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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
氧化苦参碱下调免疫细胞 TLR7 mRNA的表达
高小琪1 彭丽娜1 李力2 邱亚峰1 繆剑华2 徐永莉2 史子学1
邵东华1 魏建超1 马志永1
(1中国农业科学院上海兽医研究所公共卫生研究室，上海 200241;2广西壮族自治区药用植物园，南宁 530023)
摘 要: 为了探讨氧化苦参碱对免疫细胞 Toll-like receptor 7(TLR7)mRNA表达的影响，使用 CCK-8 试剂盒检测氧化苦
参碱对 RAW264. 7 细胞的生长抑制作用。应用荧光定量 PCR方法检测氧化苦参碱对 RAW264. 7 细胞 TLR7 mRNA及其下游
因子 TNF-α mRNA表达的影响;检测氧化苦参碱对小鼠脾脏淋巴细胞 TLR7 mRNA 及其下游因子 MyD88 、TRAF-6 mRNA 表
达的影响。结果显示，氧化苦参碱对 RAW264. 7 细胞的半数抑制率为 5. 9 mg /mL。氧化苦参碱下调 RAW264. 7 细胞 TLR7、
TNF-α mRNA表达;下调小鼠脾脏淋巴细胞 TLR7、MyD88、TRAF-6 mRNA表达。由此得出，氧化苦参碱可下调免疫细胞 TLR7
mRNA的表达。
关键词: 氧化苦参碱 TLR7 免疫细胞 荧光定量 PCR
Expression of TLR7 mRNA in Mouse Immunocytes
Down-regulated by Oxymatrine
Gao Xiaoqi1 Peng Lina1 Li Li2 Qiu Yafeng1 Miu Jianhua2 Xu Yongli2 Shi Zixue1
Shao Donghua1 Wei Jianchao1 Ma Zhiyong1
(1Department of Veterinary Public Health，Shanghai Veterinary Research Institute，Shanghai 200241;
2Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region，Nanning 530023)
Abstract: It was to evaluate the effect of oxymatrine on the transcription of toll-like receptor 7 (TLR7)in mouse immunocytes． Mu-
rine macrophages (RAW264. 7)were treated with oxymatrine at different concentrations ranging from 0. 63 mg /mL to 20 mg /mL. The ex-
pression of TLR7 and its downstream genes such as MyD88，TRAF-6 and TNF-α in the transcriptional level was determined by Real-
time PCR analysis． Treatment with oxymatrine resulted in the down-regulation of TLR7，MyD88，TRAF-6，TNF-α in mRNA level in
RAW264. 7 cells and splenic B lymphocytes． A significant decrease in the expression of TLR7 mRNA was observed in RAW264. 7 cells
from 3 h post treatment． The expression of TLR7，MyD88，TRAF-6 and TNF-α in mRNA level was detected in a dose-dependent manner
in splenic B lymphocytes． Therefore，it proved that oxymatrine，an anti-inflammatory and anti-apoptotic substance from a traditional chi-
nese medicine，was found to be effective in down-regulating the mRNA expression of TLR7，MyD88，TRAF-6 and TNF-α．
Key words: Oxymatrine Toll-like receptor 7 immunocytes Real-time PCR
收稿日期:2011-05-09
基金项目:2008 年广西自然科学基金重点项目(桂科自 08320152)
作者简介:高小琪，女，硕士研究生，研究方向:人兽共患病及兽医公共卫生学;E-mail:gaoxq1985@ 163． com
通讯作者:马志永，男，研究员，研究方向:人畜共患病;E-mail:zhiyongma@ shvri. ac. cn
李力，男，研究员，研究方向:药用动物学;E-mail:liboshi1963@ vip. 163. com
TLRs(toll-like receptors)是一大类模式识别受
体，分布于细胞膜表面和内噬体膜上，是宿主细胞识
别病原的特殊分子。TLR7［1］(toll-like receptor 7)是
分布于内噬体膜上的一种受体，主要识别内噬体中
的单链核酸。近期研究表明，TLR7 基因的过表达和
一些自身免疫性疾病的发生有重要关系［2，3］。减少
TLR7 基因的表达可以缓解自身免疫性疾病，而使
TLR7 基因过表达会使自身免疫性疾病的发生率提
高两倍［2］。目前治疗自身免疫性疾病主要通过造
血干细胞移植、耐受诱导、免疫抑制性等方法［4，5］。
2011 年第 11 期 高小琪等:氧化苦参碱下调免疫细胞 TLR7 mRNA的表达
这些方法虽然在治疗上取得了一定的疗效，但因其
毒副作用较大难以长期使用。中药因其毒性小、可
以长期使用的优点越来越受到人们的重视。据报道
氧化苦参碱具有免疫抑制的功效，可以下调 TNF-α
的表达［6］，而自身免疫性疾病的病理变化受到高表
达 TNF-α的影响，因此氧化苦参碱可能是治疗自身
免疫性疾病的一种中药成分。
为探讨氧化苦参碱对免疫细胞 TLR7 mRNA 及
其下游因子表达的影响，本试验拟用荧光定量 PCR
方法观察氧化苦参碱对 RAW264. 7 细胞 TLR7、
TNF-α mRNA表达的影响，对脾脏淋巴细胞中 TLR7
mRNA及其下游因子 MyD88、TRAF-6 mRNA 表达
的影响，从而确定氧化苦参碱下调 TLR7 mRNA 的
表达。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 试验细胞和试验动物 小鼠巨噬细胞
RAW264. 7 购自中国科学院上海细胞所。健康雄性
30 日龄 C57B /L6 小鼠由本实验室饲养。
1. 1. 2 主要试剂 DMEM、1640 培养基、胎牛血清
(FBS)、PBS均购于 GIBCO 公司;细胞刮铲购自 BD
FalconTM;RNA提取试剂盒(RNeasy Plus Mini Kit)购
自 QIAGEN公司;酶抑制剂、dNTP、Oligo(dT)、AMV
酶均购自 TaKaRa 公司;SYBR Premix Ex TaqTM购自
TaKaRa公司;Cell Couting Kit-8(CCK-8)购自日本
同仁化学研究所，小鼠淋巴细胞分离液购自易得公
司(EZ-SeqTM MOUSE)。氧化苦参碱购于上海同田
生物技术有限公司，HPLC 面积归一化法测定的纯
度为 98%以上。氧化苦参碱粉末溶解于 DMEM 培
养基，配制储存浓度为 40 mg /mL，0. 2 μm微孔滤膜
过滤除菌。
1. 2 方法
1. 2. 1 细胞培养与准备 RAW264. 7 细胞:培养于
含 10%灭活 FBS、100 KU /L 青霉素和 100 mg /L 链
霉素的 DMEM培养基中。待细胞密度达 90%左右
时，PBS清洗细胞 3 次，加入新鲜培养基，用细胞刮
铲轻轻将细胞刮下并吹散，置于 37℃、5% CO2的细
胞培养箱中培养，取对数生长期细胞用于试验研究。
脾脏淋巴细胞的分离:无菌条件下取 C57B /L6 小鼠
脾脏，研磨后用淋巴细胞分离液分离，用 10% FBS
的 1640 培养基重悬脾脏细胞，用于试验研究。
1. 2. 2 氧化苦参碱对 RAW264. 7 细胞的生长抑制
作用 取对数生长期的 RAW264. 7 细胞，以 5 × 104
的浓度接种于 96 孔板，每孔 200 μL。培养过夜后
吸弃培养基，并更换新鲜培养基。用氧化苦参碱处
理细胞，氧化苦参碱作用浓度分别为 20、10、5、2. 5、
1. 25、0. 625 和 0 mg /mL，每一个浓度设 3 个平行孔。
置于 37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养 24 h。24 h
后每孔加入 CCK-8 试剂 10 μL，避光培养 2 h 后，酶
标仪测定其吸光度(A)值，测定波长为 450 nm，以
相应的含药培养基组(无细胞)为调零孔(防止药物
本身有颜色或有氧化还原性)。根据改良寇式法计
算 IC50，公式为 lgIC50 = Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)。
其中 Xm为 lg 最大剂量;I 为 lg(最大剂量 /相临剂
量) ;P为阳性反应率之和;Pm 为最大阳性反应率;
Pn为最小阳性反应率。
1. 2. 3 荧光定量 PCR 取对数生长期 RAW264. 7
细胞，用含 10% 灭活 FBS、100 KU /L 青霉素和
100 mg /L 链霉素的 DMEM 培养基将 RAW264. 7 细
胞调整浓度至 3 × 105个 /mL，接种于 35 mm培养皿，
每个 2 mL。过夜培养后，弃去培养基，更换新鲜培
养基，并加入相应浓度的氧化苦参碱。对于脾脏淋
巴细胞，用含 10%灭活 FBS 的 1640 培养基将脾脏
淋巴细胞调整浓度至 3 × 106个 /mL，接种于 35 mm
培养皿，每个 2 mL，并加入相应浓度的氧化苦参碱
处理细胞。两种细胞都于设定的时间点弃去培养
基，PBS清洗细胞3次后，使用 QIAGEN公司的 RNeasy
Mini Handbook试剂盒提取 RNA，用紫外分光光度检测
RNA的纯度和含量。cDNA的合成:Oligo(dT)1 μL，
5 × AMV Buffer 4 μL，AMV 酶 1 μL，酶抑制剂 0. 5
μL，RNA 1 μg、RNase-free Water补齐至 20 μL。反应
程序:42℃ 60 min→75℃ 15 min→4℃ 10 min。
SYBR GreenⅠ定量 PCR采用 20 μL PCR体系。
2 × SYBR Green Mix 10 μL、10 μmol 上下游引物各
0. 4 μL (引物设计见表 1)、DNA 模板 2. 0 μL、
RNase-free Water:7. 8 μL，选用 actin 做内参。扩增
程序为:95℃ 2 min→95℃ 15 s→60℃ 1 min(40 个
循环) ，并加熔点曲线。数据分析采用相对定量
2 －△△CT法［7］，比较处理组和未处理组样品目标基因
之间的表达差异。本试验目的基因的扩增效率和内
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
参基因 actin 的扩增效率都在 95%左右，故可用相
对定量法。其计算公式为:
△△CT =(CtTarget － Ctactin)X －(CtTarget － Ctactin)Control
其中，X 表示任意组，Control 表示经 actin 校正
后 1 倍量的目标基因的表达。
1. 2. 4 统计学处理 采用 EXCEL 数据库录入数
据。试验数据组间差异比较采用 t 检验，P ＜ 0. 05
为差异显著，P ＜ 0. 01 为差异极显著。
表 1 引物序列
目的基因 正向引物(5 － 3) 反向引物(5 － 3)
TLR7 AGCTCAAAGGCTCTGCGAGT GAGTCAGAGATAGGCCAGGATCA
β-actin CCATCTACGAGGGCTAT TCACGCACGATTTCC
MyD88 ACTGGCCTGAGCAACTAGGA CGTGCCACTACCTGTAGCAA
TRAF-6 GCGCTGTGAAGTCTCTACCC GCTCGTGACCTCACTGATGA
TNF-α TTCTGTCTACTGAACTTCGGGGTGATCGGTCC GTATGAGATAGCAAATCGGCTGACGGTGTGGG
2 结果
2. 1 氧化苦参碱浓度对 RAW264. 7 细胞的生长抑
制作用
为了选择一个合适的浓度作用细胞，检测氧化
苦参碱对 RAW264. 7 细胞的半数抑制率，然后选取
一个 IC50 以下的药物作用浓度。结果(图 1)显示，
lgIC50 为 0. 772 7，则 IC50 为 5. 9 mg /mL。高剂量
的氧化苦参碱对 RAW264. 7 细胞的抑制作用较强，
抑制程度与氧化苦参碱的浓度呈剂量依赖性。当氧
化苦参碱浓度为 20 mg /mL时，抑制率达到 96. 99%，
当浓度为 0. 63 mg /mL时，抑制率为 0. 52%。
图 1 氧化苦参碱对 RAW264. 7 细胞的生长抑制作用
2. 2 氧化苦参碱的作用时间对 RAW264. 7 细胞
TLR7 mRNA表达的影响
为探索氧化苦参碱对 RAW264. 7 细胞 TLR7
mRNA表达的影响，选用 100 μg /mL 的氧化苦参碱
来作用细胞，分别于 3、6、12 和 24 h 收取细胞样品。
应用荧光定量 PCR技术检测 TLR7 mRNA的表达水
平。试验结果(图 2)显示，TLR7 mRNA的表达水平
在氧化苦参碱作用 3、6、12 h 后与对照相比显著降
低，24 h后 TLR7 mRNA 的表达水平与对照相比有
所增加。推测其可能与氧化苦参碱药物浓度降低
有关。
＊＊表示差异极显著 P ＜ 0. 01
图 2 氧化苦参碱对 RAW264. 7 细胞
TLR7 mRNA表达的影响
2. 3 氧化苦参碱对 RAW264. 7 细胞 TNF-α mRNA
表达的影响
为进一步确定氧化苦参碱下调 TLR7基因的作用，
使用 TLR7的特异性阳性刺激物 R837(1 μg /mL)［8］作
用 RAW264. 7 细胞，并设置 mock 组。RAW264. 7
细胞用 R837 刺激 24 h后加入浓度为 100 μg /mL的
氧化苦参碱，于 6 h 后收取细胞样品。结果(图 3)
显示，RAW264. 7 细胞经 R837 刺激后，TLR7 信号通
路被激活，TNF-α mRNA的表达水平与 mock组比较
上调近 3 倍;R837 和氧化苦参碱联合用药组 TNF-α
mRNA的表达量与 R837 组相比明显降低。
2. 4 氧化苦参碱对小鼠脾脏淋巴细胞 TLR7 mRNA，
MyD88 mRNA，TRAF-6 mRNA表达的影响
在小鼠巨噬细胞 RAW264. 7细胞中，我们发现氧
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2011 年第 11 期 高小琪等:氧化苦参碱下调免疫细胞 TLR7 mRNA的表达
化苦参碱可以下调 TLR7 mRNA 的表达。为进一步
探讨氧化苦参碱对免疫细胞 TLR7 mRNA 表达的影
响，选择高表达 TLR7 基因的脾脏淋巴细胞做进一步
的试验。用浓度为 100 μg /mL和 500 μg /mL的氧化
苦参碱分别作用细胞，于 12 h 收取细胞样品。使用
荧光定量 PCR 方法检测 TLR7、MyD88、TRAF-6 mR-
NA的表达。试验结果(图 4，图 5)表明，氧化苦参碱
可以下调脾脏细胞 TLR7、MyD88、TRAF-6mRNA表达
水平，且下调作用具有剂量依赖性。
＊＊表示差异极显著
图 3 氧化苦参碱对 RAW264. 7 TNF-α
mRNA表达的影响
＊＊表示差异极显著(P ＜ 0. 01)
图 4 氧化苦参碱对小鼠脾脏淋巴细胞
TLR7 mRNA表达的影响
＊＊表示差异极显著(P ＜ 0. 01)
图 5 氧化苦参碱对小鼠脾脏淋巴细胞 MyD88 及
TRAF-6 mRNA表达的影响
3 讨论
氧化苦参碱是从豆科属植物苦参或平科植物广
豆根中分离出来的生物碱。文献报道氧化苦参碱具
有抗炎、抗病毒和抗氧化等多方面作用［9，10］。氧化
苦参碱的免疫调节作用也越来越受到重视，它可以
下调 TLR4、TLR2、MyD88 和 NF-kappaB 的表达［11］，
可以使大脑组织免受中脑动脉闭塞所带来的损伤。
本研究氧化苦参碱对 TLR7 mRNA 表达的影响，寻
找治疗自身免疫性疾病的中药成分。
TLR7 介导的信号通路为 MyD88 依赖性信号通
路，TLR7 识别相应的配体后，招募和活化 MyD88，
MyD88 活化后招募 IRAK使其磷酸化，活化的 IRAK
招募和活化 TRAF-6，经过一系列反应最终激活 NF-
kB 信号传递途径，产生 TNF-α 等细胞因子［1］。本
试验中氧化苦参碱下调 TLR7 mRNA，并可能通过
TLR7 下调其下游信号分子 MyD88 mRNA、TRAF-6
mRNA的表达。氧化苦参碱可下调阳性刺激物作用
的 RAW264. 7 细胞中 TNF-α mRNA的表达。
本试验证明氧化苦参碱在 3、6、12 和 24 h 下调
RAW264. 7 细胞 TLR7 mRNA的表达水平，且在 12 h
下调作用最为明显;下调小鼠脾脏淋巴细胞中 TLR7
mRNA的表达具有剂量依赖性，下调 TLR7 下游因
子 MyD88、TRAF-6 mRNA 的表达水平也具有剂量
依赖性。TLR7 主要与全身性自身免疫性疾病的发
生有关，氧化苦参碱作为治疗自身免疫性疾病的中
药成份具有开发前景。目前，有关应用氧化苦参碱
下调 TLR7 mRNA表达水平来治疗自身免疫性疾病
的研究还处于理论研究阶段，其作用机制还有待于
进一步研究。相信随着后期研究的不断深入，会为
人类治疗自身免疫性疾病带来新的思路。
4 结论
本研究发现氧化苦参碱处理可下调细胞中
TLR7 mRNA的表达，下调其下游分子 MyD88 mR-
NA、TRAF-6 mRNA、TNF-α 的表达。上述研究表明
氧化苦参碱的免疫抑制作用可能与调节 TLR7 及其
下游分子表达有关。
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