全 文 ：生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
黄花苜蓿 LEA3 基因片段克隆与生物信息学分析
刘亚玲 王俊杰 云锦凤 赵彦 侯永霞
(内蒙古农业大学生态环境学院 内蒙古自治区草品种育繁工程技术研究中心，呼和浩特 010019)
摘 要: 根据紫花苜蓿 LEA3-1 mRNA(EU665182)的 cDNA序列，设计 1 对特异引物，以经过 ABA干旱胁迫处理的黄花
苜蓿为材料，提取总 RNA。采用 RT-PCR 方法克隆获得了 747 bp 的 cDNA 片段，命名为 MfLEA3-1(GenBank 登录号:
HQ327439)。推测该序列编码了 248 个氨基酸，这些氨基酸主要由 10. 1%苏氨酸(Thr)、24. 6%丙氨酸(Ala)、17. 7%赖氨酸
(Lys)和 12. 9%天冬氨酸 (Asp)组成，不含有半胱氨酸和色氨酸，这与其他物种 LEA蛋白成分非常接近。该氨基酸序列中存
在 13 个 11-mer重复序列，根据第 3 组蛋白分类标准，MfLEA3-1 蛋白比较接近于 type I，但是 11-mer重复中残基分布与 type I
有所不同，推测 MfLEA3-1 蛋白属于新的第 3 组 LEA蛋白类型。黄花苜蓿中成功获得了 LEA3 基因片段，为最终克隆黄花苜
蓿 LEA3 基因序列全长奠定基础。
关键词: 黄花苜蓿 LEA3 基因 克隆 生物信息学
Cloning and Bioinformatics Analysis of LEA3
Gene from Wild Medicago falcata
Liu Yaling Wang Junjie Yun Jinfeng Zhao Yan Hou Yongxia
(College of Ecology and Environmental Science，Inner Mongolia Agricultural University，
Inner Mongolia Engineering Technology Research Center for Forage Breeding and Reproduction，Huhhot 010019)
Abstract: According to cDNA sequence of LEA3-1mRNA (Accession number:EU665182)of Medicago sativa，a pair of specific
primers were designed． A new cDNA fragment of 747 bp was amplified by RT-PCR from total RNA of Medicago falcata after ABA
drought stress，named MfLEA3-1 gene(GenBank accession number HQ327439)． Sequencing result supposed that it might encode 248
amino acids，which was made up of Thr(10. 1%) ，Ala(24. 6%) ，Lys(17. 7%) ，Asp(12. 9%)except for Cys and Trp． This is similar
to the LEA proteins component of other species． Otherwise，11-mer repeat sequences were involved in this amino acid sequences． Ac-
cording to the classification standards of type I and type II of the third set of protein，the protein of MfLEA3-1 is closed to type I，but
the residue distribution of 11-mer is different to that of type I，thus，it is supposed that MfLEA3-1 protein belonged to the third set of
LEA protein． The prediction results of secondary structure indicated that it was composed of α-helix． In this study，homologous se-
quences of LEA3 were received from Medicago falcata，which provided the foundation for cloning the full length of LEA3 of Medicago
falcata．
Key words: Medicago falcata LEA3 gene Clone Bioinformatics analysis
收稿日期:2011-01-18
基金项目:国家高技术研究发展计划(“863”计划)项目(2009AA10Z108) ，内蒙古自然科学基金项目(2009MS0404) ，内蒙古科技重大项目
(20091401)
作者简介:刘亚玲，女，硕士研究生，研究方向:牧草种质资源与遗传育种;E-mail:liuyaling0719@ 163. com
通讯作者:王俊杰，男，教授，硕士生导师，研究方向:牧草种质资源与遗传育种;E-mail:jjw62@ 163. com
干旱胁迫是自然界中最主要的非生物胁迫之
一，干旱对许多植物的生长和发育造成很大的伤害，
提高植物对水分亏缺的耐性是一项复杂工程［1 － 3］。
虽然人们目前尚未完全了解干旱对植物产生的危害
和植物耐干旱的机制，但随着生物科学和技术的发
展，采用基因工程技术提高作物的耐旱能力已取得
了许多进展。利用分子生物学方法和手段探索植物
的耐旱机制进而发现新的遗传资源成为培育高度耐
旱新品种的重要环节。
胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis a-
2011 年第 7 期 刘亚玲等:黄花苜蓿 LEA3 基因片段克隆与生物信息学分析
bundant protein)是种子发育后期产生的一类小分
子特异多肽，它是伴随着种子成熟过程而产生
的［4 － 6］。1981 年，Dure 等［7 － 11］在胚胎发育后期的
棉花子叶中首先分离到了一组丰富的 mRNA，命名
为 LEA mRNA，后来人们在小麦、大麦、玉米、水
稻、葡萄种子和大豆在内的 20 种高等植物中也发
现了 LEA蛋白。研究认为这类蛋白与植物耐脱水
性密切相关，受植物的发育阶段、脱水信号等调
节，在植物受到干旱、低温和盐渍等环境胁迫后造
成脱水的营养组织中有所表达，从而在种子发育
过程中的胚胎晚期引起 LEA 基因编码的 LEA 蛋
白的高度富集。LEA 蛋白具有高度亲水性，因此
有利于 LEA蛋白在植物受到干旱失水时部分替代
水分子，提高植物的抗旱能力。近年来，第 3 组
LEA基因在植物干旱诱导蛋白的研究方面受到普
遍关注，已成为植物抗旱研究的重点［12 － 14］，但在国内
外诸多 LEA基因的相关报道中未见有关黄花苜蓿
LEA基因的文献资料。本研究根据紫花苜蓿 LEA
第 3 组基因的保守区段设计简并引物，从抗逆性极
强的黄花苜蓿中分离 LEA3 同源序列，并进行生物
信息学初步分析，以期为利用同源序列克隆技术获
得黄花苜蓿抗旱基因奠定基础，同时填补该领域研
究的空白。
1 材料与方法
1. 1 材料及处理
供试材料黄花苜蓿(Medicago falcata L．)种子于
2008年在呼伦贝尔草原野外采收，2009 年于内蒙古
农业大学温室育苗，用 0. 1 mmol /L ABA将 28 － 35 d
苗龄的植株浸泡 8 h取茎段提取基因组 RNA。
1. 2 方法
1. 2. 1 引物的设计及合成 根据 GenBank 登录的
紫花苜蓿 LEA3-1 mRNA(EU665182)的保守氨基酸
序列，参考国内外资料报道的引物设计原则，运用
DNAman软件辅助分析设计 1 对特异引物。设计的
引物如下:LEA3L:5-GCGTTGTTACTCTTTGTGCT-
TACC-3，LEA3R:5-ACTTGCTTTCTCTGCTGCTGTA-
3。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
1. 2. 2 总 RNA的提取、检测 采用北京天为时代
公司的总 RNA提取试剂 Trizol(目录号:DP405) ，具
体操作步骤参照说明书。
1. 2. 3 cDNA的合成 反转录反应参照北京天为
时代公司 Quant Reverse Transcriptase 试剂盒要求进
行反转录。
1. 2. 4 PCR扩增 以反转录所得 cDNA为模板进行
PCR扩增，扩增产物用 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检
测。PCR 反应的 25 μL 反应体系包括:PremixTaq
12. 5 μL，cDNA 模板 1 μL(约 30 ng) ，左、右引物各
2 μL，灭菌超纯水补齐体积。反应程序:94℃预变性
4 min;94℃变性 1 min，58℃退火 1 min，72℃延伸
1 min 30 s，35个循环;72℃延伸 10 min，4℃保存。制
备凝胶时加入 5%的核酸染料，成像仪上观察照相。
1. 2. 5 RT-PCR 产物的回收 DNA 琼脂糖凝胶回
收试剂盒购自北京天为时代公司，具体操作参照说
明书。
1. 2. 6 RT-PCR 产物的连接 连接试剂使用 pGM-
T克隆试剂盒，购自北京天为时代公司具体操作按
试剂盒说明书进行。
1. 2. 7 连接产物转化 连接产物转化至大肠杆菌
感受态细胞中，37℃培养 16 h，挑取单菌落于液体培
养基中培养，提取质粒由上海生工生物技术服务有
限公司测序。
1. 2. 8 序列分析 同源性检索和序列分析采用
NCBI(www. ncbi. nlm. nih. gov /BLAST)和 DNAMAN
等软件进行分析。
2 结果与分析
2. 1 黄花苜蓿 LEA3 基因片段的分离
cDNA经 PCR扩增，1. 5%琼脂糖凝胶电泳获得
1 条大小约为 700 bp特异条带(图 1)。将该条带回
收，经过连接、转化、培养，PCR检测(图 2)。
M． 100 bp Marker;1． PCR 扩增产物
图 1 PCR扩增片段电泳
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M． 100 bp Marker;1，2．阳性克隆
图 2 阳性克隆的 PCR检测结果
2. 2 黄花苜蓿 LEA3 基因片段序列分析
利用 DNAMAN软件对获得的基因的片段 LEA3
cDNA序列进行分析。所获得的 LEA3 cDNA长 747
bp，包含了 1 个 744 bp 的开放阅读框，推测编码了
248 个氨基酸，命名为 MfLEA3-1。氨基酸序列中存
在 13 个 11-mer重复序列，其一致序列为“TKDYAG-
DAAEK”。根据第 3 组蛋白 type I 和 type II 的分类
标准，即一类是 11 个氨基酸组成的重复基元序列被
与之相似的序列所分离，称第 3 组 LEA 蛋白(I) ;另
一类是在 C-末端被特定氨基酸延伸区段的出现而
分隔，称第 3 组 LEA 蛋白(II)［15］。MfLEA3-1 蛋白
比较接近于 type I，但是 11-mer 重复中残基分布与
type I有所不同。利用 ProtParam工具(www. expasy. ch /
tools /protparam. html)对该基因蛋白质物理化学性
质进行预测。结果(图 3)表明，蛋白质的相对分子
质量约为 26. 51 kD，理论等电点(pI)为 5. 89。序列
氨基酸主要有苏氨酸(Thr)10. 1%、丙氨酸(Ala)
24. 6%、赖氨酸(Lys)17. 7%、天冬氨酸 (Asp)
12. 9%组成，不含有半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、
脯氨酸(Pro)和色氨酸(Trp)。
阴影部分为 MfLEA-1 氨基酸序列中的 13 个 11-mer重复序列
图 3 黄花苜蓿 LEA3 基因片段核苷酸序列及氨基酸序列
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2. 3 黄花苜蓿 LEA3 基因片段同源性分析
对该基因的核苷酸序列在 GenBank中进行 Blast
分析，结果(图 4)表明，该基因与紫花苜蓿抗旱基因
第 3 组 LEA 基因(EU665182. 1)同源性为 83%;与
蒺藜苜蓿 8 号染色体 (AC146862. 24)同源性
为 80%。
图 4 黄花苜蓿 LEA3 基因片段同源性比较
2. 4 亲水性及跨膜结构的分析
运用 DNAMAN 软件对黄花苜蓿的 LEA3 氨基
酸序列进行亲水性分析，结果(图 5)显示，肽段对应
的线段几乎都在横坐标的上方，表明该基因片段具
有很强的亲水性。利用 TMHMM 对 MfLEA3-1 蛋白
进行了跨膜区分析，结果(图 6)表明该蛋白不含有
跨膜区，是非跨膜蛋白。
2. 5 二级结构预测
在 http:/ /npsa-pbil. ibcp. fr /网站在线分析，Mf-
LEA3-1 基因二级结构由 α-螺旋组成(图 7)。
2. 6 亚细胞结构预测
利用日本人类基因中心开发的 PSORT 程序对
MfLEA3-1基因进行亚细胞定位分析，结果(表 1)表明，
MfLEA3-1基因预测定位于细胞质的可能性为 65%、线
粒体的可能性为 10%、溶酶体的可能性为 10%。
图 5 黄花苜蓿的 LEA3 氨基酸序列亲水性分析 图 6 黄花苜蓿的 LEA3 氨基酸序列跨膜分析
2. 7 MfLEA3-1 与已克隆的 LEA 蛋白的系统进化
树分析
利用 NCBI中的 BLAST软件和 DNAMAN软件，
对黄花苜蓿、紫花苜蓿、大豆、蒙古冰草、大麦、小麦
和水稻等植物的 LEA 基因在氨基酸水平上进行聚
类分析。由图 8 可以看出，禾本科单子叶植物 LEA
基因聚为一类，棉花为一类;两个豆科植物 LEA 基
因聚为一类;其中黄花苜蓿 MfLEA3-1 与紫花苜蓿
MsLEA3 基因遗传距离最近，较早地聚到一起。从
这 8 种植物 LEA基因的遗传距离可以得知，黄花苜
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
蓿与紫花苜蓿亲缘关系最近，其次是大豆，总的来
说，黄花苜蓿与豆科双子叶植物较单子叶植物亲缘
关系近。上述聚类结果与它们的生物学分类结果相
符，说明 LEA基因具有一定的物种保守性。
图 7 黄花苜蓿的 LEA3 氨基酸二级结构
表 1 MfLEA3-1 亚细胞结构预测
定位 可能性(%)
细胞质 65
线粒体基质 10
溶酶体 10
内质网 0
图 8 Mflea3-1 基因聚类分析
3 讨论与小结
LEA蛋白共同的结构特征是氨基酸由高度亲水
性偏性氨基酸组成，富含赖氨酸和甘氨酸，缺乏半胱
氨酸和酪氨酸［16］。本研究获得的黄花苜蓿 MfLEA3-
1基因富含赖氨酸和丙氨酸，不含有半胱氨酸和色氨
酸，有极少量酪氨酸残基存在，这与同类研究结果稍
有不同，其中原因很可能是物种间差异造成的。
MfLEA3-1 氨基酸序列中存在 13 个 11-mer 重
复序列，其一致序列为 TKDYAGDAAEK，表明
MfLEA3-1 为第 3 组 LEA 蛋白。MfLEA3-1 蛋白与
紫花苜蓿 LEA3 蛋白 11-mer重复序列组成与分布非
常接近。根据第 3 组蛋白 type I和 type II的分类标
准，MfLEA3-1 蛋白比较接近于 type I，但是 2、3 和 4、
5 和 6 到 8 和 9 到 13 之间并没有被相同序列隔开。
推测 MfLEA3-1 蛋白属于新的第 3 组 LEA 蛋白
类型。
二级结构预测显示，MfLEA3-1 蛋白的二级结构
主要由 α-螺旋组成，高比例的 α-螺旋二级结构保障
蛋白具有高度的柔性和流动性，促使分子内氢键的
形成，使蛋白质分子具无规则卷曲结构，可以在各个
方向上拉长、弯曲和伸展，从而保护细胞结构，特别
是严重脱水或膜系统免遭冰冻的伤害。11-mer 重
复能形成兼性 α-螺旋，推测其结构在细胞脱水状态
下 LEA蛋白发挥作用具有重要意义。亲水性和跨
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膜分析显示，MfLEA3-1 是一种高度亲水的非膜蛋
白，这与 LEA蛋白质序列二级结构主要由 α-螺旋组
成有关。
紫花苜蓿 LEA3-1 基因编码的蛋白质中 N 端有
明显的信号肽特征，C 端有一个 ER 滞留信号类似
的序列，推测这一 LEA蛋白可能在内质网内行使功
能。由于信号类的存在会影响亚细胞定位结果，所
以该基因亚细胞定位预测结果还有待于进一步研
究。但也有研究报道，N-末端的信号肽证明了 LEA3
蛋白的两个密切联系的蛋白定位在内质网膜上，当信
号肽被清除后该蛋白的含量也就急剧下降了。其他
一些信号也可以控制蛋白定位在线粒体和质粒中。
通过 PSORT程序对 MfLEA3-1 的亚细胞定位，该基
因是一种定向在细胞质的蛋白，准确的定位有待于
进一步研究。
由于 LEA蛋白存在多种功能，与植物的抗逆性
有密切关系，分离、克隆与植物抗逆有关的 LEA 基
因，可以用于植物的抗逆性基因工程育种，特别是抗
旱育种。黄花苜蓿是我国北方草原的优良牧草，具
有许多紫花苜蓿不具备的优良特性，是苜蓿抗性育
种的重要基因库。分离、克隆黄花苜蓿 LEA3 基因
可为苜蓿遗传改良和新品种选育奠定基础。
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(责任编辑 李楠)
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