全 文 ：健物技术通报
技 术 与 方 法 石沙口2万C 日脚口乙口 G Y B U 乙L E 1 2N 2 O( )9 年 增 刊
利用模拟纳米微环境的反胶束法结合圆二色技术
研究蛋白质的结构和反应动力学
徐建华 高愈希 陶冶
(中国科学院高能物理研究所,北京 lxx 9)
摘 要: 简要 阐明了构成纳米徽环境的反胶束的工作原理 ,强调其可以模拟细胞中纳米尺度空间的特点 ,以三种基础蛋
白质:健磷脂蛋白 溶菌璐和细胞色紊C 为例 , 简单介绍利用圈二色技术浏试它们在反胶束中的结构变化和反应动力学
关健词: 纳米徽环境 反胶束 团二色 蛋白质结构 反应动力学
A P P ly th e R ev erse M icelle of M od eling N a n o一m icro en vi ro nm en t to
S tu d y P ro te in S tru ctu re a n d D y na 而 cs o f R ea etio n C o m b in ed wi th
C ireul a r D ICh ro ism
X u Jiar 山ua 己ao y 明 Tao Y e
(2触 Ins ti 吹 of H妙 召能哪 of 伟如, ch ine se Ac 诚 my of 友衍nc es , Be ij呷 10 04 9)
A bst aCt : T he w orki ng princ iP le of reveoe 而celes w hi ch C O 15 t r U C t n an o 一mi cr oe阴 ro nZ en t 15 bri e日y descri bed in th e P aPer
bas ed o n
des cri be
, om e litera 幻uresAn d their 倪atUr es ofm odelin g na o一size sP ac e in biologi cal eels are sP eei山y em Phas ized.In addi tion , w e also
using cireu lar di ehroism te eh ni qu e to th e stru ctu 司 eh ange s an d d yn am ics o f thr ee bas ic Proteins like m 产 lin , lys o Zy m e
an d Cyt oehr o m e C .
K e y w o rd s : N ano一nu cro en vi ro nz ent
l e 韶 U 比
R e v e rs e 而 eelie C ireu ar di ch ro ism P rotein stru etu re D yn洲 es of 二aetion
在蛋白质结构 功能和反应动力学研究中 ,人
们一般只考虑三种参量 ,即反应物的浓度 ,反应发
生的温度以及测试的时间分辨 另外两个重要因
素 ,蛋白质所处微小空间的尺度及在微小空间内水
分子的行为则往往被忽略 原因可能是在实验中难
以对这两个因素进行量化掌控 ,例如 :如何调试小
空间的尺度 微环境中的水分子数量及其物理化学
性质等等1. 2] 但事实是 ,蛋白质所有的活动几乎都
发生在细胞内纳米尺度的含水微环境中 这些受限
的水分子和蛋白质形成有序而紧致的结构 ,对蛋白
结构的稳定起着重要的作用13 ,此外 ,在蛋白质的
特异/非特异相互作用如 :酶反应 配位识别 抗原-
抗体结合及大分子寡聚结合等许多生物反应活动
过程中 , 空间尺度及其中的水分子也非常重要l4]
实验证明生物大分子在纳米微环境 内的反应与稀
释溶液中的生化反应完全不同:有时在前者情况下
发生的反应并不在后者发生 l5] 显然 ,细胞内的微
环境可以改变分子的化学行为
早在 194 3 年 ,物理学家就注意到反胶束 (R e-
ve I se m ic el e )l6] 反胶束又称 油包水 ,是表面活性
剂在非极性的有机介质中形成的与正常胶束结构
相反的纳米尺度的球状含水聚集体 ,属热力学稳定
体系 ,其空间尺度仅与水与表面活性剂的摩尔比相
关 实验时可以通过控制水与表面活性剂的比例精
确控制胶束内空间大小 ,即小胶球内水分含量的多
少 纳米尺度的反胶束是光学透明的 ,大分子可以
收稿 日期:2以为一03 一10
基金项目:国家 自然基金委资助 (20 871 116)
作者简介 :徐建华(1% 5一),女 ,副研究员 ,博士 ,研究方向:同步辐射应用
132 性物杖术通稚 刀勿翻动彻城盯 2 O( 为 年 增 刊
进人球内 ,发生各种化学反应 ,因而是一种 比较理
想的细胞内微环境模拟方法17. 81 ,吸引了生物物理
生物化学等各个领域的科学家用该方法对蛋白质
的结构和反应动力学展开研究
目前 , 蛋白质结构的研究技术主要有 x一射线
衍射 核磁共振 国二色技术等 X一射线衍射可以
得到精确的蛋白质三维结构 ,但该技术要求有质量
较好的晶体 ;核磁共振不需结晶 ,可在溶液状态下
测盘 ,但只适用于小分子蛋白 (< 30 kD a) ,需要同
位素标定 ,耗时较长 相对来说 ,圆二色的应用条件
比较宽松 ,可在快速变化的时间尺度上研究溶液中
蛋白折盛过程 ,是研究蛋白质构象和反应动力学的
理想工具 19 其缺点是获得的结构信息分辨率低
近年发展起来的以同步辐射为光源的圆二色谱弥
补了以上不足 ,提高了估测精度 ,并可获得远紫外
区域的分子结构信息 ,大大拓展了观测蛋白质结构
的范围 ,因而得到迅速发展
目前 , 世界上已有近 10 台搭建好的同步辐射
圆二色散谱仪投入使用 , 例如美国的 Bro khav en
National 血bo rat o口 ( BN L );英国的 D are sb呵 syn-
ehro tI O n Ra diation So urc e ( D SRS ):丹麦的 Aath us
Storag e R ing ( A STR ID ); 中国的 Beijing S chrotro n
R ad iation Fa eility ( BRSF) 和 U nivers ity of Sc ienee
an d Te chnolo盯 of China ( U ST C ): 德国的 Berl in
Eleetro n Sto 哪 e R i飞 Com pany fo r 即nehro tIO n R adi-
ation ( BE SSY ); 巴西 的 Cam pinas National Syn-
ehro tro n U ght u 比ra to 叮 ( LN 比 ): 日本的 H iro shi-
m a 勿nc h功 tro n Ra diat ion Ceni er ( H ISO R )
1 反胶束的组成及工作原理介绍
反胶束系统由三种成分构成:有机溶剂 ,如异
辛烷 ;由亲水基团和疏水基团构成的表面活性剂如
A or ;被表面活性剂包裹在内的水分子 (图 1) 束
缚水的物化性质不同于体相水 反胶束因其具备三
个特点而引起人们的很大兴趣 ,第一 ,可以根据蛋
白质的大小及反应的需要通过改变水与表面活性
剂的比例(W )精确调控胶束内微小空间的尺度 ,
即
W O= 水1 [表面活性剂]
常用的 W 范围是 0一70 12 第二 ,这些纳米尺度的
胶束聚集体热力学稳定 ,光学透明 ,很适合各种光
学手段如圆二色技术检测 ;第三 ,反胶束系统与外
面的介质间有物质交换 ,大分子可以进入胶束内发
生反应 ,且速度十分快捷 ,在纳秒和微秒量级之间
川
圈 , 反胶束示意圈
(a )平面结构图:外围的表面活性剂极性头部基团紧靠束缚水;碳
水化合物尾端则紧邻有机溶剂和胶囊末端 (Lu is et al . 19 8 )
试b) 立体结构图:为表面活性剂极性头部基团及胶束内部断面 黄
色小球 为带相反电荷的离子残基; 蓝色小球为表面活性剂极性
头部基团
在胶束内 ,胶束壁 封装水和蛋白质之间有微
细的相互作用 , 影响到蛋白质在胶束中的溶解度
水可与表面活性剂的极性部分相互作用形成六水
合钠离子 ,或氢键 ,产生所谓的束缚水层 l0] 水与表
面活性剂摩尔比 W O 低时 ,紧邻大分子表面的一二
层水分子与活性剂分子头部极性基团 蛋白分子发
生竞争性反应 可使蛋白分子如内膜蛋白 M BP 在
反胶束中溶解度明显增加lI] , (图 2a )当 w o二5.5 时
溶解度达到最高点 ,因为此时所有水分子与活性剂
分子极性头部基团紧密相连 ,胶束内水核半径小于
M BP 的水力半径 ;W O 大于 5.5 时 ,溶解度则大幅下
降 M BP 并未如人们预期的那样 ,在蛋白尺度胶束
(W O二12) 内表现最大溶解度 溶菌酶也有类似的现
象 ,在 W O=7.0 时溶解度最大 Ni co t认为产生这种
现象是由于临界水来自离子基团强的静电场 ,这类
水具有许多不同于体相水的物理化学特征l2] 相比
之下 , 在无离子表面活性剂中的 M BP 的溶解性下
降 ,最大溶解度移向较高的 W o 值(图 2b ) 有趣的
是 , Chat enay 通过动力学光散射实验证明 , 蛋白质
捡起 大约 3 个较小尺度的胶束来建造一个适合
2 X 旧 年 增 刊
徐建华等:利用模拟纳米微环境的反胶束法结合
圆二色技术研究蛋白质的结构和反应动力学 133
其反应的大腔体I切这说明蛋白质并不是完全被动
地受制于反胶束 ,而是能主动地参与适合其居住空
间的建设
髓磷脂蛋白(M B P )在反胶束中折叠变化的研
究很有代表性 2] 它是中枢神经中高度特化的多层
髓磷脂膜蛋白 ,在稀释溶液中构象变化大 ,有序区
域少l6]
,jl..勿互
舟 ,尽 八 r 1 一 {尹飞):迈1 J
圈Z M B P 在反胶束 衰面活性荆/异辛烷/水 )中的
溶解曲线
所有的浓度经由 278nm 处 的光吸收测得 曲线 A 中 ,表面活性剂
是 50m M 的 A aT (sod ium bis (2一et hylhexr l) sulfo su eeinat e);曲线 B
中活性剂则是 lo lnA 的 te trae 而len e 砂yc ol ~ 一n-d记忱 yl eth er
( N ikkol , 1985 )W o 二7 5
圈 3 M B p 的回二色诺
(a )M B P 在水 中(一 )和反胶束 AOT 中 (一)的远紫外圆二色谱
W 二5. 6 胶束浓度 50m M 每条曲线代表 5 次测试的平均值
(b )水与胶束溶液的光谱差异计算值(Ni co t, 19 85 )
束缚水的介电常数是另外一个引起构像变化
的参数 普遍认为 , W O < ro 时 ,封装水的介电常数
和极性大大低于稀释水 ,低介电常数会增强氢键和
静电作用力ll] ,从而影响蛋白结构 换言之 ,体相水
与蛋白表面的相互作用对蛋白折叠起反作用 ,因此
稀释状态水溶液更适合非折叠状态的大分子阴;而
在束缚水中 ,水分子的作用力可以使展开的肤链重
新折登起来
由于反胶束是透明的 ,所有的溶液生化研究技
术尤其是光谱都可以使用 对于蛋白构象的研究 ,
圆二色是一个有效的测试工具 商用圆二色可以测
试的范围是 250一2加nm ,作者所在单位的同步辐射
圆二色可将测试范围拓展到 160 一26() nm ,且因光源
亮度强 ,测试信噪比和分辨率均大大好于商用圆二
色谱仪
2 反胶束中蛋白动力学研究回顾
近二十年来 ,随着反胶束法及各种光谱技术的
发展 ,先后有十几种蛋白的结构动力学得到较为详
尽的研究1,8l 其中 ,三种基础蛋白:髓磷脂蛋白 溶
菌酶和细胞色素 C 最具代表性 ,下面简单介绍这三
种典型蛋白在反胶束微环境中的折叠效应
2.1 健礴脂蛋 白
用远紫外圆二色谱(25 0一190n m )研究水溶液和
胶束中 M BP 的构象变化也得到类似结论 , 见图 3
溶液中测得谱线在 198lun 和 222nm 时表
现两个负向波峰 ,峰值分别是一117 0 和一巧o (单
位 :de g.cm Zl de ci mo le ,以下同 );而胶束谱线的两个
峰值则位于 205lun 和 222nm , 椭圆度分别是一61 0
和一40( 刃; 这表 明在反胶 束 中有 一个从 198 到
20 5nl 的位移 ,并且负向峰值差异很大(见图 4B 表
示溶液和胶束状态下 M BP 圆二色值的计算方差 )
位于 222nm 的负向峰说明有 a 螺旋 ; 但在 208nm
附近缺少明显的第二个峰 , 可能存在 p 折叠和 日
转角l7]
M BP 随 A OT 浓度变化 (25 一lo m M )的测试表
明 ,其谱线不受活性剂浓度的影响 ,在 W 二2一
22. 4 时蛋白质的结构都很稳定 (图 4 ) 该项实验同
时被 Su re w ic z 证实l8] 这说明 M BP 的构像与系统内
水分含量无关 但改变活性剂 ,则溶液浓度可导致
M B P 的圆二色谱变化 ,只是变化较小(21
2. 2 溶 菌酶
溶菌酶 (pl二11) 的活性位点位于分子表面裂隙
内 ,将酶分子分成两个圆裂片 ,在活性位点裂隙的
两侧有绞链型结构 ,可供开关 19j 打开活性位点裂
隙 ,会降低催化活性 ,导致光学活性降低
C randi 用 圆二色检测溶菌酶在 0. 05 M AO T 反
134 吐物技术通报刀勿. 动彻匆盯 B u山 冰 2以为 年 增 刊
厂
橄坐标为A or 浓度 蛋白质的溶解度(百分比)是溶解的蛋白质
与称t 蛋 白质之比
胶束中的动力学变化Il] 在远紫外区域 ,椭圆度稳
定下降 ,一15 仪旧 一12 以X) , Wo 二3.3一3 .3 ( 图 5
) 比水溶液中(一l口吠幻)高出很多 螺旋从 48 % 降到
42 % ,而在水中的螺旋量是 32 % 切,说明溶液浓度
和反胶束尺度对所研究蛋白的结构有明显影响 在
近紫外区域 ,当催化活性下降时观察到椭圆度大幅
下降 说明溶菌酶在 A oT 反胶束中发生变性 ,活性
位点的裂隙被打开 这一点得到 Ste i钊m ann 的证实
侧 ,但是 ,在稳定构像的特异抑制剂/底物存在的条
件下 ,不会发生变性反应
间 B , hette 用 0.IM A OT 反胶束 (图 6 )测了 Cyt C
在近紫外区域的圆二色谱 ,结果显示索瑞(So re t) 带
强度增加 ,并且随水分增加 ,蛋白质结构变得松散
1211
H 洲ebrandt 认为这是由于 Cyt C 两种状态同时
存在的原因 一种状态保有原来的构像 , Cyt C 的氧
还能力与在水中一样 ,也保存了血红素铁的低自旋
结构 ;另一种状态则是亚铁血红素裂隙张开 ,铁离
子处于 5 6 配位低 自旋的热平衡中 网 V 测了
Cyt C 在 0. 2 M AO T 反胶束中的远紫外圆二色谱
在 2 2IUn 处 , 磷酸缓冲液 W O二 5.0 和 W 二40 的反
胶束 中 , cyt C 的椭圆度分别为一141 0 ,一128 0 , -
67 0 而在阳离子活性剂 CTA B 反胶束中其椭圆度
几乎没变侧 说明离子作用力在 Cyt C 蛋白中起的
作用与溶菌酶在反胶束中结构不稳定机制有相似
之处
}万{灭履:I 巴左韭
脚 . 心. . . . 目匕. 自 白. .
. 尸从
切少 {:,.含
圈 5 落 , 醉在三种溶荆中的口二色漪
在水中(一); 在 O.0 5M 含辛乙烷 0.3 % 的 A价 反胶束 中(一 );
在 0. 仍M 含水 3% 的AOT 反胶束 中(--一 )a.近萦外区城;b.
远紫外区城(G咖 di, S而th an d 画 51, 198 1)
月 产.一气 奋关一
. . - . - - 一 ~ ~ . . ,
二
有人推测 :溶菌酶在反胶束中的变性机制可能
是由于阴离子活性剂与碱性蛋 白结合 (pl 二10 )
St ei n~ 将溶菌酶嵌人中性反胶束 (TG M E )或者
阳离子表面活性剂 CTAB 中 , 发现酶保持高活性 ,
溶菌酶的圆二色谱未受干扰浏 这些研究表明 :蛋
白质与阴离子胶束壁的紧密联结 ,可能引起蛋白质
与负电荷的极性基团发生反应 ,破坏了溶菌酶的稳
定 ,使分子内的盐桥破裂 ,从而使整个蛋白变性
2. 3 细胞色素 C
碱性蛋 白细胞色素 C (Cyt C , p卜 10 .5) 是另外
一种反应机制 , 发生在蛋白和负电荷胶束界面之
圈 6 细胞色索 C 的口二色谱
A . 在索瑞带 中:a, 中性 pH 水溶液中 (一 );b . 0 .I M 的 A O叮
反胶束中 , W 二10 (--一 );. O.I M 的 Aar 反胶束 中 ,W 二
20 (一 ) B .在近萦外区城 :a.水中(- 一 );b. w = 30 的反胶
束中(- -- -一 );c. Wo 二20 反胶束 中(一 )C . 索瑞带的椭圆度
随系统中水含t 在 月肠 和420r un 处的变化 (B心 he 讹, Pet it aD d
巧leni , 198 8 )
3 总结与展望
近十几年来 ,越来越多的人把与蛋白相互作用
的水分子视为蛋白质结构的一部分 ,纳米微区内的
水分子物化性质都发生了改变 ,蛋白质在纳米尺度
微区内的动力学已引起人们的重视 除上述蛋白
外 ,还有多个蛋白得到较为详细的研究 ,如 ,磷酸丙
糖异构酶 人血清白蛋白 丝氨酸蛋白水解酶等等
2以冷 年 增 刊
徐建华等 :利用模拟纳米微环境的反胶束法结合
圆二色技术研究蛋白质的结构和反应动力学 135
所采用的方法也不仅是圆二色技术 ,还有其他光学
手段 ,如 ,拉曼光谱 ,核磁共振 ,高效液相色谱等
反胶束除了用于研究蛋白动力学特性外 ,还在
蛋白质的纯化萃取等方面有较好的发展前景l切作
者所在单位已经发展出成熟的同步辐射圆二色装
置 ,并尝试开展反胶束中蛋白动力学的研究 希望
以此文引起同道的兴趣和关注 ,共同促进这一研究
领域的发展与进步
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