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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
云南传统发酵豆豉中高产豆豉纤溶
酶菌株的筛选及其酶谱分析
宋园亮1 黄文宇1 张忠华 1 吴少雄 2 殷建忠 2 柳陈坚 1
( 1昆明理工大学生命科学与技术学院 应用微生物研究室,昆明 650224; 2昆明医学院,昆明 650500)
摘 要: 从云南昆明、元阳、玉溪、昭通地区采集豆豉样品 26个, 通过琼脂-纤维蛋白平板试验, SDS- fibrin-PAGE蛋白电
泳结合 Zym og raphy活性染色对相应酶谱进行分析;同时采用茚三酮法测定其豆豉纤溶酶活性, 筛选得到 5株豆豉纤溶酶活性
较高的菌株, 其中尤以 ZT-13菌株纤溶酶活性达到 97109 U /mL, 是工业化生产豆豉纤溶酶的潜在优良菌株。
关键词: 豆豉 豆豉纤溶酶 酶谱分析
Screening ofH igh-yield Douchi Fibrinolytic Enzyme Producing Strains
from Yunnan Traditional Ferm ented Douchi and Zymography Analysis
Song Yuan liang
1 HuangW enyu1 Zhang Zhonghua1 W u Shaoxiong2 Y in J ianzhong2 L iu Chen jian1
(
1
Laboratory of App liedM icrobio logy, Faculty of Life Science and T echnology, Kunming University of Science and T echnology,
Kunm ing 650224;
2
KunmingM edical University, Kunm ing 650500)
Abstrac:t 26 Douchi samp les w ere co llec ted from Kunm ing, Yuanyang, Yux ,i Zhaotong reg ion and Yunnan prov ince. By aga r- f-i
br in p late test, SDS- fibr in-PAGE prote in e lectrophoresis com bin ing zymog raphy staining to analyze the pa ttern o f secreted enzym es.
M eanw hile, the fibrino ly tic ac tiv ityw as determ ined byN inhydr in m ethod. Therew ere 5 stra ins screened w ith high-y ield fibrino lytic ac-
tiv ity. Especia lly, the ZT-13 stra in o f fibr inolytic activ ityw as high and reached 97. 09 U /mL. It is a potentia l stra in for produc ing indus-
tr ia l fibr ino lytic enzym e.
Key words: Douch i Douch i fibrino ly tic enzym e Zym ography
收稿日期: 2010-11-10
基金项目:云南省科技厅面上项目 (KKSA200926038 )
作者简介:宋园亮,男,硕士研究生,研究方向:应用食品微生物; E-m ai:l strong1985@ 126. com
通讯作者:柳陈坚,博士,副教授,研究方向:应用微生物与人兽共患传染病; E-m ai:l new staar8@ hotm ai.l com
豆豉是以大豆为发酵基质, 经微生物发酵作用
酿造而成的传统发酵食品,不但其风味独特、营养丰
富、富含多种生理活性物质; 而且具有开胃增食、消
积化滞、驱风散寒及预防心脑血管疾病等功效 [ 1, 2 ]。
豆豉纤溶酶是在豆豉发酵过程中由枯草芽孢杆菌
(Bacillus subtilis)产生的一种丝氨酸蛋白酶, 具有明
显的溶栓作用,可用于预防和治疗血栓疾病;该酶分
子量小,可通过消化道直接吸收。因此,无论作为抗
血栓药物,还是作为预防血栓疾病的功能性保健食
品,都具有十分重要的研究与开发前景 [ 3- 5]。
云南省特殊的地理环境和多样的人文优势,创
造了云南特有的传统发酵豆豉资源, 形成以太和豆
豉、水豆豉、风吹豆豉、哈尼豆豉、五香豆豉及豆豉条
等为代表的传统发酵豆豉。这些独具特色的传统发
酵豆豉中蕴藏着乳酸菌及枯草芽孢杆菌等微生物资
源。本研究从云南昆明、元阳、玉溪及昭通主要传统
豆豉产区采集豆豉样品, 通过琼脂 - 纤维蛋白平板
试验,同时采用 SDS-fibrin-PAGE蛋白电泳结合 Zy-
mography活性染色, 并采用茚三酮法测定其纤维蛋
白酶活性,从云南传统发酵豆豉中筛选高产豆豉纤
溶酶的微生物,为豆豉纤溶酶的工业化生产提供优
良菌株。
2011年第 5期 宋园亮等:云南传统发酵豆豉中高产豆豉纤溶酶菌株的筛选及其酶谱分析
1 材料与方法
111 材料
11111 材料与试剂 从云南昆明、元阳、玉溪及昭
通主要传统发酵豆豉产地采集的豆豉样品 26个。
主要试剂:纤维蛋白 (M P); 琼脂糖 ( Sigma) ;硼
酸 (天津双船化学 ) ; 茚三酮, 氯化锡, 三氯乙酸; 纤
维蛋白诱导培养基: 017%磷酸氢二钾; 012%磷酸二
氢钾; 0101% M gSO 4 # 7H2O; 0105% 柠檬酸; 011%
酵母提取物; 013%纤维蛋白; 110%蛋白胨; 110%葡
萄糖。
11112 仪器与设备 电子分析天平 (德国赛多利
斯 ) ; 二氧化碳恒温培养箱 ( NAPCO6500TC ) ; 全自
动高压灭菌锅 ( TOMY);低温冰箱 (青岛海尔 ); 恒温
水浴锅 (日本 ASONE ); 冷冻高速离心机 ( S igma);恒
温摇床;台式混匀仪; Genova紫外分光光度计; B io-
Red垂直电泳仪。
112 方法
11211 菌种的分离与保存 称取豆豉样品 1 g,放
入 5mL灭菌的生理盐水中, 震荡混匀后取 20 LL接
种到营养肉汤培养基中, 35e , 150 r/m in摇床培养
48 h。将菌液用生理盐水 10倍梯度稀释,应用 10- 5
和 10- 6倍的稀释液 20 LL直接涂于 NA平板, 在
35e 培养 48 h后,挑选形态不同的单菌落,接种至
营养肉汤培养基中, 35e , 150 r/m in摇床培养 48 h
后,应用 50%甘油保存至 - 80e 冰箱以备后续研究
使用。
11212 明胶液化试验 将分离保存的菌种迅速融
化,取 20 LL添加至 17%明胶的营养肉汤培养基
中, 35e 培养 48 h, 随后置于 4e 冰箱中 20 m in,观
察试管中的明胶是否凝固。若明胶液化, 即判定为
阳性菌株。
11213 豆豉纤溶酶产生菌的筛选 将 20 LL所保
存的明胶阳性菌株的菌液接种于 5 mL已灭菌的新
鲜营养肉汤培养基中, 置于 35e 恒温培养 24 h,随
后振荡混匀,取 20 LL接种于 5mL的纤维蛋白诱导
培养基中, 150 r /m in, 37e 预培养 48 h。紧接将 20
LL经诱导培养的菌液接种至 20 mL的三角烧瓶正
培养基中, 150 r /m in, 37e 摇床培养 48 h。然后取
培养液 1 mL, 5 000 RCF, 离心 30 m in, 取培养上清
保存以进行后续的纤维蛋白酶活性测定。
将 10 LL培养上清添加至琼脂 ) 纤维蛋白平板
( 013 g纤维蛋白粉末和 011 g琼脂粉用 100 mL硼
酸缓冲液混合均匀, 37e 水浴加热 30 m in左右倒平
板, 凝固后在平板上均匀打 5- 6个孔 ) , 置于恒温
箱中 37e 培养 48 h,然后分别测定不同时间 ( 24 h,
48 h)纤维蛋白溶蛋白圈的直径,其大小近似为豆豉
纤溶酶的酶活 [ 6- 9]。
11214 SDS-Zymog raphy酶谱法 本试验将 SDS-Zy-
mography
[ 10- 12]酶谱法进行改良, 在制作凝胶时 (浓
缩胶浓度为 3%, 分离胶浓度为 15% ), 用 015%纤
维蛋白溶液替换明胶作为豆豉纤溶酶的底物, 通过
凝胶电泳将分子量不同的豆豉纤溶酶分离后除去
SDS,恢复豆豉纤溶酶活性。凝胶内恢复活性的豆
豉纤溶酶在一定条件下将其所在位置的底物纤维蛋
白水解,然后用考马斯亮蓝染色, 再用脱色液脱色
后, 凝胶染成蓝色, 而底物被水解处可见亮带, 根据
条带的数量及亮度可以初步判断样品中蛋白酶的种
类和酶活的高低。取粗酶液 20 LL, 5 LL Loading
Bu ffer,上样量 20 LL, 缓慢加入以防样品从泳道中
溢出,电压 100 V, 4e 、2 h。电泳结束后, 将 SDS-f-i
brin-PAGE进行 Zymog raphy活性染色, 显像记录。
11215 豆豉纤溶酶活性的测定 采用茚三酮法测
定 [ 13- 15] ,将其作部分改良,底物换为 016%的纤维蛋
白溶液,在 570 nm处测定样品酶液的 OD值,进而换
算成豆豉纤溶酶活性。亮氨酸标准曲线方程如下:
y= 01191x - 01004 (R 2 = 01999)
豆豉纤溶酶活性单位定义为: 1 mL酶液在 37e ,
pH715的条件下,每分钟水解纤维蛋白所产生 1 Lmo l
亮氨酸的酶量为一个酶活性单位,以 U /mL表示。
2 结果与分析
211 不同地区豆豉纤溶酶的筛选结
21111 昆明地区豆豉纤溶酶的筛选结果 从昆明
豆豉中分离得到的 14株明胶试验阳性菌株, 只有
KM-13、KM-14两株菌株出现溶蛋白圈, 其余菌株均
未出现溶蛋白圈 (图 1)。随着培养时间增加, 溶蛋
白圈的直径也随之增大, 48 h时的溶蛋白圈直径要
明显大于 24 h的溶蛋白圈直径。菌株 KM-13不同
培养时间的溶蛋白圈直径分别为 15 mm和 18 mm;
KM-14菌株不同培养时间的溶蛋白圈直径分别为
14mm和 16mm。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
A.培养 24 h的溶蛋白圈; B.培养 48 h的溶蛋白圈
图 1 昆明菌株的纤维蛋白 ) 琼脂平板结果
酶谱分析 (图 2)表明,将菌株 KM-13、KM-14分
别培养 24 h与 48 h, 其凝胶上均有亮带产生, 且培
养 48 h的亮带亮度较强,表明这两株菌株均分泌相
应的豆豉纤溶酶, 其结果与纤维蛋白 ) 琼脂平板的
筛选结果相吻合。
1. KM-13培养 24 h的粗酶液; 2. KM-13培养 48 h的粗
酶液; 3. KM-14培养 24 h的粗酶液; 4. KM-14培养 48 h
的粗酶液
图 2 昆明菌株的不同培养时间的酶谱结果
21112 元阳地区豆豉纤溶酶的筛选结果 从元阳
豆豉中分离得到的 7株明胶试验阳性菌株, 只有H-3
菌株出现溶蛋白圈,余菌株均未出现溶蛋白圈,并且
培养 48 h的溶蛋白圈直径比 24 h的溶蛋白圈直径
大 4 mm之多 (分别为 17 mm和 21 mm ); 酶的活性
随着培养时间的延长明显增强, 48 h培养的酶活比
24 h培养的高 (图 3) ,其 Zymog raphy的酶谱显示两
条明亮的条带,说明 H-3菌株可能分泌两种纤溶酶
(图 4)。
图 3 元阳菌株的纤维蛋白 ) 琼脂平板结果
1. H-3培养 24 h的粗酶液; 2. H-3培养 48 h的粗酶液
图 4 元阳菌株的不同培养时间的酶谱结果
21113 玉溪地区豆豉纤溶酶的筛选结果 从玉溪
豆豉中分离得到的 15株明胶试验阳性菌株, 除 YX-
14和 YX-23两株菌株没有出现溶蛋白圈外, 其余菌
株均出现了溶蛋白圈,其不同培养时间的溶蛋白圈
直径,如表 1。
表 1 玉溪 13株菌株不同培养时间的溶蛋白圈直径
菌株名称 24 h溶蛋白圈直径 (mm ) 48 h溶蛋白圈直径 ( mm )
YX-1 15 21
YX-3 16 20
YX-6 14 17
YX-9 13 17
YX-10 16 17
YX-11 13 19
YX-13 14 18
YX-17 14 17
YX-18 12 18
YX-19 13 17
YX-20 15 17
YX-22 11 14
YX-26 13 16
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2011年第 5期 宋园亮等:云南传统发酵豆豉中高产豆豉纤溶酶菌株的筛选及其酶谱分析
由表 1,图 5可见, 13株菌株均分泌相应的豆豉
纤溶酶,其中 YY-1、YY-3和 YY-11培养 48 h的溶
蛋白圈直径最大,其 Zymography活性染色的条带也
较明亮,且培养 48 h的豆豉纤溶酶活性要强于培养
24 h的豆豉纤溶酶的活性,该结果与纤维蛋白 ) 琼
脂平板的筛选结果相吻合; YY-1、YY-3、YY-11和
YY-13产生一条亮带, 在蛋白酶谱上显示在同一位
置,说明这两株菌株所分泌的纤溶酶分子量相同;
YY-6、YY-9、YY-10的亮带强度较弱, 其中 YY-9产
生 4条较弱的条带,推测其可能产生 4种分子量不
同的纤溶酶; YX-17、YX-18、YX-19和 YX-20培养 24
h在蛋白酶谱上产生一条亮带,且在同一位置,培养
48 h后,均出现一条较弱的条带,推测这 4株菌株可
能分泌分子量相同的纤溶酶; YX-22、YX-26培养 24
h后, 其蛋白酶谱显示 3个条带, 其位置相近, 且最
上方的条带较亮, 下方的条带亮度较弱, 继续培养,
48 h后, YX-26下方又出现两个较弱的条带,而 YX-
22则未出现。
1- 8. YX-1( 24 h) , YX-1( 48 h ), YX-3 ( 24 h) , YX-3( 48 h ), YX-6( 24 h) , YX-6( 48 h) , YX-9( 24 h), YX-9( 48 h ); 9- 14. YX-10( 24 h) ,
YX-10( 48 h) , YX-11 ( 24 h) , YX-11( 48 h) , YX-13( 24 h ), YX-13 ( 48 h ); 15- 22. YX-17 ( 24 h) , YX-17( 48 h) , YX-18( 24 h) , YX-18( 48
h) , YX-19( 24 h) , YX-19( 48 h) , YX-20( 24 h ), YX-20( 48 h); 23- 26. YX-22( 24 h) , YX-22( 48 h) , YX-26( 24 h ), YX-26( 48 h )
图 5 玉溪菌株的不同培养时间的酶谱结果
21114 昭通地区豆豉纤溶酶的筛选结果 从昭通
豆豉中分离得到的 10株明胶试验阳性菌株,除 ZT-
2、ZT-3和 ZT-25三株菌株没有出现溶蛋白圈外,其
余菌株均出现了溶蛋白圈 (表 2)。
由表 2可见, ZT-13培养 48 h, 其溶蛋白圈最
大,达到 26 mm, 并且 7株菌培养 48 h的溶蛋白圈
直径都大于 24 h的溶蛋白圈直径;其 Zymog raphy酶
谱上所显示的纤溶酶的亮带的强弱显示, 酶活随着
培养时间的延长明显增强, 48 h的酶活性比 24 h酶
活高 (图 6) , 这也印证了纤维蛋白 ) 琼脂平板的筛
选结果。ZT-1、ZT-5培养 24 h后, 其蛋白酶谱显示
两条亮带,且在同一位置,培养 48 h后,均出现一条
较弱的条带,推测这 2株菌株可能分泌分子量相同
的纤溶酶; ZT-13、ZT-15培养 24 h后, 其蛋白酶谱显
示 2条亮带,其位置相近, 且最上方的条带较亮, 下
方的条带亮度较弱,继续培养, 48 h后,二者都未出
现亮带; ZT-17、ZT-21培养 24 h后,蛋白酶谱显示 3
个条带,其位置相近,且最上方的条带较亮,下方的条
带亮度较弱,继续培养, 48 h后,二者下方均出现一条
较亮的条带,且 ZT-21的亮度较强。ZT-29培养 24 h
后,显示一条较亮的条带,继续培养, 48 h后无条带出
现,由此可判断 ZT-29只分泌一种纤溶蛋白酶。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
表 2 昭通 7株菌株不同培养时间的溶蛋白圈直径
菌株名称 24 h溶蛋白圈直径 ( mm ) 48 h溶蛋白圈直径 (mm )
ZT-1 16 19
ZT-5 16 20
ZT-13 19 26
ZT-15 10 15
ZT-17 18 22
ZT-21 18 21
ZT-29 12 15
1- 4. ZT-1 ( 24 h ) , ZT-1 ( 48 h ) , ZT-5 ( 24 h) , ZT-5 ( 48
h) ; 5- 12. ZT-13 ( 24 h ) , ZT-13 ( 48 h ) , ZT-15 ( 24 h ) , ZT-
15( 48 h) , ZT-17( 24 h) , ZT-17( 48 h) , ZT-21( 24 h ), ZT-
21( 48 h) ; 13, 14. ZT-29 ( 24 h ) , ZT-29 ( 48 h )
图 6 昭通菌株的不同培养时间的酶谱结果
212 不同地区豆豉样品由来微生物所产豆豉纤溶
酶活性
由表 3可见, YX-1、YX-11、YX-18、ZT-13和 ZT-
15五株菌株的豆豉纤溶酶活性最高, 其中 YX-1由
来豆豉纤溶酶活性达到 96122 U /mL, YX-11的酶活
达到 93188 U /mL, YX-18的酶活性达到 96166 U /
mL, ZT-13的酶活达到 97109U /mL, ZT-15的酶活达
到 94161 U /mL。其次是 YX-3和 YX-9两株菌株,
其酶活分别达到 74116U /mL和 72185 U /mL, 元阳
H-3菌株的豆豉纤溶酶活性为 52191U /mL, 该菌株
低于玉溪和昭通两个地区所分离得到菌株由来的豆
豉纤溶酶活性。而昆明地区的 KM-13、KM-14两菌
株的豆豉纤溶酶活性仅分别为 37115 U /mL 和
26199 U /mL,与其他三个地区相比,其活性相当低。
表 3 不同地区豆豉纤溶酶活性
菌株编号 酶活 (U /m L) 菌株编号 酶活 ( U /mL)
H-3 52197 YX-22 38146
YX-1 96122 YX-26 56146
YX-3 74116 ZT-1 44141
YX-6 57191 ZT-5 56131
YX-9 72185 ZT-13 97109
YX-10 70110 ZT-15 94161
YX-11 93188 ZT-17 57104
YX-13 37115 ZT-21 56189
YX-17 47160 ZT-29 43125
YX-18 96166 KM-13 37115
YX-19 37159 KM-14 26199
YX-20 36143
3 讨论
本试验建立了一种新的筛选豆豉纤溶酶的方
法, 通过纤维蛋白平板法对样品进行初筛,随后采用
改良的酶谱法对样品中豆豉纤溶酶的种类进行分
析,并结合茚三酮法测定其酶活。酶谱分析印证了
豆豉纤溶酶活性测定法的准确性, 为高产豆豉纤溶
酶菌株的筛选提供了更为简便而准确的方法保证。
本研究通过纤维蛋白平板法对云南省四个地区
的豆豉样品中产蛋白酶菌株的纤溶酶活性进行了评
价。昆明地区的 14个菌株中, 只有 KM-13、KM-14
两株菌出现溶蛋白圈, 产纤溶酶菌株获得率为
1413%。元阳地区的 7株菌株中, 只有 H-3出现了
溶蛋白圈,产纤溶酶菌株获得率为 14. 3%。玉溪地
区的 15株菌株中, YX-1、YX-3、YX-6和 YX-9等 13
株菌株均出现了溶蛋白圈,产纤溶酶活性较高,其获
得率高达 8617%。昭通地区的 10个菌株中, ZT-1、
ZT-5、ZT-13和 ZT-15等 7株菌株出现了溶蛋白圈,
其获得率为 70%。由此可见, 玉溪豆豉样品产豆豉
纤溶酶的微生物较多,其次是昭通地区。
SDS-fibrin-PAGE和茚三酮纤溶酶活性测定证
实了上述结果, 其中 YX-1菌株的纤溶酶活性达
96122 U /mL, YX-11菌株的纤溶酶活性达到 93188
U /mL, YX-18菌株的纤溶酶活性达到 96166U /mL,
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2011年第 5期 宋园亮等:云南传统发酵豆豉中高产豆豉纤溶酶菌株的筛选及其酶谱分析
ZT-15菌株纤溶酶活性达到 94161 U /mL, 而 ZT-13
菌株的纤溶酶活性高达 97109 U /mL。由于酶活测
定方法的不同,因此本研究中所分离得到的 5株高
产菌株的豆豉纤溶酶活性低于文献报道的水准。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫 )
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