全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第4期
收稿日期:2008-02-27
基金项目:国家863计划资助项目(2006AA020203,2007AA05Z417)和武汉市攻关项目(200720422138)
作者简介:汪小锋(1983-),男,在读硕士,研究方向:发酵工程与酶工程,E-mail:wxf7907@163.com
通讯作者:闫云君(1969-),男,教授,博士生导师,研究方向:能源生物技术与生态学,E-mail:yanyunjun@tom.com
脂肪酶(EC3.1.1.3),又称三酰甘油酰基水解
酶。在传统酶学中,脂肪酶是一类水解长链脂肪酸
甘油酯生成游离脂肪酸和甘油的界面酶。作为重要
的工业用酶,广泛应用于食品、制革、饲料、洗涤、油
酯化工等传统工业领域[1]。1984年,Zaks和 Klibanov
在有机溶剂体系中,以脂肪酶粉为催化剂,成功地
催化合成了一系列有机化合物[2]。该研究揭开了非
水相酶学的研究序幕,并迅速成为应用酶学研究中
最为活跃、发展最为迅速的领域。脂肪酶是非水相
酶学中最为重要的一类酶。显著不同于在水相体系
中的水解反应特性,脂肪酶在非水相体系中具有良
好的酯化、转酯、醇解和胺解等特性。该特性使脂肪
酶可被广泛地应用于生物能源(生物柴油)、药物合
成等应用前景广阔的领域[3,4]。
脂肪酶广泛存在动物、植物和微生物中。动物
体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组
织等,而植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种
子。而微生物脂肪酶种类最多,广泛存在于细菌、
酵母和霉菌中,最易获得和大规模生产,且具有比
动植物脂肪酶更广的 pH、温度适应性,因此是工业
用脂肪酶的重要来源。自 20世纪初首次发现以
来,便得到广泛研究和应用。近 20年来,微生物脂
肪酶发酵研究主要集中在高产菌株的筛选、常规
诱变育种、基因工程菌的构建、发酵工艺条件优
化、发酵工艺放大和酶的分离纯化等方面,其中脂
肪酶工程化技术的研究是其能否实现工业化生产
的关键。
1 微生物脂肪酶种类
目前,已知大约有 2%的微生物产脂肪酶[3],至
少包括 65个属的微生物,其中细菌 28个属、放线
微生物发酵生产脂肪酶的研究进展
汪小锋 王俊 杨江科 闫云君
(华中科技大学生命科学技术学院,武汉 430074)
摘 要: 脂肪酶是一种重要的工业用酶,广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。脂肪酶最主要的来源是
通过微生物发酵生产。综述了脂肪酶种类、高产脂肪酶菌种选育、发酵工艺优化与调控、高密度发酵和发酵工艺放大等方
面的研究进展,并展望了脂肪酶发酵生产的研究方向及前景。
关键词: 发酵 脂肪酶 基因工程菌 高密度发酵 放大
RecentProgressontheProductionofLipasebyMicrobial
Fermentation
WangXiaofeng WangJun YangJiangke YanYunjun
(ColegeofLifeScienceandTechnology,HuazhongUniversityofScience&Technology,Wuhan430074)
Abstract: Lipaseisoneofthemostimportantenzymesforindustryapplication.Theyareextensivelyappliedin
food,finechemistry,medicineandenergyindustry.Fermentationbymicroorganism isthemajorapproachinproduction
oflipase.Inthispaper,researchprogresintheseareas,includingmicroorganismssecretinglipase,screeninghigh-yieldwas
summarizedmicrobialstrains,optimizingandregulatingfermentation,highceldensityfermentationandscale-upproduction
oflipases,Theprospectfordevelopmentoflipaseproductionwasalsodiscusedhere.
Keywords: Fermentation Lipase Geneticengineeringmicroorganism Highceldensityfermentation Scale-up
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
菌 4个属、酵母菌 10个属、其它真菌 23个属,且不
同微生物来源的脂肪酶其组成成分、理化特性各不
相同。脂肪酶产生菌中得到深入研究的主要有根
霉、曲霉、青霉、毛霉、假单胞菌等具有工业应用价
值的菌种,以及与医学相关的金黄色葡萄球菌、钩
端螺旋体、粉刺状杆菌等。
1.1 细菌脂肪酶
细菌脂肪酶在大规模商业化生产中扮演着重
要角色。细菌脂肪酶大多数是胞外酶易于液体深层
发酵,生产比较容易[5]。细菌脂肪酶大多数是碱性
脂肪酶,且在 pH4~11、温度 30℃~60℃间具有良好
的稳定性。大多数细菌脂肪酶是糖蛋白,但也有些
细菌胞外脂肪酶是脂蛋白[6]。细菌脂肪酶的发酵生
产主要受温度、pH、碳氮源、脂类物质、无机盐、搅
拌和溶氧浓度等因子的影响。细菌脂肪酶的生产培
养基一般是由有机氮源和油脂性的碳源组成,如
油、脂肪酸、甘油和吐温等。通常,脂肪酶生产的温
度范围为 20℃~45℃,诱导时间从几小时到 3~4d不
等,但大多数集中在72h~92h间。目前一些数细菌的
野生菌或重组菌株得到了商业开发,其中最重要的是
无色杆菌(Achromobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、
节细菌属(Arthrobacter)、芽胞杆菌属(Bacilus)、伯
克霍尔德菌(Burkholderia)、色杆菌(Chromobacterium)
和假单胞菌属(Pseudomonas),尤其是假单胞菌属的
细菌脂肪酶应用最为广泛(表1)。
1.2 真菌脂肪酶
直到 1950年才开始进行真菌脂肪酶的研究。
由于真菌脂肪酶具有温度和 pH稳定性、底物特异
性以及在有机溶剂中具有高活性,且提取成本比较
低等优点,因而发展迅速[6]。目前商业化的真菌脂
肪酶主要有:黑曲霉 (Aspergilusniger),米曲霉
(ThermomycesLanuginosus),高温毛壳霉(Humicola
lanuginosa),米赫毛霉 (Mucormiehei),少根根霉
(Rhizopusarhizus),德氏根霉(Rhizopusdelemar),
日本根霉(Rhizopusjaponicus),雪白根霉(Rhizopus
niveus),米根霉(Rhizopusoryzae),皱褶假丝酵母
(Candidarugosa),南极假丝酵母(Candidaantarctica),
柱状假丝酵母(Candidacylindracea)等(表 1)。
表 1 部分商品化微生物脂肪酶
2 脂肪酶高产菌株的选育
脂肪酶的筛选方法着眼于快速、简捷、准确、选
择性强及易于自动化上。筛选脂肪酶高产菌通常采
用含甘油三酯琼脂平板法,并通过在培养基中添加
指示剂如罗丹明 B、溴甲酚紫、维多亚蓝等作为筛
选标记。
提高脂肪酶产量的途径主要有菌种改良和发
酵工艺优化 2种途径。菌种改良的主要途径主要有
菌种驯化、诱变育种和基因工程改造等。通过贫瘠
培养驯化和定向诱导可使产酶菌株对简单底物的
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利用能力加强,一定程度提高菌株的产酶活力。它
也是退化菌种复壮的常用手段之一。
2.1 诱变菌种
诱变育种是微生物改良的常用方法。目前,以
紫外线、亚硝酸、亚硝基胍、硫酸二乙酯、快中子等
理化因子作为诱变剂,利用低温、溴化乙锭、胆盐、
制霉菌素、克霉唑、琥珀酸钠、柠檬酸钠、丁酸、己
酸、三丁酸甘油酯等作为正突变筛选剂的诱变策
略,已成功应用于扩展青霉、黑曲霉、假单胞菌、酵
母等多种产脂肪酶菌株的诱变筛选。采用上述诱变
和筛选方法,一般可以将脂肪酶产量提高 1～10倍,
最高可达 40倍[7]。
2.2 构建脂肪酶基因工程菌
蛋白质工程及分子技术在菌种改良中具有重
要的作用。利用蛋白质工程改造菌株主要有随机突
变与定点突变两种方式。随机突变即通过不同突变
产生大量突变菌株,需要通过有效的筛选方法才能
得到产酶量大幅提高的突变株。定点突变筛选具有
某一相关特性的变异株,再由其中筛选出高产菌
株,从而可大大提高筛选品质和效率,且一定程度
上克服了诱变育种的盲目性。目前,利用分子生物
学手段筛选脂肪酶高产菌株己越来越受到研究人
员的重视。如 Candidacylindracea具有 5个不同的
脂肪酶基因,编码同源性在80%以上的5个脂肪酶[8],
具有脂肪酶基因的多态性。利用这一多态性通过现
代基因工程技术,不仅能够改造原有的产酶菌株,
而且能直接利用生物反应器高通量表达生产脂肪
酶。
通常情况下利用常规育种方法难以满足工业
化生产的需要,通过基因工程手段克隆脂肪酶基
因,并研究其基因表达调控,可以大幅提高脂肪酶
的产量。大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和曲霉
表达系统是应用最为广泛的 3种异源表达系统,许
多脂肪酶基因均在这些表达系统中实现了大量表
达[9]。采用分子伴侣基因与脂肪酶基因共表达、分泌蛋
白基因与脂肪酶基因共表达和构建蛋白酶缺陷突
变菌株也能不同程度上提高脂肪酶的产量和稳定
性。此外,通过改造脂肪酶基因及分泌蛋白基因以
提高脂肪酶产量、活性和稳定性也有许多成功的报
道[7]。
目前,越来越多的细菌和真菌的重组菌实现了
商业化生产。1988年丹麦 Novo公司成功将柔毛腐
质霉(HumicolaLanuginosus)的碱性脂肪酶基因克
隆导入适合发酵生产的米曲霉 (Aspeyilusoryzae)
工程菌株中,脂肪酶产量提高了近 1000倍[10],实
现了年产几百吨的工业化生产。这是第一个运用基
因工程技术生产脂肪酶从实验室走向市场的成功
范例。Motoyasu等报道脱氮产碱杆菌 TK7的脂肪酶
基因经克隆后转移到大肠杆菌中,并得到比原菌体
高 20倍左右的表达[4];Geritse等采用同源表达方式
将 P.alcaligenesM-1菌株的脂肪酶产量提高了 23
倍[11];Shibatani等分别采用同源表达和分泌蛋白基
因与脂肪酶基因共表达策略将 S.marcescens菌株
产生的胞外脂肪酶提高了 13倍和 140倍[12];Pfefer
等将 Candidaantarctica脂肪酶基因 CalA表达在毕
赤酵母中,粗酶比酶活最大达到 653U/mg,比商业
化的 CalA基因表达的脂肪酶 Novozym735提高了
106倍[13];Ma等采用强启动子大量表达 B.subtilis脂
肪酶,酶产量较原始菌株提高了100倍[14]。
微生物脂肪酶的高效生产不仅需要脂肪酶基
因的高效表达,还需要酶蛋白质的有效折叠和分
泌。基因工程技术和新生产技术的联合使用改善了
工业用酶的性能、降低了生产成本、提高了产品质
量、大大减少了对环境的影响。
3 脂肪酶的发酵生产
尽管产脂肪酶的微生物分布广泛,但寻找适于
工业生产的脂肪酶产生菌却比较困难。Fagery认为
优良产酶菌株的标准应是发酵周期短、营养基质低
廉、菌株易分离、胞外酶、非致病菌、不产生毒素、遗
传性状稳定及对噬菌体不敏感等。脂肪酶产量不仅
可以通过菌种改良(包括传统育种和基因工程菌的
构建),而且还可以通过对发酵条件优化来提高。同
样的菌种,不同的发酵条件可能会对产酶量产生巨
大的差异。因此,发酵条件的优化和发酵调控策略
对脂肪酶的工业化生产具有重要的意义。
3.1 微生物脂肪酶的发酵培养基
适当而丰富的营养物是菌体生长和酶大量产
生的重要前提。由于脂肪酶产生菌和酶特性的不
同,培养基配比和培养条件也各不相同。培养基一
般由碳源、氮源诱导物及常见的无机盐等组成。
汪小锋等:微生物发酵生产脂肪酶的研究进展 49
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常见碳源包括油脂、可溶性淀粉、玉米粉、葡萄
糖、果搪、糊精、糖蜜、麦麸和小麦粉等;速效碳源如
葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等有利于细菌脂肪酶的形成[15],
而缓效碳源如玉米粉和小麦粉等则有利于真菌脂
肪酶的形成[16]。也有报道指出,当培养基中含有单
糖、双糖和甘油,能抑制脂肪酶产生[17,18]。
氮源分为无机氮源(硫酸铵、硝酸铵、尿素等)、
有机氮源(如大豆粉、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白等)和
复合氮源。一般认为复合氮源对微生物生长及产酶
效果较好[16]。有机氮源一般比无机氮源要好,如蛋
白胨和酵母膏在细菌脂肪酶的生产中应用十分广
泛。但有些文献报道 NH4Cl和(NH4)2HPO4等无机
氮源也在部分微生物的脂肪酶生产中有较好的效
果[5,19]。
微量元素和某些添加物对发酵产酶也会产生
重要影响。Rashid的研究表明添加 EDTA于反应体
系中能完全抑制适冷假单胞菌 KB700A所产的低
温脂肪酶的活力,而添加 Ca2+能显著提高酶活[20]。
此外,Ca2+和 Mg2+能促进脂肪酶的分泌[21,22]。
大多数微生物只有诱导物存在时才能产生脂
肪酶。诱导物可以是甘油三酯、长链脂肪酸、脂肪酸
酯及其表面活性剂。许多研究表明培养基中添加表
面活性剂如 Tween80、TritonX-100、SDS、PEG和阿
拉伯胶等可以不同程度地提高脂肪酶的产量[23]。表
面活性剂促进产酶主要是由于增加细胞的通透性,
使脂肪酶易于分泌到胞外[24]。Corzo等报道 Tween80
的浓度在0.5g/L到2g/L时能增加胞外脂肪酶活性而
不改变生物量浓度,油酸强烈抑制脂肪酶活性[25]。
添加 0.5%的 TritonX-100能使 Aspergilusniger突
变菌株产酶量提高1.6倍[26]。阴离子表面活性剂SDS
(10mmol/L)能使脂肪酶的催化活性提高 25.5%[19]。
3.2 培养基及发酵条件优化
优良的生物产品从实验室水平到工业化生产
首先要解决的问题是生物过程的优化。工业发酵过
程中,设计一个发酵培养基是至关重要的。培养基
的组成显著影响产品浓度、产量和效率;在商业化
生产中,培养基成本能显著影响总生产成本。优化
培养基涉及大量的实验研究,是一个耗时、耗力、耗
费的过程[5]。影响发酵过程的因素有很多,主要包
括培养基组成、接种量、种龄、培养温度、转速、装液
量、发酵周期、溶氧、pH值和通气条件等,这些因素
往往又不是独立影响发酵过程的,常常是交互作
用。除传统的单因子法、正交设计法在生物过程优
化中得到广泛应用外,响应面法、均匀设计法、人工
神经网络、模糊逻辑控制、专家系统、遗传算法和化
学计量分析等一批更有效的新方法也在发酵培养
基的优化及过程程控制中逐步得到推广应用,并日
益显示出优越性[27]。其中响应面法应用最广,一般
可以将脂肪酶产量提高 1～10倍,最高可达 12倍[28]。
3.3 脂肪酶发酵的培养方式与发酵调控
脂肪酶的生产有传统的固态培养[29]、液态发酵[18]
和细胞固定化方法[30]等。目前生产上常采用液体深
层培养法生产脂肪酶,作为节约生产成本的连续发
酵、固定化细胞发酵和固态发酵技术在脂肪酶生产
中也有较多成功实例[7]。
液体深层培养易于控制,不易染杂菌,生产效
率高,但分离纯化成本高,且会产生大量的污水[29]。
液体深层培养通常采用分批 (batch)、补料分批
(fed-batch)和连续(continuance)发酵。补料分批发
酵法是介于分批发酵和连续发酵之间的过渡类型,
兼有 2种培养方式的优点,在脂肪酶的生产中应用
最为广泛[31]。许多文献报道补料分批发酵法所得产
物的量要比分批发酵高[32]。Patrick以橄榄油和蛋白
胨作为 Yarowialipolytica培养的碳源和氮源,采用
补料分批发酵所得酶活比分批发酵提高了 6倍[18]。
补料优化策略是液体发酵过程优化的关键,通常以
基质的补料速率为主控制量,溶氧、pH、细胞浓度
(x)、底物浓度 (s)、比生长速率 (μ)、摄氧率
(OUR)、氧传递速率(OTR)、CO2生成速率(CER)和
呼吸商(RQ)等变量为辅助控制量[33],求取优化控
制使得发酵终止时产物产量最高。
常用的流加模式分为非反馈补料和反馈补料。
非反馈补料分为恒速补料、变速补料、指数补料 3
种;反馈补料又分为 pH-stat法、恒溶解氧法、菌体
浓度反馈法、CER法和 DO-stat法等[34]。具体采用那
种补料方式要根据菌体的代谢特性而定。恒速补料
最为常用[32];指数补料策略因可以达到高密度培养
的目的,在发酵生产中受到广泛关注。在 7.5L发酵
罐中,C.cylindracea脂肪酶的发酵采用恒速补料时
细胞浓度和酶活分别比摇瓶中提高 10倍和 2倍;
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指数补料的细胞浓度和酶活又分别比恒速补料提
高了 1.7倍和 4倍[31]。各种反馈补料的效果因菌种
的不同而呈现较大差异。采用控制溶氧的补料策略
P.aeruginosa脂肪酶酶活比恒速底物补料提高 6.6
倍 [35];Gordilo等采用控制比生长速率的分批补料
策略,Candidarugosa脂肪酶生产力比分批发酵提
高了 10倍;DO-stat和 pH-stat等不同补料策略的
本质区别是补料速率不同,DO-stat补料与恒速补
料接近,pH-stat补料与指数补料接近[36]。通常要对
比研究不同的补料方式才能确定最优的补料策略。
Li等报道以溶氧作为控制因素进行反复分批补料
发酵,脂肪酶最高生产力是以 pH为控制因素分批
补料时的 3.3倍[37]。
固体培养设备比较简单、成本低、对环境危害
小、易于推广,但放大比较困难、培养参数控制较复
杂、容易污染杂菌。有些霉菌可通过固态发酵及液
体深层发酵两种方进行脂肪酶发酵生产,具体采用
那种培养方式要根据菌种的特性决定。Castilho研
究了 Peniciliumrestrictum脂肪酶分别采用固体发
酵和液体发酵的成本,当生产规模为 100M3/年时
固体发酵比液体发酵相比具有更大的经济效益[38],
固体发酵过程最大的优势是培养基的原料非常
便宜。Bhushan等以米糠和麦麸为底料培养酵母
生产碱性脂肪酶[39];Ikram等在 30℃下用麸皮和磷酸
盐培养根霉菌 72h,然后用液体抽提液抽提得到脂
肪酶[40];Rodriguez等[41]以甘蔗渣为固体支持物,橄
榄油、尿素、乳糖和无机盐为培养基,对 Rhizopus
homothalicus固体培养 12h,脂肪酶酶活最高达
826U/gDM;Azeredo等[42]以葡萄糖作为碳源采用不
同的方式发酵生产 Peniciliumrestrictum脂肪酶时,
只有固体发酵检测到酶活,可能是由于固态发酵代
谢抑制作用最小。
细胞固定化发酵主要应用于霉菌和酵母的发
酵生产中,其主要优点有:① 提高微生物细胞的稳
定性;②缩短发酵时间;③ 易于实现高密度培养和
连续发酵操作;④连续发酵时,避免高稀释率时菌
体流失;⑤过程控制和下游操作比传统的分批培养
简单;⑥废载体可作为固定化细胞用于催化反应[43]。
有关脂肪酶细胞固定化发酵方面的文献报道较少。
1992年,Ferer等在流化床反应器中将 Candida
rugosa细胞固定在海藻酸钙和聚亚安酯泡沫组成
的固体支持物上,成功实现了胞外脂肪酶的连续发
酵生产;Elibol等(2000)将 Rhizopusarhizus细胞固
定在聚亚安酯泡沫载体上,其持续产脂肪酶达
120h[44];尹春华等(2002)以珍珠岩和聚氨酯泡沫为
固定化载体固定少根根霉细胞发酵生产脂肪酶,酶
活性比无载体直接发酵高 6~8倍,产酶后固定化根
霉细胞的废载体有较高酶活性可直接作固定化细
胞用于催化化学反应[30]。Yang等(2005)以聚氨酯为
少根根霉固定化载体,对固定化后的细胞连续重复
批次发酵进行了研究,在摇瓶和 5L发酵罐中分别
重复发酵 9批和 6批,脂肪酶的生产力比分批发酵
提高了 5.6倍[45]。同时,随着对固定化载体、质量传
递效率、物理化学条件和动力学和工程模型等影响
固定化细胞生产技术的深入研究,固定化细胞发酵
生产将在未来脂肪酶的发酵生产中发挥重要作用。
此外,不同的生物反应器对脂肪酶发酵也具有
显著影响。Burkert等[46]发现白地霉(Geotrichumcan
didum)脂肪酶在气升式发酵罐中的生产力比搅拌
式大约高出 60%,产等量酶需要的能量比搅拌式
低。李丹等[47]将转盘式反应器成功应用到固定化根
霉细胞重复批次发酵生产脂肪酶,产酶量比分批发
酵提高了 3.5倍。因此,要实现脂肪酶生产的高效
率、低成本,不仅需要优良的菌种和廉价的培养基,
运用合适的培养方式,而且必须结合反应器的合理
设计、配置、操作和控制,才能真正实现。
3.4 高密度发酵
高密度发酵是获得高产工业酶的有效途径。它
是在传统发酵基础上建立起来的通过提高菌体的
发酵密度而最终提高产物比生产率的发酵技术。具
有减少生产设备投资、强化下游分离提取、综合提
高比生产率等诸多优点。高密度培养最早是在酵母
中实现的,主要生产单细胞蛋白、乙醇和酵母细胞,
后来才应用到其它微生物之中。高密度是一个相对
概念,只有Escherichiacoli、Bacilussubtilis、Sulfolobus
shibatae、Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris等
部分微生物的生物量干重浓度可以达到 100g/L以
上,另外一些微生物生长的高细胞浓度在 20g/L~
100g/L的范围内,大多数的微生物尽管采用各种发
酵策略细胞干重只能达到几克每升[48]。高密度发酵
汪小锋等:微生物发酵生产脂肪酶的研究进展 51
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主要应用在大肠杆菌和毕赤酵母重组菌的发酵生
产中,用来生产药用蛋白和多肽等,在脂肪酶的发
酵生产中的应用很少。控制营养物质流加的分批补
料是高密度发酵通常采用的方法。Kim等通过控制比
生长速率,指数补料最终实现了 Candidacylindracea
的高密度培养,细胞浓度最高达到90g/L。比生长速率
对重组蛋白在毕赤酵母中表达具有重要的影响[49],
Resina等以比生长速率为控制因素,山梨糖和甲胺
作为补料的碳氮源,利用指数补料使米根霉重组菌
细胞浓度达到 50g/L。大肠杆菌和毕赤酵母能达到
较高的细胞密度(100g/L以上),比较容易实现高密
度培养,在工程菌的发酵生产中发挥着重要作用。
Pfefer等在 5L发酵罐中分别采用分批补料和半连
续发酵生产 CalA基因表达的脂肪酶[13],毕赤酵母
细胞最大干重分别达到 110g/L和 160g/L。
高密度培养也有一些缺点,如底物抑制、溶氧
限制、产生大量泡沫、产物的不稳定和降解、CO2的
积累、代谢副产物抑制和排热限制等。目前,成功实
现高密度发酵培养的微生物主要还是重组的大肠
杆菌和毕赤酵母,且高密度培养细胞群体的调控机
制还不清楚。随着基因工程技术在脂肪酶菌种改良
方面日益广泛应用,以及发酵控制技术、检测技术
和反应器工程技术的快速发展,高密度发酵技术将
会在脂肪酶的发酵生产中发挥重要作用。
3.5 发酵工艺放大
发酵罐和发酵工艺的放大是发酵工程中的一
个重要课题。国内外均有很多文献报道,在此不再赘
述。但在脂肪酶的发酵放大工艺方面的报道不多[11,50]。
许多研究者通常以摇瓶中最优培养基作为小型发
酵罐中的初始培养基进行初步放大,通过优化小型
发酵的发酵工艺确定最佳工艺参数,以小型罐中的
培养基和最佳工艺参数为基础逐级放大到工业规
模。为了降低发酵成本,大型罐中培养基需要更换
成廉价易得的工业原料。
谭天伟等[51]成功实现了 Candidasp.脂肪酶从
摇瓶到 1500L发酵罐的逐级发酵放大,且从 30L~
1500L的放大过程中酶活力保持稳定;李江华等[52]
在圆弧青霉 PG37碱性脂肪酶的发酵工艺研究中
以摇瓶中最优发酵培养基和培养条件为基础放大
到 25L发酵罐,酶活力与摇瓶中相当,但发酵时间
缩短了 24h,以 25L发酵罐的发酵为基础成功实现
了 3M3发酵罐中试放大,且酶活性保持不变;
Gerits等[11]研究了 P.alcaligenes同源重组菌株脂肪
酶从实验室水平的 10L到工业应用水平 4M3、
100M3的发酵放大,但在放大过程中酶活逐渐下
降,100M3发酵罐酶活只有 10L发酵罐的 65%;他
们发现 CO2溶解水平增加是放大过程酶活降低的
主要原因;从小试规模放大到 100M3过程中,100L
和 4M3发酵罐作为种子罐,培养基,温度,pH和补
料速率不随发酵放大而改变,只有通气量随发酵规
模的变化而变化,10L是 1vvm;100L是 2vvm,4M3
是 0.5vvm,100M3是 0.4vvm。
发酵规模放大过程中最关键的是氧的供应和
细胞形态的变化,但目前尚未得到一个十分有效的
放大关联式,发酵罐的放大工艺仍处于经验或半经
验状态,因此深入研究发酵罐的放大对脂肪酶大规
模工业化生产具有重要意义。
4 结束语
酶的开发和应用具有巨大市场前景。2004年
全球工业用酶产值达 20亿美元,年平均增长率 4%
～5%,预计到 2009年将达到 24亿美元。脂肪酶不
仅在食品加工、洗涤剂、制药、精细化工、有机合成
和脱脂等传统工业应用日益广泛,而且还在生物传
感器、诊断工具酶、生物柴油合成等新领域的应用
也受到广泛关注[3]。市场对脂肪酶的需求不断增长,
使得脂肪酶的研究方向由发掘新的脂肪酶逐渐转
向提高现有脂肪酶性能以满足市场的需求。由于目
前商业化的脂肪酶成本相对较高,使得脂肪酶在更
大范围的应用受到一定限制,因此通过发酵工程技
术提高脂肪酶的生产力是一个非常迫切的工作。另
外,探索新型固定化技术以提高脂肪酶利用率,采
用全细胞催化和表面展示技术降低发酵成本等方
面的研究越来越受到研究人员的重视。传统的发酵
培养技术及细胞固定化方法、高效基因工程菌、高
密度发酵等新技术手段在脂肪酶发酵生产方面的
成功运用,降低了脂肪酶的生产成本,加速了脂肪
酶产品工业化进程,拓宽了脂肪酶的应用范围。随
着发酵控制和检测技术的发展,脂肪酶的产量还将
进一步提高,脂肪酶产品的成本也将逐渐降低,其
应用范围也将越来越广泛。
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2008年第4期
目前,我国脂肪酶的研发及产业化水平与国外
存在较大差距,不仅需要有优良的菌种资源,同时
也需要研制设计高效能的生物反应器以及先进发
酵及控制技术,以获得高产满足市场需要。
参考 文献
1 JaegerKE,EggertT.CurOpinBiotechnol,2002,13(4):390~
397.
2 ZaksA,KlibanovAM.JBiolChem,1988,263(7):3194~3201.
3 HasanF,ShahAA,HameedA.EnzymeMicrobTechnol,2006,39
(2):235~251.
4 肖春玲.微生物学杂志,1997,17(4):56~59.
5 GuptaR,GuptaN,RathiP.ApplMicrobiolBiotechnol,2004,64(6):
763~781.
6 SaxenaRK,GhoshPK,GuptaR,etal.CurSci,1999,77(1):101~
115.
7 舒正玉,王爱玲,杨江科,等.工业微生物,2007,27(3):52~57.
8 LotiM,GrandoriR,FusetiF,etal.Gene,1993,124(1):45~55.
9 Schmidt-dannert,Claudia.BioorgMedChem,1999,7(10):2123~
2130.
10 AdrioJL,DemainAL.FEMSMicrobiolRev,2006,30(2):187~214.
11 GeritseG,HommesRW,QuaxWJ.ApplEnvironMicrobiol,1998,
64(7):2644~2651.
12 ShibataniT,OmoriK,AkatsukaH,etal.JMolCatal,B:Enzym,
2000,10(1~3):141~149.
13 PfeferJ,RichterS,NievelerJ,etal.ApplMicrobiolBiotechnol,
2006,72(5):931~938.
14 MaJ,ZhangZ,WangB,etal.ProteinExprPurif,2006,45(1):
22~29.
15 LanserAC,MantheyLK,HouCT.CurMicrobiol,2002,44(5):
336~340.
16 TanT,ZhangM,XuJ,etal.ProcBiochem,2004,39(11):1495~
1502.
17 宋欣,曲音波.工业微生物,1999,29(4):22~26.
18 FickersP,FudalejF,NicaudJM,etal.JBiotechnol,2005,115
(4):379~386.
19 邵铁娟,孙谧,郑家声,等.微生物学报,2004,44(6):789~793.
20 RashidN,ShimadaY,EzakiS,etal.ApplEnvironMicrobiol,2001,
67(9):4064~4069.
21 GulatiR,SaxenaRK,GuptaR,etal.ProcBiochem,1999,35(5):
459~464.
22 RathiP,SaxenaRK,GuptaR.ProcBiochem,2001,37(2):187~192.
23 BapirajuKVVSN,SujathaP,ElaiahP,etal.JBasicMicrobiol,2005,
45(4):257~273.
24 CostasM,DeiveFJ,LongoMA.ProcBiochem,2004,39(12):2109~
2114.
25 CorzoG,RevahS.BioresourTechnol,1999,70(2):173~180.
26 MahadikND,BastawdeKB,PuntambekarUS,etal.ProcBiochem,
2004,39(12):2031~2034.
27 KennedyM,KrouseD.JIndMicrobiolBiotechnol,1999,23(6):
456~475.
28 GuptaN,SahaiV,GuptaR.ProcBiochem,2007,42(4):518~
526.
29 NagyV,TokeER,KeongLC,etal.JMolCatalB:Enzym,
2006,39(1~4):141~148.
30 尹春华,傅四周,等.过程工程学报,2002,2(6):534~538.
31 KimB,HouC.BioprocBiosystEng,2006,29(1):59~64.
32 GordiloMA,MontesinosJL,CasasC,etal.ChemPhysLipids,
1998,93(1~2):131~142.
33 LeeJ,LeeSY,ParkS,etal.BiotechnolAdv,1999,17(1):29~48.
34 涂桂云,李敏.工业微生物,2004,34(3):49~52.
35 MichelC,ColeenM,LoraineK,etal.JFermentBioeng,1993,
76(6):487~492.
36 LiCY,ChengCY,ChenTL.BiochemEngJ,2004,19(1):25~31.
37 LiCY,ChenSJ,ChengCY,etal.BiochemEngJ,2005,25(3):
195~199.
38 CastilhoLR,PolatoCM,BaruqueEA,etal.Biochem EngJ,
2000,4(3):239~247.
39 BhushanB,DosanjhNS,KumarK,etal.BiotechnolLet,1994,
16(8):841~842.
40 Ul-haqI,IdreesS,RajokaM.ProcBiochem,2002,37(6):637~
641.
41 RodriguezJA,MateosJC,NungarayJ,etal.ProcBiochem,2006,
41(11):2264~2269.
42 DeAL,GomesP,SantAG,etal.CurMicrobiol,2007,54(5):
361~365.
43 FererP,SolC.ApplMicrobiolBiotechnol,1992,37(6):737~741.
44 ElibolM,OzerD.ProcBiochem,2000,36(3):219~223.
45 YangX,WangB,CuiF,etal.ProcBiochem,2005,40(6):2095~
2103.
46 JanaFM.JChemTechnolBiotechnol,2005,80(1):61~67.
47 李丹,张大皓,谭天伟.化工学报,2007,58(9):2347~2351.
48 RiesenbergD,GuthkeR.ApplMicrobiolBiotechnol,1999,51(4):
422~430.
49 ResinaD,CosO,FererP,etal.BiotechnolBioeng,2005,91(6):
760~767.
50 FickersP,OngenaM,DestainJ,etal.EnzymeMicrobTechnol,
2006,38(6):756~759.
51 TanT,ZhangM,WangB,etal.ProcBiochem,2003,39(4):
459~465.
52 李江华,邬敏辰.无锡轻工大学学报 (食品与生物技术),
2000,19(3):213~215.
汪小锋等:微生物发酵生产脂肪酶的研究进展 53