全 文 ：反胶束中单宁酶催化没食子酸烷基酯的生物合成
王 征!，"，卢向阳"，罗泽民!，"，田 云"!
（!# 湖南农业大学 理学院生物技术系，长沙 $!%!"&；
"# 湖南农业大学 生化与发酵工程实验室，长沙 $!%!"&）
摘 要：为了研究单宁酶在有机相中的催化性能，建立了 ’() *异辛烷 *水反胶束单宁酶催化没食子酸与脂肪醇酯
合成反应体系。结果显示：反胶束单宁酶催化体系可成功催化合成 +,-+. 脂肪醇与没食子酸的酯合成反应。不同
反应体系中由于不同脂肪醇的存在，单宁酶的动力学参数和紫外光谱存在差别。结果表明单宁酶对脂肪醇的专一
性不强，根据 !/01 * "/比值，丁醇与异丁醇是其最适底物，单宁酶催化没食子酸烷基酯合成的动力学符合米氏方
程。反应体系中不同的脂肪醇导致了单宁酶构象的差别。
关键词：反胶束；单宁酶；催化性能；动力学；构象
中图分类号：2.. 文献标识码：’ 文章编号：!34"-,34&（"%%$）%$-%%"3-%.
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反向胶束酶体系是近几年来研究较多的有机相
催化体系。当表面活性剂溶解于非极性有机溶剂
中，随其浓度增大到一定程度，就可形成聚集体，这
种聚集体通常以亲水基相互靠拢，以疏水基朝向溶
剂，其构型与水相中的胶束正好相反。因此被称为
反胶束（G:P:GQ:S IG @;P:GH:S /@L:MM:）［!］。反胶束中，酶
增溶于“水池”中，由于“水池”中水密度、粘度等特性
不同于体相水，许多酶的构象由此引起改变，使酶的
催化特性与其在水相中的存在着差异［"］。由于反胶
束体系光学透明，热力学稳定的特点，允许采用 >[、
6WV、BV、+E等光谱学手段跟踪酶反应过程和构象
变化，为研究酶的作用特点和性能提供了很大的便
! 收稿日期："%%$-%&-".
基金项目：国家“十五”科技攻关项目（"%%!K’.,.+）和湖南省教育厅资助项目（"%%!+!,,）
作者简介：王 征（!]34-），女，博士，副教授，研究方向为生物化工。
6IP^ "%%$
·"3·
生 物 加 工 过 程
+9@;:Q: _IDG;0M IJ K@IFGIL:QQ U;<@;::G@;<
第 "卷第 $期
"%%$年 !!月
万方数据
利。
单宁酶（!"，#，#，$%）是一种可以水解没食子酸
酯键和羧酚酸键的水解酶，在食品加工、饲料、皮革
及化妆品工艺中得到了应用。而在有机相中，单宁
酶可催化水解反应的逆反应———酯的合成。&’()*+
&,-../)0曾成功用固定化单宁酶在有机相中合成没
食子酸戊酯。
为了研究有机相中单宁酶催化性能，我们首次
建立了合成系列没食子酸烷基酯的反胶束单宁酶催
化体系。即用单宁酶在反胶束体系中催化没食子酸
与不同的脂肪酸进行酯化反应，合成没食子酸烷基
酯。同时对单宁酶在反胶束中的底物选择性、动力
学参数进行了研究，并探讨了单宁酶在反胶束中单
宁酶活性与其构象变化的关系，为扩大单宁酶的应
用范围提供参考依据。
! 材料与方法
#,# 主要试剂及仪器
没食子酸（12）购自中国药品生物制品测定所；
没食子酸丙酯（31）、没食子酸丁酯（41）购于 5678)
公司；没食子酸（合成用）购自张家界茂源化工有限
公司（9:;以上）；双（$ < 乙基己基）磺基琥珀酰钠
（2=>）、异辛烷（德国进口分装）、各种脂肪醇；合成
用单宁酶（自制）：（?&@）$5=@ 沉淀，透析，冷冻干燥
得的酶粉（水解酶活力 " A%%B@ %%% C D 87）；光谱学分
析用单宁酶（自制）：电泳纯单宁酶。
2760.E/高效液相色谱仪，2760.E/ 工作站。276B
0.E/ FA@"!分光光度计；G6006H’*. 纯水器；9:%IJ> 荧
光分光度计；万分之一电子天平（5(6K/0)E+）。
#,$ 实验方法
#,$,# 单宁酶反胶束反应体系的建立
配置 %,# 8’0 D L 的 2=> 异辛烷溶液 2；#% 87 D
8L的没食子酸不同醇溶液 4；%,%%A 8’0 D 8L、H& M
A,%的单宁酶柠檬酸缓冲溶液 I。
用微量注射器取 %,A 8L的 4溶液慢慢滴加于
" 8L的 2溶液中，用涡旋振荡器振荡，保持溶液的
澄清。滴加溶液 I，为保证各体系中形成单相的
JG，I 液体积加入不同，各体系中酶质量浓度为
%,N 87 D 8L。在 "AO恒温，振摇 #A% * D 86E进行反应。
每间隔一定时间，用 >LI法观察产物的产生情况。
#,$,$ 薄层层析定性检测产物生成［"］
展开剂：苯 P异丁醇 P冰醋酸 M @% P #N P @（体积
比），#% 7 D L Q.I0"显色；或在紫外灯下观察。
#,$," 单宁酶紫外光谱测定［@］
水相中单宁酶的紫外吸收光谱：以对应的柠檬
酸缓冲液为本底扣除，扫描溶于缓冲液中的单宁酶
在紫外光区的吸收光谱变化；反胶束中单宁酶的紫
外吸收光谱：以对应的没有加酶的空反胶束溶液为
本底扣除，扫描增溶于反胶束体系中的单宁酶在紫
外光区的吸收光谱变化。
#,$,@ 反应初速度、单宁酶活力的测定：&3LI法［A］
反应初速度以每 86E每 87酶催化底物没食子
酸减少量表示。
酶活力定义：每 86E催化 #!8’L底物没食子酸
转化为产物所需的酶量为 #个酶活力单位。
" 结果与分析
$,# 反胶束体系中没食子酸烷基酯的合成
按 #,$,#方法建立合成下列没食子酸烷基酯的
反胶束体系。
表 # 反胶束单宁酶催化体系的组成
>)R0. # >S. T’EU6U/U ’V *.)T/6’E UWU/.8 ’V /)EE)U. JG
序号 没食子酸醇溶液 2=>异辛烷溶液 酶缓冲液
# 没食子酸甲醇 %,A 8L %,# 8’0 D 8L A 8L #$%!L
$ 没食子酸乙醇 %,A 8L %,# 8’0 D 8L A 8L #$%!L
" 没食子酸丙醇 %,A 8L %,# 8’0 D 8L A 8L #$%!L
@ 没食子酸异丙醇 %,A 8L %,# 8’0 D 8L A 8L #$%!L
A 没食子酸丁醇 %,A 8L %,# 8’0 D 8L A 8L #$%!L
N 没食子酸异丁醇 %,A 8L %,# 8’0 D 8L A 8L #$%!L
: 没食子酸戊醇 %,A 8L %,# 8’0 D 8L A 8L 9%!L
F 没食子酸异戊醇 %,A 8L %,# 8’0 D 8L A 8L N%!L
9 没食子酸辛醇 %,A 8L %,$ 8’0 D 8L A 8L #$%!L
#% 没食子酸月桂醇 %,A 8L %,$ 8’0 D 8L A 8L 9%!L
注：为保证各体系中形成单相的 JG，加入的缓冲液体积不
同，各体系中酶质量浓度为 %,N 87 D 8L。
#号反应体系中，由于甲醇与异辛烷不相溶，发
生分层现象，>LI 法检测没有产物的生成；$ 号、9
号、#% 号反应体系中用 >LI法检测没有产物斑点。
"号、@号、A号、N号、:号和 F号反应体系中反应液
的 >LI检测结果显示有产物斑点（见图 #）。建立生
产 N种没食子酸烷基酯的反胶束反应体系。
从以上结果分析，甲醇和乙醇不与没食子酸酯
化的原因是因为它们的强极性造成的，甲醇不能与
非极性的异辛烷相溶，形成稳定的单相反胶束体系；
另外，它们会夺取“必需水”，影响酶的活性，甚至导
$%%@年 ##月 王 征等：反胶束中单宁酶催化没食子酸烷基酯的生物合成 ·$:·
万方数据
致酶的失活。! 号、"# 号反应体系中，虽然 $%& 浓
度增加了一倍，&’(检测仍没有产物的合成。很可
能是因为辛醇和月桂醇的烃链太长，疏水作用强，邻
近单宁酶活性中心困难的缘故。
)$：没食子酸；*)：没食子酸丙酯；
+*)：没食子酸异丙酯；,)：没食子酸丁酯；
+,)：没食子酸异丁酯；$)：没食子酸戊酯；
+$)：没食子酸异戊酯
图 " 各种没食子酸烷基酯的薄层层析图（"#!’，- .）
/+01" &’( 2+0345 62 784+639 8:;<: 08::8=59（"#!’，- .）
反胶束体系中，单宁酶可催化 *)、+*)（没食子
酸异丙酯）、,)、+,)（没食子酸异丁酯）、$)、+$)（没
食子酸异戊酯）的合成，说明单宁酶对中长链的烷基
醇专一性不强。
>1> 各个 ?@反应体系中单宁酶催化动力学参数
在建立的各个 ?@ 反应体系中，设定相同 ?@
组成条件和相同的反应条件。固定各种醇的浓度，
改变没食子酸的浓度，可求出没食子酸浓度对反应
初速度的影响。’+A5B58754C,34; 法作图，求得动力
学参数结果如图 > D图 E所示。
图 > 没食子酸丙酯合成体系中没食子酸浓度与反应初速
度关系双倒数图
/+01> ’+A5B58754C,34; F:6= 264 *) 9图 G 没食子酸异丙酯反应体系中没食子酸浓度与反应初
速度关系双倒数图
/+01G ’+A5B58754C,34; F:6= 264 +*) 9图 H 合成没食子酸丁酯的反应体系中没食子酸浓度与反
应初速度关系双倒数图
/+01H ’+A5B58754C,34; F:6= 264 ,) 9图 I 合成没食子酸异丁酯反应体系中没食子酸浓度与反
应初速度关系双倒数图
/+01I ’+A5B58754C,34; F:6= 264 +,) 9图 - 合成没食子酸戊酯的反应体系中没食子酸浓度与反
应初速度关系双倒数图
/+01- ’+A5B58754C,34; F:6= 264 $) 9·>J· 生物加工过程 第 >卷第 H期
万方数据
图 ! 合成没食子酸异戊酯反应体系中没食子酸浓度与反
应初速度关系双倒数图
"#$%! &#’()(*+(,-./,0 1234 53, #67 89’4:(8#8
在各种反应体系中，由于常温下没食子酸在醇
中溶解度不高，设定的没食子酸的质量浓度范围在
;%< = ;> ?$ @ ?&，醇与没食子酸的摩尔比都在 A<>
以上，因此可以将建立的反胶束酶促反应体系近似
看成单底物反应体系。从图 ; = !推断，反胶束单宁
酶催化没食子酸酯的合成动力学符合米氏方程。
表 ; 为不同反应体系中单宁酶催化动力学参
数，据文献［!］得出反胶束体系中单宁酶对底物选择
性的差别参数 !，有：!（B7 @ #B7）C !%DE；!（.7 @ #.7）C
A%>F；!（67@ #67）C A%G;。
从 ! 值判断，在没食子酸浓度相同的条件下，
单宁酶对直链脂肪醇的专一性较强。但对丁醇与异
丁醇的专一性接近。
表 ; 不同反胶束反应体系中动力学参数
H*I2( ; H:( 0#’(4#J8 1*,*?(4(,8 53, K#55(,(’4 LM ,(*J4#3’ 8984(?8
反应体系 B7 #B7 .7 #.7 67 #67
米氏常数
"? @ ??32 @ &
<%F;A ;G%NG ;%D<; G%A< AD%DN ;;%GA
反应最大速度 #?*O
@（!?32·?#’
-A·?$-A）
>%;FN >%AEF >%G!F >%GNF >%E!> >%E;D
#?*O @ "? @（?#’-A·?$-A
·& P A>-G）
>%>ED >%>>F >%AG; >%A;F >%>;< >%>AN
;%G 不同脂肪醇存在下的反胶束体系中单宁酶的
紫外光谱
在各种反应体系组成中，所不同的是脂肪醇。
从图 D* =图 DJ分析，不同脂肪醇导致了单宁酶的紫
外扫描图谱的差别。在 AN> = ;;> ’?范围，正丙醇
存在下的单宁酶紫外吸收光谱与异丙醇存在下的单
宁酶紫外吸收光谱差别明显；正丁醇与异丁醇对单
宁酶紫外吸收光谱的影响基本一致，只是在 ;GN ’?
处的最大吸收强度有所不同；正戊醇与异戊醇对单
宁酶的紫外吸收光谱影响差别最大。
紫外光谱的变化可反映出蛋白质生色基团微环
境的变化［!］。说明不同脂肪醇可以引起单宁酶的构
象差异，这可能是引起不同体系中酶与没食子酸的
亲和力和催化效率差异的重要原因之一。由于醇的
非极性不同，以及链长度的差异和羟基的位置异构，
它们进入反胶束的几率会受影响，对酶的活泼基团
作用也不同。同分异构的脂肪醇引起的单宁酶紫外
图谱的差异与 ;%;中 ! 值结果基本一致。
! 讨论
根据动力学数据分析表明：在建立的反胶束反
应体系中，单宁酶催化合成没食子酸烷基酯的动力
学符合米式方程。其合成没食子酸丁酯和没食子酸
异丁酯的效率是最高的；催化直链脂肪醇与没食子
酸合成酯的速度大于催化支链脂肪醇与没食子酸合
成的速度；单宁酶对醇（QG-Q<）专一性不强；QE 脂肪
醇的存在，最有利于单宁酶与没食子酸的结合。
反胶束酶体系提供了一个近似于生物膜的模
型。可模拟酶在生物膜中的结构和功能［D］，能较真
实地反应出酶在体内的作用机制。一般认为，酶天
然构象的变化将易导致酶活性的丧失，但越来越多
的事实证明，酶在充分发挥其活性功能时，需要构象
在一定程度上的改变。例如，很多波谱学研究表明，
反胶束溶液中的酶构象虽然不同于天然构象，但却
表现出了“超活性”。黄文［N］的研究报道：LR*8( 在
LM中傅立叶红外光谱、荧光光谱和紫外吸收都有
变化说明其构象发生了改变，但其催化效率却是水
中的 F倍。缪炜［A>］等报道卵磷脂 LM体系中"-A，E
糖苷酶在低底物浓度下的高催化速度是因为微乳的
界面发生的相互作用改变了"-A，E 糖苷酶的构象，
增加了底物水杨苷的浓度，卵磷脂极性头部-RS
（QTG）G正离子作用水杨苷键的氧，有利于糖苷键断
裂等因素造成的。U*8 V［AA］在研究 LM中的乙醇脱
氢酶时发现：酶的构象对 1T、W> 的变化很敏感，当
#-螺旋占主导成分时，活性是最高的；而以"-折叠成
分占主导时，其活性与酶和表面活性剂的相互作用
有关。本文曾进行了水相中单宁酶催化没食子酸烷
基酯合成的尝试，但用 H&Q法无法检测到产物的合
成。可能的解释是，单宁酶在体相水中的活性构象
适合其催化水解反应；而在反胶束中由于其增溶方
式的特点，导致了构象的改变，这种变化很可能是催
化酯合成所必须的。
;>>E年 AA月 王 征等：反胶束中单宁酶催化没食子酸烷基酯的生物合成 ·;N·
万方数据
图 ! "：正丙醇和异丙醇对反胶束中单宁酶紫外吸收图谱的影响（#正丙醇 $异丙醇）；%：正丁醇和异丁醇对反胶束中单宁酶
紫外吸收图谱的影响（#正丁醇 $异丁醇）；&：正戊醇和异戊醇对反胶束中单宁酶紫外吸收图谱的影响（#正戊醇 $异戊
醇）。反胶束体系组成：’(# )*+ , - ./0；!’ 1 #’；23 1 4(’；"（醇）, "（总体积）1 ’(#；酶质量浓度 1 ’(5 )6 , )-。
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·T’· 生物加工过程 第 $卷第 V期
万方数据