ilever immunosensor, M IS)等。
31 荧光偏振免疫测定法 ( FPIA )
FPIA的基本原理是样品中待测的 Cd2+与过量
鳌合剂鳌合成可溶性的 Cd2+ 鳌合剂复合物后,与已
知固定浓度的 Cd2+ 鳌合剂荧光复合物共同竞争
Cd
2+
pAb上有限的结合位点,通过荧光偏振分析仪
进行分析建立标准曲线,样品 Cd2+浓度测定结果与
标准曲线对照得出样品中 Cd2+的准确含量。 Johnson
等 [ 26]最早建立 FPIA技术检测水样中的 Cd2+含量,
检测范围为 0~ 100 nmol /L,检测限为 1 nmo l/L,与其
它金属离子的交叉反应小于 05%。之后 Johnson
等 [ 17]将该检测技术推广应用于环境中其它金属离子
的残留检测。
32 酶联免疫吸附测定法 ( ELISA )
ELISA采用的是非均相间接竞争模式,其基本原
理是样品中的 Cd2+与过量鳌合剂鳌合成可溶性的
Cd
2+ 鳌合剂复合物后,将其与已包被于酶标板上的
包被抗原 Cd2+ 鳌合剂载体蛋白复合物共同竞争
Cd
2+
mAb上有限的结合位点,反应达到平衡后洗脱
多余的 Cd2+ 鳌合剂和 Cd2+ mAb,然后与酶标二抗反
应, 用酶及其底物显色系统显示抗原抗体的结合情
况,进而定量检测 Cd2+在样品中的含量。Khosrav iani
等 [ 27]建立了水样中 Cd2+间接竞争 ELISA检测方法,
检测范围为 7 ~ 500 nmo l/L,检测限为 7 nmol /L, 与
Hg
2+具有较强的交叉反应,与其它金属离子交叉反应
较小。朱晓霞等 [ 23]应用所研制的抗 Cd2 + mAb Aa6
株建立了间接竞争 ELISA检测方法, 检测范围为
219 ~ 8638 ng /m ,l检测限为 0313 ng /m ,l 除与
Hg
2+交叉反应外,与其它金属离子的交叉反应均小于
1%。间接竞争 ELISA用于 Cd2+检测目前已成为成
熟技术,是十分理想的快速筛选手段, 缺点在于出现
假阳性的概率较大,易引起误判。
33 一步竞争免疫测定法 (OC IA)
OC IA是在间接竞争 ELISA基础上发展起来
的, 又称为直接竞争 ELISA。其基本原理是将
Cd
2+
mA b包被于酶标板, 待测样品中的 Cd2+先
与过量鳌合剂鳌合成可溶性的 Cd2 + 鳌合剂复合
物, 并与已知浓度的 Cd2+ 鳌合剂 酶复合物混
合, 二者共同竞争固定在酶标板上 Cd2 + mA b有
限的结合位点, 反应达到平衡后, 洗脱多余的
Cd
2+ 鳌合剂和 Cd2 + 鳌合剂 酶复合物, 用酶及
其底物显色系统显示抗原抗体的结合情况, 进而
定量检测 Cd2 +在样品中的含量。OC IA比间接竞
争 ELISA灵敏、简便, 且其操作条件 pH 值 70 ~
76比间接竞争 ELISA pH值 ( 70 ~ 72)范围更
广, 更易于推广应用。 Darw ish等 [ 28 ]建立了 OC IA
检测水样中的 Cd2 + , 其检测限为 0 3 ng /m ,l其它
金属离子浓度对检测结果无干扰, 与 GFAA S具
有很好的相关性。之后, Darw ish等 [ 29]又建立了
OC IA检测血清样中的 Cd2 + , 其检测限为 0 3 ng /
m ,l检测范围为 024 ~ 100 ng /m ,l与 GFAAS的
相关度为 0984。
34 K inExA免疫测定法 ( K IA )
K IA是在 ELISA基础上发展起来的, 是一种计
算机控制的流式荧光计,由毛细管流 /观察单元组成
并配有多微孔筛, 筛子上面由统一大小的小珠堆积
形成填充床。小珠表面固化包被抗原 Cd2+ 鳌合
剂载体蛋白复合物, 样品中的 Cd2+与过量鳌合剂
鳌合成可溶性的 Cd2+ 鳌合剂复合物, 加入一定量
的 Cd2+ mAb并使反应达到平衡, 平衡溶液快速流
过包被有固化抗原的小珠, 未结合的 Cd2+ mAb与
小珠上的固化抗原结合,加入荧光标记二抗,检测结
合在小珠上的抗体分子,通过与标准曲线对照分析,
进而定量检测 Cd2+在样品中的含量。B lake等 [ 30]
研制成功的 K inExA3000用于 Cd2+的检测, 其灵敏
度比间接竞争 EL ISA提高了 10~ 1 000倍, 目前该
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
技术仍处于实验室研究完善阶段, 在实际工作中尚
未推广应用。
35 胶体金免疫层析试验测定法 (G ICA)
GICA的基本原理是 HAuC l4在还原剂作用下聚
合成金颗粒,金颗粒之间的静电作用和布朗运动, 使
其保持水溶胶状态,胶体金富含电子和强大的给电子
能力, 在胶体溶液 pH 82条件下, 以非共价键与
Cd
2+
mAb结合形成金标抗体 (AbAu),将金标抗体
干燥在玻璃纤维棉上,一端与固定有 Cd2+完全抗原
(检测线 )和二抗 R aM IgG (质控线 )的硝酸纤维素膜
相连,另一端与样品垫相连。加入待测样品后,金标
抗体重新水化并与样品相互反应,在毛细管的扩散作
用下沿着吸水纸方向移动, 至检测线时,若样品中不
含 Cd2+ ,金标抗体就会与完全抗原反应而被部分截
获,金颗粒富集而出现明显直观的红色条带,至质控
线时,金标抗体与 RaM IgG反应同样会出现红色条
带;若样品中含有 Cd2+ , Cd2+已与金标抗体反应而占
据了金标抗体上的有限位点,不再与完全抗原反应而
越过检测线,不出现红色条带,仅在质控线与 RaM IgG
反应,金颗粒富集而出现红色条带。Sasak i等 [ 31 ]成功
建立了 GICA检测 Cd2+方法,检测限为 03 ng /m ,l该
法特异、敏感、快速、简便、直观,其缺陷是不易定量。
36 微悬臂梁免疫传感器 (M IS)
M IS的是通过在微悬臂梁的表面固化定量的
Cd
2+
mAb形成生物敏感层,待测样品中的 Cd2+先与
过量鳌合剂鳌合成可溶性的 Cd2+ 鳌合剂复合物,待
测样品进入生物敏感层后,在微悬臂梁表面发生抗原
抗体反应形成抗原抗体复合物,其量的多少会引起微
悬臂梁产生形变或谐振变化等机械响应,响应结果将
通过换能器被转换成电学信号,通过信号分析进而定
量检测 Cd2+在样品中的含量。Ve lanki等 [ 32]成功建
立的 M IS技术应用于 Cd2 +检测, 检测限达到 10- 9
mo l/L。M IS是一种稳定、灵敏、准确、重复性好的检
测筛选方法,具有广阔的发展前景, 我国该方面的研
究刚刚起步,目前实际应用较少。
4 小结与展望
免疫检测技术具有省时省力、费用低廉、便于携
带、操作简便等明显优势, 处于检测技术的前沿。近
年来, 食品 Cd2 +污染免疫检测技术取得了长足的发
展,也得到了较为广泛的应用,但仍然存在以下 3个
方面的突出问题有待于进一步解决: ( 1)在 Cd2+半
抗原设计上需要筛选或合成新型鳌合剂,尤其利用
MT和 PC与 Cd2 +配位形成络合物制备 Cd2+半抗原
方面需要进一步深入研究; ( 2)在高亲和力、高特异
性 Cd2+ mAb的制备上, mAb与 pAb相比具有专一
性、均一性、无限供应性和便于标准化等优点, 但
Cd
2+
mAb的制备较为复杂和困难, 是该技术的关
键; ( 3)在检测方法的性能上, 除达到理化检测方法
所具备的灵敏、特异的性能指标外, 更要体现出快
速、简便、低成本等性能优势,以满足大量筛检、快速
简便、经济实用和现场检测的实际工作需求,免疫试
纸、蛋白芯片、免疫传感器等检测方法的建立与产品
的研发将成为今后的研究热点。此外, 重组 mAb建
构技术、基因工程抗体技术和蛋白质工程技术的进
步, 为食品 Cd2+污染免疫检测技术的发展提供了新
的机遇,其应用前景十分广阔。
参 考 文 献
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