全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2008-02-21
基金项目:项目来源“新奇特园林植物引进与苗木基地建设”课题(041038)山西省科技攻关项目
作者简介:崔翠(1982-),女,汉,山东聊城人,在读硕士,主要从事园林植物生理生态研究
通讯作者:蔺银鼎(1955-),男,汉,山西临汾人,教授、硕士生导师;Tel:0354-6288261,E-mail:sxnd_lyd@sohu.com
引言
DNA的提取是 DNA指纹分析技术以及进行 DNA杂交、PCR扩增、RFLP、RAPD分析及 AFLP分析或
基因组克隆的实验的首要前提。很难用一种方法来适应不同植物的 DNA的提取,因为不同植物及植物自
身的不同部位都有其各自的特点,这些特点反应在自身的结构和组成上[1],如有的组织木质化程度高,有
的细胞壁较厚,而有的含酚类物质多,有的则易于降解等。但应用任何一种方法提取基因组 DNA时,细
胞裂解是必经的步骤,能否得到高质量的 DNA,这一步非常重要。目前,大多数研究多采用 CTAB法来
提取 DNA。但是,采用普通 CTAB法提取出来的植物 DNA提取液中往往含有 RNA、蛋白质、多糖、单宁
和色素等物质。以元宝枫叶片为材料分别采用了普通 CTAB法和改良 CTAB法进行元宝枫 DNA的提
取。改良 CTAB法是针对元宝枫叶片细胞含有大量的多糖、单宁、色素和酚类物质的特点,在现有植物材
料 DNA提取方法的基础上,结合前人的经验[3],对普通 CTAB法进行适当的改进,从而解决了其粗提液中
含有 RNA、蛋白质、多糖、单宁和色素等物质而导致所提取 DNA不纯的问题,以获得高质量的基因组
DNA。
元宝枫叶片总DNA提取方法的优化
崔翠 蔺银鼎
(山西农业大学,太谷 030801)
摘 要: 由于元宝枫叶片细胞含有大量的多糖、单宁、色素和酚类物质,严重影响基因组 DNA的提取,在提取元
宝枫叶片总DNA的过程中,对常用的CTAB法进行了大胆的革新。结果表明,采用细胞核裂解前加入不溶性聚乙烯吡咯
烷酮(PVP)和将加入RNaseA消化RNA的步骤改在最后进行等技术,可以从元宝枫叶片快速提取高质量DNA,该研究
为从富含多糖、单宁、色素和酚类物质的植物中提取基因组DNA,提供了可行的分析方法。
关键词: 元宝枫 DNA提取 CTAB
TheOptimizedMethodofExtractingGenomicDNAfrom
LeavesofAcerTruncatumBunge
CuiCuiLinYinding
(ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801)
Abstract: ThecelsofAcertruncatumBungeleveshaverichamylose,tannic,pigmentandhydroxybenzene.These
substancesseriouslyproduceadverseefectinextractionofDNAfrom Acertruncatum Bunge.Consultingthewaysof
isolatingDNA from theisuesofotherplants,improvedCTABmethodwasusedtoextractgenomicDNA ofAcer
truncatum Bungeinthisresearchwork.Theresultssuggestedthatthatusingsomekeytechniques,suchasaddingPVP
beforekaryonwassplinteredandaddingRNaseAintheendofprogram intheresearch,canspeedupextractionof
DNAfrom leavesofAcertruncatumBunge.ThisworkprovidedapracticalanalyticmethodforstudiesongeneticDNA
isolationofplantswhichhaverichamylose,tannic,pigmentandhydroxybenzene.
Keywords: AcertruncatumBunge DNAextraction CTAB
2008年第4期
1 试验材料与方法
1.1 试验材料
材料于 2007年 4月取自山西农业大学苗圃,健康元宝枫植株的幼嫩叶片。取材后,用无菌保鲜膜包
装,在液氮中速冻 10s,立即贮于-70℃超低温冰箱中保存备用。
1.2 方法
1.2.1 元宝枫叶片基因组 DNA的提取
1.2.1.1 普通(十六烷基三乙基溴化铵)CTAB法
(Ⅰ)药品试剂
A.液氮;B.CTAB提取缓冲液:50mmol/LTris-HClpH8.0,0.7mol/LNaCl,10mmol/LEDTApH8.0,2%CTAB,
2%(V/V);C.氯仿/异戊醇(24:1);D.异丙醇;E.76%乙醇,0.2mol/L乙酸钠;F.70%乙醇;G.TE缓冲液:10mol/
LTris-HCl,1mmol/LEDTA,pH8.0。
(Ⅱ)实验程序
①取液氮冷冻的元宝枫叶片组织约 1g,在液氮冷冻下迅速研磨成粉末。
②迅速将研磨好的细粉装入 1.5mlEppendorf管中,加入 900μl65℃预热的 CTAB提取缓冲液,混匀。
③迅速将 Eppendorf管置于 65℃水浴中,保温 90min,其间不时温和颠倒混匀。
④待冷至室温后,取出 Eppendorf管,每管加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)溶液,混匀后至溶液呈乳浊
状离心,12000r/min离心 10min。
⑤用剪去端部约 0.8cm的 1ml吸头小心将上清液相转移至一干净的 Eppendorf管中.
⑥于上清液中加入等体积无水乙醇,轻轻混匀,至有白色絮状沉淀出现。
⑦取出后在 4℃,12000r/min离心 10min沉淀 DNA,去上清。
⑧用 70%的乙醇洗 3次,然后置于空气中干燥。
⑨沉淀干燥后溶于加有 50μl的 TE中,4℃过夜或直接置于-20℃冰箱中。
1.2.1.2 改良(十六烷基三乙基溴化铵)CTAB法
(Ⅰ)药品试剂(同上)
不同:CTAB提取缓冲液中加入 β-巯基乙醇;TE缓冲液中含有 10mg/mLRNaseA
(Ⅱ)实验程序:(同上)
不同:如果在⑤步后溶液颜色过深或明显混浊应重复④步,进行二次抽提;如果所用材料过老,抽提液
应换成酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)。如发现 DNA沉淀呈黄褐色,应加入 1%PVP,PVP对抑制多酚氧化酶和细
胞色素氧化酶的活性有很好的效果;⑨步中的 TE缓冲液中含有 RNaseA。
1.2.2 DNA的检测 1)紫外分光光度法测定 DNA的纯度:核酸的嘌呤、嘧啶中有共轭双键,对紫外光有
强烈的吸收。在紫外区,DNA的 λmax为 260nm,蛋白质的 λmax为 280nm,酚类和小分子盐的 λmax为
230nm。纯双链 DNAA260/A280值应在 1.8附近,低则 DNA中含有蛋白质及氨基酸、酚类等小分子杂质;高
则 DNA中含有 RNA;若 A260/A230值>2.0说明酚类和小分子盐去除很干净。取 10μlDNA溶液用 TE
(10mmol/LTris,50μmol/LEDTA,pH8.0～10.0)稀释至 500μl,经 UV-1601紫外分光光度计对照试剂空白测定
260nm,280nm,230nm的吸光度(A)值,根据 A260/A230和 A260/A280判断所提取的 DNA的纯度和浓度,
每个样品测定 3次,取其平均值。
DNA浓度(μg/mL)=A260×50(μg/ml)×稀释倍数
DNA得率(μg/g)=DNA的量(μg)/取材量(g)
DNA样品的纯度根据 A260/A280值确定
2)琼脂糖凝胶电泳检测 DNA分子大小:采用 1.0%的琼脂糖凝胶(含 0.5μg/ml的 EB溶液)进行电泳,
崔翠等:元宝枫叶片总DNA提取方法的优化 119
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
电压为 3～5v/cm,每点样孔点样 100～200ng,电泳缓冲液为 1×TBE,待溴酚蓝跑至离点样孔 2/3处,停止电
泳,并在紫外透射仪下检测 DNA降解情况和 RNA消化情况,同时根据标样判断 DNA的分子大小[4]。
2 结果与分析
2.1 DNA的纯度与产量
采用了改良 CTAB法和普通 CTAB法提取 DNA,并设法减少酚类、色素物质的干扰。结果表明(表 1),
改进的 CTAB法无论在产量和纯
度上均优于通用的 CTAB法:采用
改进的 CTAB法每克鲜叶可提取
42μg/g左右 DNA,A260/A280(OD
值)为 1.74,接近 DNA的标准 OD
值 1.80,纯度高;而采用普通 CTAB法产量只及改进的 CTAB法的一半,每克鲜叶可提取 20μg/g左右
DNA,A260/A280(OD值)为 1.52,与 DNA的标准 OD值 1.80差距太大,纯度低。显而易见,改进的 CTAB法
更适合于元宝枫植物组织 DNA的提取。
2.2 DNA电泳图谱的分析比较
DNA电泳结果显示,采用通用的 CTAB法所提取的基因组 DNA(图 1)电泳所显示出的带不很清晰,并
且粘在点样孔处,DNA片段大小不一致,条带后有明显拖尾,说明存在较为严重的降解和污染,不纯净。而
采用改进的 CTAB法所提取的元宝枫总 DNA十分纯净明亮,为一条清晰完整的带,DNA片段大小较一致,
条带后面没有明显的拖尾(图 2)。表明采用改进的 CTAB法提取的 DNA无降解,蛋白质和 RNA污染少、纯
度高、完整性好。
表 1 2种提取元宝枫叶总 DNA方法的结果比较
图 1 普通 CTAB法提取的元宝枫叶基因组 DNA 图 2 改良 CTAB法提取的元宝枫叶基因组 DNA
3 讨论
一般来说,CTAB缓冲液比较适用于草本植物和不含酚类或含酚类较少的植物 DNA提取。但对木本植
物和酚类含量丰富的植物,适当提高 CTAB的浓度也可以得到质量较高的 DNA。熊光明等[6]用含 2%(W/V)
CTAB的缓冲液提取柑橘的 DNA,得到了可以用于 AFLP分析的高质量的 DNA;袁长春等[7]用含 2%(W/V)
CTAB的缓冲液提取茶类植物的 DNA时,也得到很好的效果。但这并不是说提高 CTAB的浓度就一定能得
到高质量的 DNA,因为 CTAB浓度过高,保温时材料与 CTAB缓冲液难以充分混匀,造成材料发泡不均匀
和不充分,这就需要延长保温时间,增加 DNA的降解。同时,高浓度 CTAB法所提取到的 DNA量较少。在
进行 DNA提取时,还应确定植物材料与提取液的最佳比例,加入 CTAB过多或不足都会影响 DNA的提取
效果。SDS缓冲液在植物基因组 DNA提取中应用较少,主要应用于对模板 DNA质量要求不太严的 RAPD
分析[8]。
根据试验所提取元宝枫这种植物本身的特点,结合采用的通用 CTAB法从植物材料中提取出的一般
是 DNA粗提物的实际情况,通常在此基础上可利用饱和酚对 DNA样品进一步纯化以得到高纯度的 DNA
样品,对于元宝枫等富含多糖及酚类化合物的材料,则常需要纯化多次才能满足实验要求。但当一次纯化
多个样品时,频繁地更换离心管以及沉淀过程使得整个纯化过程变得繁琐,并且色素类物质往往不能完全
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2008年第4期
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去除。采用改良 CTAB法提取元宝枫基因组 DNA的过程中,使用酚类物质的结合剂 PVP,有效防止了多酚
物质氧化成醌类。PVP还能作为澄清剂吸附叶中元宝枫的多糖等杂质,使之沉淀去除;同时使用了适量浓
度的乙醇,可以在不影响 DNA产率的条件下有效地除去多糖等杂质。同时将加入 RNaseA消化 RNA的步
骤改在最后进行等一系列改进,可以获得高质量的 DNA。
采用改良 CTAB法提取元宝枫叶片 DNA,不仅操作过程简便,省时间,且提取效果非常理想,尤其在对
大群体样本 DNA进行提取时,该法优势更加明显。对元宝枫叶片 DNA的提取不仅为今后对元宝枫种质资
源研究和分子生物学方面的研究奠定了基础,而且对从彩叶植物以及富含色素、多糖、多酚类物质的植物
中提取 DNA具有一定的参考价值。
参考 文献
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