全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 9 期 2013 年 5 月

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柱前衍生 RP-HPLC 法分析淡豆豉和大豆中氨基酸
李萍萍 1，崔元璐 1*，蒋庆峰 2
1. 天津市现代中药重点实验室，天津中医药大学，天津 300193
2. 天津药物研究院，天津 300193
摘 要：目的 分析淡豆豉 Sojae Semen Preparatum 和大豆 Glycine max 中游离及水解氨基酸。方法 用 0.1 mol/L HCl 作溶
剂超声提取得到淡豆豉和大豆中的游离氨基酸；用 6 mol/L HCl 水解提取得到水解氨基酸，以异硫氰酸苯酯（PITC）为柱前
衍生化试剂，采用柱前衍生 RP-HPLC 法进行分析。结果 淡豆豉和大豆中均含有 16 种氨基酸，这 16 种氨基酸浓度在 0.031～
1.750 mmol/L 内呈良好的线性关系，r 均大于 0.997 9，平均回收率 91.02%～102.04%，RSD1.01%～4.81%。结论 本方法灵
敏、准确，具有良好的重复性和稳定性，16 种氨基酸能在样品杂质量较多的情况下得到分离，且采用普通 C18色谱柱成本低，
可广泛应用于富含氨基酸样品的分析。
关键词：氨基酸；淡豆豉；大豆；异硫氰酸苯酯；柱前衍生高效液相色谱
中图分类号：R286.022 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)09 - 1199 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.09.026
Analysis on amino acids in Sojae Semen Preparatrm and Glycine max
by pre-column derivatization RP-HPLC
LI Ping-ping1, CUI Yuan-lu1, JIANG Qing-feng2
1. Tianjin State Kay Laboratory of Mordern Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China
2. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China
Abstract: Objective To analyze the free and hydrolyzed amino acids in Sojae Semen Preparatum (SSP) and Glycine max (GM) by
pre-column derivatization RP-HPLC. Methods Free amino acids extracted in HCl (0.1 mol/L) by ultrasonic method and hydrolyzed
amino acids extracted in HCl (6 mol/L) by hydrolysis method were both derivated by the agent phenylisothiocyanate so as to analyze them
by gradient elution. Results There were 16 kinds of amino acids in both SSP and GM. The 16 kinds of amino acids had good linearity in
the range of 0.031—1.750 μmol/mL with the coefficients of correlation all over 0.9979. The average recoveries were 91.02%—102.04%
and the RSD values were between 1.01% and 4.81%. Conclusion The method is not only sensitive and accurate, but also has the high
repeatability and stability, and the 16 kinds of amino acids could be separated in the case of the samples with more impurities. The
common C18 column is widely used for the determination of many other samples riched in amino acids at lower cost.
Key words: amino acid; Sojae Semen Preparatum; Glycine max (L.) Merr.; phenylisothiocyanate; precolumn derivatization HPLC

淡豆豉为豆科植物大豆 Glycine max (L.) Merr.
成熟种子的发酵加工品，具有解表、除烦、宣发郁
热等功效[1]。淡豆豉及其原材料大豆中含有丰富的
氨基酸，但其定量测定方法以及测定过程中的干扰
杂质却不同。异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生法[2-9]
为目前氨基酸分析[10-11]中简便、可靠的方法之一，
本实验采用经优化的 PITC 柱前衍生，梯度洗脱的
方法，能同时适用于淡豆豉和大豆中的水解以及游
离型氨基酸的定量测定，分离效果满足定量测定的
要求。
1 仪器与材料
Agilent 1100 系列四元梯度泵高效液相色谱仪，
UV 检测器（美国Agilent 公司）；超声波清洗机（宁波
新芝生物科技股份有限公司）；滤膜（美国Millipor 公

收稿日期：2012-08-17
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81173469）；教育部新世纪优秀人才资助项目（NCET-09-0899）
作者简介：李萍萍（1988—），女，山西太原人，天津中医药大学硕士研究生，研究方向为药物分析。
Tel: 13821680702 E-mail: lipingping121@126.com
*通信作者 崔元璐 E-mail: cuiyl@tju.edu.cn
网络出版时间：2013-03-28 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20130328.1114.002.html
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 9 期 2013 年 5 月

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司，孔径 0.45 μm）；氮吹仪（美国Organomation 公司）；
恒温干燥箱（金南仪器制造有限公司）。
谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、组氨酸（His）、
甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、精
氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、缬氨酸（Val）、蛋氨
酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、异亮氨酸（Ile）、亮
氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys）对照品和氨基酸混合对
照品溶液（美国 Sigma-Aldrich 公司）；PITC 衍生剂
（美国 Alfa Aesar 公司）；乙腈（色谱纯，天津康科
德公司）；其他试剂均为分析纯；超纯水。淡豆豉
Sojae Semen Preparatum（SSP）购自河北安国，大
豆 Glycine max (L.) Merr.（GM）产自黑龙江，均经
天津中医药大学李天祥副教授鉴定。
2 方法与结果
2.1 混合氨基酸对照品稀释溶液的制备
精密量取 2.5 mmol/L 氨基酸混合对照品溶液 1.0
mL，用 0.1 mol/L HCl 稀释至 2.5 mL，作为对照品
稀释液，4 ℃储存备用。
2.2 供试品溶液的制备
2.2.1 水解氨基酸供试品溶液的制备 取淡豆豉和
大豆样品适量，粉碎，过筛（100 目），混匀，经
石油醚脱脂，密封保存备用。精密称取样品 50 mg
置水解管中，加入 6 mol/L HCl 15 mL，充入高纯
氮气，在充氮气状态下封口。将已封口的水解管置
于 105 ℃的恒温干燥箱内水解 24 h，冷却，打开
水解管，转移至蒸发皿中，水洗残渣，合并水洗液，
滤过，45 ℃真空干燥至恒质量，用 0.1 mol/L 盐酸
溶解，并定容至 15 mL，0.45 μm 滤膜滤过，取续
滤液，备用。
2.2.2 游离氨基酸供试品溶液的制备 取淡豆豉和
大豆样品适量，粉碎，过筛（100 目），混匀，经石
油醚脱脂，密封保存备用。精密称取 100 mg 置烧
瓶中，加 0.1 mol/L 盐酸 10 mL，超声波处理 20 min，
12 000 r/min 低温离心 20 min，Millipore 超滤管滤过
除去蛋白等杂质，滤液经 45 ℃真空干燥至恒质量，
用 0.1 mol/L 盐酸溶解，并定容至 2 mL，0.45 μm 滤
膜滤过，取续滤液，备用。
2.3 柱前衍生化
精密移取 100 μL 对照品或供试品溶液，加入 1
mol/L三乙胺乙腈溶液 50 μL和 0.1 mol/L PITC乙腈
溶液 50 μL，涡旋摇匀，静置 1 h，加入正己烷 400 μL，
涡旋摇匀，静置10 min，去下层，再加正己烷400 μL，
涡旋摇匀，静置 10 min，吸取下层溶液作为两者待
测溶液，0.45 μm 滤膜滤过，取续滤液，备用。
2.4 色谱条件
色谱柱为 Thermo C18 柱（250 mm×4.6 mm，5
μm）；流动相 A： 50 mmol/L 醋酸钠 1 000 mL，加入
400 μL 三乙胺，用醋酸调至 pH 6.4；流动相 B：乙腈
-水（3∶2）；检测波长 254 nm；柱温 44 ℃；进样量
10 μL；流动相程序洗脱条件见表 1，色谱图见图 1。
表 1 流动相梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution of flow phase
时间 / min 流动相 A / % 流动相 B / % 体积流量 / (mL·min−1)
0 98.0 2.0 1.0
15 97.0 3.0 1.1
19 96.0 4.0 1.2
38 96.0 4.0 1.2
39 95.6 4.4 1.2
43 90.0 10.0 1.2
44 82.0 18.0 1.2
46 78.0 22.0 1.2
47 77.5 22.5 1.0
68 75.3 24.7 1.0
70 65.0 35.0 1.0
75 50.0 50.0 1.0
80 0.0 100.0 1.0
2.5 标准曲线的绘制
将 16 种混合氨基酸对照品溶液（浓度为 2.5
mmol/L）用 0.1 mol/L 盐酸依次稀释成 1.750、1.250、
0.825、0.544、0.359、0.156、0.103、0.031 mmol/L，
柱前衍生化后进样，记录色谱图。以每种氨基酸质
量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归
分析。结果 16 种氨基酸标准曲线均为线性曲线，r 在
0.997 9～0.999 3，在 0.031～1.750 mmol/L 氨基酸峰
面积与其质量浓度呈良好线性关系。结果见表 2。
2.6 精密度试验
精密吸取对照品稀释液 100 μL，经衍生化后连
续进样 6 次，16 种氨基酸峰面积的 RSD 在 0.93%～
1.68%。
2.7 重复性试验
平行制备 6 份淡豆豉水解供试品溶液，经衍生
化后进样，测定。16 种氨基酸峰面积的 RSD 在
1.46%～2.39%。
2.8 稳定性试验
取衍生后的淡豆豉水解供试品溶液，常温放置
0、3、9、18、28、36 h 后分别予以测定，结果 16
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1-Asp 2-Glu 3-Ser 4-Gly 5-His 6-Thr 7-Ala 8-Arg 9-Pro 10-Tyr 11-Val 12-Met 13-Ile 14-Leu 15-Phe 16-Lys
A-氨基酸混合对照品溶液 B-淡豆豉游离氨基酸供试液 C-大豆游离氨基酸供试液 D-淡豆豉水解氨基酸供试液 E-大豆水解氨基酸供试液
A-amino acids mixed reference solution B-free amino acids in SSP C-free amino acids in GM D-hydrolyzed amino acids in SSP E-hydrolyzed
amino acids in GM
图 1 氨基酸的 HPLC 色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of amino acids
表 2 16 种氨基酸的线性方程
Table 2 Linear equations of 16 kinds of amino acids
氨基酸 回归方程 相关系数
Asp Y＝1 035.6X－18.179 0.999 3
Glu Y＝1 334.0X＋19.423 0.998 6
Ser Y＝1 595.2X＋20.648 0.998 1
Gly Y＝1 843.9X－39.785 0.997 9
His Y＝1 565.5X－23.361 0.998 8
Thr Y＝1 436.5X－7.238 1 0.998 9
Ala Y＝1 674.0X－20.521 0.998 2
Arg Y＝1 615.8X－8.292 1 0.998 2
Pro Y＝2 005.3X－40.816 0.998 8
Tyr Y＝2 435.7X－44.406 0.998 9
Val Y＝2 202.4X－30.632 0.998 2
Met Y＝2 349.6X－27.019 0.998 5
Ile Y＝3 070.7X－68.333 0.998 6
Leu Y＝2 271.2X－15.967 0.998 4
Phe Y＝2 407.0X－42.420 0.998 3
Lys Y＝4 492.1X－72.672 0.998 3
种氨基酸的 RSD 为 1.12%～1.77%。
2.9 加样回收率试验
精密吸取已知质量浓度的淡豆豉水解供试品
溶液 50 μL 6 份，分别精密加入 50 μL 氨基酸对
照品稀释液，经衍生化后进样测定，计算回收率。
Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、
Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys 的平均回收
率分别为 101.00%、93.16%、99.48%、93.87%、
91.02%、97.60%、97.62%、100.94%、102.04%、
99.72%、95.10%、95.93%、95.91%、96.88%、
93.20%、100.80%；RSD 分别为 3.69%、1.47%、
3.93%、1.81%、1.88%、4.41%、4.81%、4.75%、
2.22%、1.66%、3.93%、3.49%、1.08%、3.34%、
2.42%、2.40%。
2.10 氨基酸的测定
精密吸取供试品溶液 3 份，按上述色谱条件测
定，外标法计算 16 种氨基酸的量，结果见表 3。
3 讨论
淡豆豉和大豆中均含有大量脂肪，不仅会使水
解液变浑浊，无法进行衍生化，而且游离的少量脂
肪酸会降低柱效，使柱压升高。
本实验分别进行了 15、20、40 min 的超声提取，
结果表明 20 min 时所测氨基酸质量分数最高，40
min 质量分数有所降低可能因为时间过长，部分氨
基酸被破坏。
配制流动相加醋酸及三乙胺时以及衍生过程中
的 PITC 乙腈溶液。由于量极少，样品中没有测到
胱氨酸。为保持样品稳定，必须 4 ℃密封保存，且
最多 3 d，最好是临用前配制。
本研究所建立的方法，各氨基酸衍生化后分离



0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
A B C
D E
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11
12 13 14
15
16
1
2
34 5 67
8 9 1011
12
13
14
15
16 1 2
3
4
5 6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
1 2
3
4
5 6 7 8
9
10
11
12 13
14
15
16
1 2 34
5 67 8
9 10
11
12 13
14
15
16
t / min
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表 3 16 种氨基酸的测定结果 (n＝3)
Table 3 Determination of 16 kinds of amino acids in different samples (n = 3)
质量分数 / (mg·g−1) 氨基酸 淡豆豉水解氨基酸 大豆水解氨基酸 淡豆豉游离氨基酸 大豆游离氨基酸
Asp 40.34 43.02 1.42 0.44
Glu 48.12 68.06 3.32 0.29
Ser 16.49 16.49 0.31 0.07
Gly 11.60 12.82 0.26 0.16
His 11.64 5.76 0.28 0.25
Thr 13.54 11.97 0.30 0.10
Ala 12.90 13.17 0.15 0.21
Arg 22.54 20.69 4.39 2.02
Pro 22.45 18.43 0.54 0.62
Tyr 17.01 11.17 1.06 0.35
Val 12.79 14.70 0.21 0.13
Met 10.09 4.26 0.23 0.09
Ile 11.44 8.86 0.21 0.10
Leu 20.30 22.10 0.33 0.12
Phe 19.73 15.90 0.45 0.08
Lys 19.55 17.37 0.59 0.18
良好，不仅相互之间无干扰，而且测定游离氨基酸
时，在干扰杂质很多的情况下也能较好分离，应用
性强。普通高效液相色谱仪和 C18 色谱柱即可完成
测试，易于分析实验室推广使用。
参考文献
[1] 中国药典 [S]. 一部. 2010.
[2] 杨 菁, 孙黎光, 白秀珍, 等. 异硫氰酸苯酯柱前衍生
化反相高效液相色谱法同时测定 18 种氨基酸 [J]. 色
谱, 2002, 20(4): 369-371.
[3] Schwarz E L, Roberts W L, Pasquali M. Analysis of
plasma amino acids by HPLC with photodiodearray and
fluorescence detection [J]. Clin Chim Acta, 2005,
354(1/2): 83-90.
[4] Battaglia A, Bertoluzza A, Calbucci F, et al.
High-performance liquid chromatographic analysis of
physiological amino acids in human brain tumors by
pre-column derivatization with phenylisothiocyanate [J].
J Chromatogr B, 1999, 730(1): 81-93.
[5] Hayakawa K, Hirano M, Yoshikawa K, et al. Separation of
phenylthiohydantoin-amino acids by temperaturecontrolled
reversed-phase high-performance liquid chromatography
[J]. J Chromatogr A, 1999, 846(1/2): 73-82.
[6] 梁 军, 夏永刚, 杨炳友, 等. 柱前衍生化-HPLC 法分
析麻黄多糖 ESP-B1 的单糖组成 [J]. 中草药, 2011,
42(10): 1985-1988.
[7] Persson B, Eaker D. An optimized procedure for the
separation of aminoacid phenylthiohydantoins by
reversed-phase HPLC [J]. J Biochem Biophys Methods,
1990, 21(4): 341-350.
[8] 刘有平, 张佳蕊, 邵 华, 等. 柱前衍生化 RP-HPLC
法测定地黄中葡萄糖、半乳糖和蜜二糖 [J]. 中草药,
2009, 40(6): 974-976.
[9] Gheshlaghi R, Scharer J M, Moo-Young M, et al.
Application of statistical design for the optimization of
amino acid separation by reverse-phase HPLC [J]. Anal
Biochem, 2008, 383(1): 93-102.
[10] Woo K L, Hwang Q C, Kim H S. Determination of amino
acids in the foods by reversed-phase high-performance liquid
chromatography with a new precolumn derivative,
butylthiocarbamyl amino acid, compared to the conventional
phenylthiocarbamyl derivatives and ion-exchange
chromatography [J]. J Chromatogr A, 1996, 740(1): 31-40.
[11] Hariharan M, Naga S, Van Noord T. Systematic approach
to the development of plasma amino acid analysis by
high-performance liquid chromatography with ultraviolet
detection with precolumn derivatization using phenyliso-
thiocyanate [J]. J Chromatogr, 1993, 621(1): 15-22.