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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
杜氏盐藻 GAPDH cDNA的克隆鉴定及其
启动子功能表达载体的构建
贾岩龙1，2 牛杰3 贾俊英4 邱乐乐3 薛乐勋2
(1新乡医学院药学院药理学教研室，新乡 453003;2郑州大学医学院细胞生物学研究室，郑州 450052;
3新乡医学院基础医学院形态学实验室，新乡 453003;4新乡医学院三附院眼科，新乡 453003 )
摘 要: 根据藻类甘油醛 3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)氨基酸高度保守序列设计简
并引物，采用 5，3-RACE和巢式 PCR 的方法，得到了杜氏盐藻(Dunaliella salina)GAPDH cDNA 全长序列。序列同源性比较
和进化树等生物信息学分析结果表明，根据获得的盐藻 GAPDH的核酸序列推导的氨基酸序列与其他已知物种的 GAPDH 有
较高的同源性。定向克隆于原核表达载体的盐藻 GAPDH cDNA在大肠杆菌中以融合蛋白的形式得到了高效表达，并成功构
建了由盐藻 GAPDH基因启动子驱动的 cat(氯霉素乙酰转移酶)基因表达载体 pUCGCat，为进一步研究杜氏盐藻 GAPDH基因
和启动子功能奠定了试验基础。
关键词: 杜氏盐藻 甘油醛 3-磷酸脱氢酶 cDNA 启动子
Identification of GAPDH Gene from Halotolerant Alga Dunaliella
salina and Construction of Expression Vector Driven by Its Promoter
Jia Yanlong1，2 Niu Jie3 Jia Junying4 Qiu Lele3 Xue Lexun2
(1Pharmacy College，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003;
2Laboratory for Cell Biology，Zhengzhou University Medical College，Zhengzhou 450052;
3Morphological Laboratory，School of Basic Medicine，Xinxiang Medical College，Xinxiang 453003;
4Department of Ophthalmology，the Third Affiliated Hospital，Xinxiang Medical College，Xinxiang 453003)
Abstract: Increasing evidence suggests that glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)plays diverse activities such as
energy production，apoptosis and microtubule assembly in mammalian and plants． Despite its importance，there is little information avail-
able about the GAPDH gene in the halotolerant，unicellular green alga Dunaliella salina． To understand and elucidate the function of D．
salina GAPDH，a GAPDH cDNA was identified from D． salina by 5，3 rapid amplification cDNA of end(RACE)and nested PCR． The
cloned D． salina GAPDH gene(1 394 bp)had an open reading frame of 1 128 bp encoding 376 amino acid residues． Analysis of bioin-
formatics revealed that it shared high homology with that of other organisms． The full-length cDNA of D． salina GAPDH was heterolo-
gously expressed in E． coli as a fusion protein． Furthermore，in order to identify promoter activity of the 5 flanking region of D． salina
GAPDH，expression vector pUCGCat containing the GAPDH promoter of D． salina and the coding sequence of the cat gene was success-
fully constructed． The results reveal that the cloned sequence is a GAPDH cDNA from D． salina and the findings are useful for further
functional study of the GAPDH gene in D． salina．
Key words: Dunaliella salina Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) cDNA Promoter
收稿日期:2011-01-14
作者简介:贾岩龙，男，博士，讲师，研究方向:肿瘤与生物工程;E-mail:yanlongjia@ 126. com
杜氏盐藻(Dunaliella salina)是一种单细胞无细
胞壁、耐盐、具双边毛能游动的、光合自养真核绿
藻［1］。盐藻简单的细胞结构、极其耐盐的性质、易
培养和遗传操作简便的特点，有望使盐藻成为继细
菌、植物、动物之后的新型藻类生物反应器。转基因
杜氏盐藻可用于口服疫苗、药用蛋白等高价值蛋白
2011 年第 7 期 贾岩龙等:杜氏盐藻 GAPDH cDNA的克隆鉴定及其启动子功能表达载体的构建
的生物合成［2，3］;也可作为重要的模式生物用于研
究耐盐、鞭毛结构与功能等分子机制［4，5］。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phos-
phate dehydrogenase，GAPDH)是糖酵解过程中的关
键酶，由于参与了细胞的基本代谢过程，它被认为是
一种看家基因。通常作为一种模式蛋白用于蛋白和
酶的研究分析，也可以用作研究基因表达量的内在
对照。酵母中 GAPDH占可溶性蛋白的 5%，其 mR-
NA也达到了总 RNA 的 2% － 5%［6，7］，这些结果表
明 GAPDH基因的表达是由一个高活性的启动子调
控的。在酵母［8，9］、丝状真菌［10，11］和蘑菇［12］等转基
因研究中，GAPDH基因的 5端调控序列已作为一个
强的启动子元件用于外源基因高效表达。许多研究
结果表明，GAPDH在动植物的能量产生、细胞凋亡、
微管组装等过程中起重要作用［13，14］。
相比之下，藻类 GAPDH 相关研究甚少。例如，
衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)鞭毛蛋白质组含有
GAPDH等糖酵解途径中几乎所有的酶类［15］。杜氏
盐藻鞭毛蛋白质组学分析结果表明，GAPDH可能是
杜氏盐藻鞭毛组分并在鞭毛的组装和运动中起重要
作用［5］。因此，盐藻 GAPDH 基因的克隆和功能鉴
定对于进一步研究其在盐藻鞭毛中的定位、功能和
相互作用具有重要的意义。
因此，本研究首先克隆并鉴定了杜氏盐藻的
GAPDH cDNA 序列，随后将其 cDNA 全长以融合蛋
白的形式在 E. coli中进行原核表达分析。为进一步
验证盐藻 GAPDH 5端调控序列的启动子活性，构
建真核表达载体 pUCGCat(由盐藻 GAPDH 启动子
驱动氯霉素抗性基因 cat表达) ，以期为转基因盐藻
提供一个内源性的、强启动子表达元件。
1 材料与方法
1. 1 藻株和培养基
杜氏盐藻藻株 UTEX-LB-1644 购自美国德州大
学藻种库(the Culture Collection of Algae at the Uni-
versity of Texas，USA)。盐藻细胞在本实验室用改良
的培养基进行培养［5］。
1. 2 杜氏盐藻 GAPDH基因的克隆和鉴定
采用 RT-PCR 克隆盐藻 GAPDH cDNA 全长序
列［16］。将 PCR产物目的片段胶回收纯化、连接到
pMD18-T并转化 E. coli JM109。挑取 3 个阳性克隆
分别进行测序。将 DNA序列和推导的氨基酸残基序
列在 NCBI上进行 BLAST和多序列比对等生物信息学
分析(http:/ /www. ncbi. nlm. nih. gov /blast /Blast. cgi)。
1. 3 杜氏盐藻 GAPDH基因原核表达分析
将杜氏盐藻的 GAPDH cDNA 编码序列定向克
隆于原核表达载体 pET-28a(+) (Novagen)中构建
重组载体 pET28a(+)-GAPDH。将经筛选鉴定正
确的重组质粒转化 E coli BL21。转化菌株在 37℃，
IPTG(0. 8 mmol /L)诱导培养 5 h 后，提取总蛋白用
SDS-PAGE方法分析 GAPDH 融合蛋白在大肠杆菌
BL21 中的表达情况。同时以含载体 pET-28a(+)
的菌株以及未诱导的带 pET28a(+)-GAPDH 的菌
株作为对照。
1. 4 真核表达载体的构建 pUCGCat
转化后鉴定正确的重组质粒命名为 pUC19-
GBN。为鉴定已克隆的杜氏盐藻 GAPDH 5端调控
序列(GenBank No. FJ623388)的启动子活性，本研
究构建了真核表达载体 pUCGCat(含有盐藻 GAPDH
启动子 －氯霉素抗性基因 catJ －终止子NOS表达盒)
(图 1)。具体方法和步骤如下:设计合成一对引物
GF (5-CCCAAGCTTCGCTCGCTGGTCGTGTACAATG-
3，含有 Hind III 酶切位点)和 GR(5-TGCTCTA-
GATTCGCTGGCCGAGCTAAATTA-3，含有 Xba I 酶切
位点) ，PCR方法扩增 GAPDH 基因上游约 1. 3 kb 启
动子片段，并将其克隆到载体 pUC19(TaKaRa)Hind
III － Xba I 位点上，得到中间载体 pUC19-G。设计引
物 CatF(5-TGCTCTAGATGGAGAAAAAAATCACTGG-
3，含 有 Xba I 酶 切 位 点)和 CatR (5-TC-
CCCCGGGTTACGCCCCGCCCTGCCAC-3，含有 Sma I
酶 切 位 点) ;NosF (5-TCCCCCGGGCCGATCGT-
TCAAACATTTG-3，含有 Sma I 酶切位点)和 NosR
(5-CAATGAGCTCCCGATCTAGTAACATA-3，含 有
Sac I酶切位点)分别扩增氯霉素抗性基因 cat和胭脂
图 1 表达载体 pUCGCat构建示意图
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碱合成酶基因的终止子序列 NOS polyA，并依次与
载体 pUC19-G 进行连接。构建过程中中间载体用
相应双酶切和电泳的方法进行鉴定。转化后鉴定正
确的重组质粒命名为 pUCGCat。
2 结果与讨论
2. 1 杜氏盐藻 GAPDH基因的克隆和鉴定分析
序列测定结果和分析比较结果表明，杜氏盐藻
GAPDH基因 cDNA全长 1 394 bp，包括 30 bp 的 5
UTR、266 bp的 3UTR以及 1 128 bp的开放阅读框
(open reading frame，ORF)。序列的 NCBI GenBank
登录号为 EU447774。将推导得到的杜氏盐藻 GAP-
DH氨基酸序列(共 376 个氨基酸残基)与其它藻类
或生物的 GAPDH 氨基酸序列进行同源性分析。
BLAST结果(图 2)和进化树(图 3)分析显示，其氨
基酸序列与已知的其他物种特别是藻类的 GAPDH
有较高的同源性，例如，D. viridis(ABC00187. 1)
94%，Scenedesmus vacuolatus(Q8VXQ9)83%，Chlo-
rella sp. JP-2005(ABD37953. 1)81%，C. incerta(AB-
图 2 推导的杜氏盐藻 GAPDH氨基酸序列及其同源性比较
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2011 年第 7 期 贾岩龙等:杜氏盐藻 GAPDH cDNA的克隆鉴定及其启动子功能表达载体的构建
D. viridis(ABC00187. 1) ，Scenedesmus vacuolatus (Q8VXQ9) ，Chlorella sp. JP-2005 (ABD37953. 1) ，Chlamydomonas sp． W80
(BAA94304. 1) ，C. incerta (ABA01125. 1) ，C. reinhardtii (XP_001689871. 1) ，Ostreococcus‘lucimarinus’(ABG85190. 1) ，Ostreococcus
tauri (CAL56310. 1) ，Mesostigma viride(ABD37961. 1) ，Cyanophora paradoxa(ABD37954. 1) ，Chlorokybus atmophyticus(ABD37959. 1) ，
Chara vulgaris(CAC80378. 2) ，Coleochaete scutata(CAC80390. 1) ，Spirogyra sp. (CAC80392. 1) ，Glycine max (ABA86963. 1) ，Nicotiana
tabacum(P09044) ，Capsicum annuum(CAC80374. 1) ，Pisum sativum(P12858) ，Arabidopsis thaliana(NP_566796. 2) ，Spinacia oleracea
(P19866) ，Oryza sativa(japonica cultivar-group) (NP _001052984. 1) ，Marchantia polymorpha(ABK00053. 1) ，Sphagnum cuspidatum
(CAC80393. 1) ，Physcomitrella patens(ABD37962. 1) ，Zea mays(NP_001105414. 1) ，Pinus sylvestris(AAA33780. 1) ，Klebsormidium flac-
cidum(CAC80391. 2) ，Scherffelia dubia(ABD37955. 1) ，Cladophora rupestris(ABD37957. 1)
图 3 杜氏盐藻和不同生物来源 GAPDH基因进化树分析
A01125. 1)80%，C. reinhardtii(XP _ 001689871. 1)
79%，Chamydomonas sp. W80 (BAA94304. 1)77%，
Ostreococcus tauri (CAL56310. 1)74%。其序列中存
在有高度保守的 GAPDH活性位点“ASCTTNCL”［17］。
以上结果表明，所克隆的序列是杜氏盐藻的 GAPDH
基因序列。
2. 2 盐藻 GAPDH融合蛋白经 IPTG诱导表达结果
如图 4 所示，经 IPTG 诱导后，pET28a(+ )-
GAPDH在约 43. 0 kD出现一条特异性条带;未经诱
导的 pET28a(+)-GAPDH 细菌的特异性条带不明
显;空载体 pET-28a(+)在其相同位置未见相应蛋
白表达。并且诱导表达的 GAPDH 是以包涵体的形
式存在。试验结果表明，本研究所克隆的序列为完
整的盐藻 GAPDH编码序列。由于所表达的蛋白与
6 个组氨酸标签形成融合蛋白，其大小比推导的理
论分子量(40. 27 kD)略大一些。
2. 3 真核表达载体 pUCGCat的构建及鉴定
为验证盐藻 GAPDH 5侧翼区的启动子活性，
构建真核表达载体 pUCGCat。最终构建好的质粒经
Sma I和 Xho I双酶切鉴定如图 5 所示，所构建的质
粒包含一个 3. 0 kb 的线性载体条带和一个预期大
小的条带(GAPDH 启动子 + cat 筛选标记基因，2. 0
kb)。测序结果也显示表达载体 pUCGCat 成功构
建，可用于下一步的转化、筛选和启动子活性鉴定。
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1，2. 空载体 pET-28a(+)经 IPTG 诱导前后;3，4. 重组
质粒 pET28a(+)-GAPDH经 IPTG诱导前后;5. 细菌裂
解液上清;6. 细菌裂解液沉淀;M．标准蛋白分子量
图 4 杜氏盐藻 GAPDH基因在大肠杆菌 BL21 中
表达的 SDS-PAGE电泳结果
M． DNA Marker;1． pUCGCat质粒;2． Sma Ⅰ /Xho Ⅰ双酶切
图 5 pUCGCat载体双酶切鉴定结果
3 结论
综上所述，本研究成功克隆并鉴定了杜氏盐藻
GAPDH基因。相关序列比对和进化树分析等生物
信息学结果表明，盐藻与其他生物特别是藻类 GAP-
DH基因有很高的同源性，并含有该基因保守的活性
位点(ASCTTNCL)。本研究还成功构建了由盐藻
GAPDH启动子驱动氯霉素抗性基因 cat 表达的载体
pUCGCat。以上结果为进一步分析 GAPDH基因及其
5侧翼区在盐藻中的功能研究奠定了试验基础。
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(责任编辑 李楠)
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