全 文 ：第 2 卷
V o l
.
2 N o
.
草 地 学 报
A C T A A G R E S T IA S IN CA
1 9 9 4 年
1 9 9 4
野生黄花首蓓叶肉原生质体培养和植株再生 ‘
白静仁 何茂泰 袁 清 萨 仁 李永干
(中国农业科学院草原研究所 , 内蒙古 自治区草原研究所 , 呼和浩特 , 。1。。10 )
摘要 : 取野生黄花首糟 15 ~ 20 天叶龄的叶片 , 去掉下表皮 , 用 1 %纤维素酶 、 1 %半纤维
素酶和 。. 5 %果胶酶的混合液游离原生质体 . 用改良的M S 培养基附加 2 , 4 一D 、BA 和 N A A 等 ,
在黑暗条件下浅层悬浮培养 。 培养第 4 天 、第 7 天和第 10 天 , 原生质体分别出现第一次 、第二
次和多次分裂 , 在此期间数次加液或换液调节渗透压 , 直至形成 1 m m 左右的大细胞团 , 然后
转移到附加 2 , 4 一D 和 K T 等的 M S 固体培养基 , 诱导形成愈伤组织 , 再经 4 ~ 5 次继代培养 , 分
化成为完整的再生植株 。
关锐词 : 野生黄花首楷 ; 原生质体培养 ; 再生植株
1 前言
野生黄花首蓓 (人介dl’ca g 口 fa lca ta L . )具有抗寒抗旱 、抗病性强 、适应性广以及营养丰
富 、品质好等优良特性 , 在我国东北 、华北和西北及蒙古 、俄罗斯等欧洲一些国家均有野生分
布 , 是一种重要的牧草种质资源 。 作为首楷和其它豆科牧草育种的重要亲本材料 , 它历来为
首箱育种工作者所注视 。 近十几年来 , 随着牧草育种方法和技术的改进 , 特别是牧草生物技
术的研究进展 , 为野生黄花首箱的利用和改良提供了可能性 。 其中原生质体培养技术 , 可以
像动物细胞 、微生物一样 , 使之操作 “微型化 ” , 实现种间细胞融合 、获得细胞变异体 。 而且原
生质体是一个遗传操作的理想受体系统 。 研究野生黄花首楷的原生质体培养是改良和培育
新品种的一个新途径 。 紫花首落原生质体培养在国内外 曾多次报道 , 如加拿大高国楠
(1 9 8 0 )
、巴西 A · V · P · Do s Sa n t o s 和美国 D · E · O u tk a 等 (1 9 8 0 ) , 我国 吕德扬 (1 9 8 3 ) 、
许智宏 (1 9 8 2) 、黄绍兴 (1 9 0) 先后培养紫花首稽原生质体并获得再生植株 。而野生黄花首楷
的原生质体培养在国外仅有一例 (Gi lm ou r 等 , 1 98 7 ) , 国内尚未报道 , 本文以我国的野生黄
花首楷为材料 , 进行培养原生质体再生植株的研究 。
2 材料和方法
2
.
1 种子未集 种子采集于 内蒙古克什克腾旗野生黄花首箱 , 经 3 年栽培的植株 , 早春由
田间移入花盆 , 在室内和室外交替放置 , 待其叶龄 15 一 20 天时取之作为酶解材料 。 先用 0.
1 %升汞液消毒 7 ~ 10 分钟 , 再用无菌水冲洗 3 次备用 。
2
.
2 原生质体的游 离 撕去灭菌叶片的下表皮 , 放入培养皿酶液中 , 置于 25 士 l℃的培养
箱内 ,酶解 5一 7 小时后 , 用 3 0 目不锈钢筛过滤 ,再置于 30 0 r p m 转速下分离和收集原生质
体 。
2
.
3 培养 收集纯化得到的原生质体 , 用 CPW 洗液和培养基液各离心洗涤 2 次 , 加入培
养 液 , 调节原生质体密度置于 26 士 1 ℃培养箱 , 进行浅层液体暗培养 。原生质体培养液为
· 内蒙古 自然科学基金委员会的资助项目。
草 地 学 报 1 9 9 4 年
M s
, 每升附加谷氨酞胺 2 0 m g 、苹果酸 lom g 、延胡索酸 1 0 m g 、甘露醇 0 . 6 m o l、蔗糖 0 . 0 3
m o l
、
B A 0
.
5一 1 m g 、 N A A 0 . 5一 1 m g 、 2 , 4一D 0 . 0 5一 1 m g , p H = 5 . 8 。 培养开始后 , 每天
定期摇动几次培养皿 。当原生质体出现二次分裂到多次分裂后 , 用降渗培养基定期加液或换
液 。待大细胞团增殖到一定大小时转移到固体培养基诱导愈伤组织 , 进而再转到分化培养基
进行分化培养 。
3 实验结果与分析
3
.
1 原生质体的游离
3
.
1
.
1 取材 取材要适时 , 经试验在 8一 9 时取叶游离最好 。 取叶龄 15 一20 天的幼叶 , 此时
幼叶刚刚展开 , 呈黄绿色 。若过早取叶不易撕去下表皮 , 过晚则叶肉细胞生理状态不好 , 游离
的原生质体没有活力 。 1 克鲜叶可游离 2 ~ 3 . 5 x 10 ‘个原生质体 。 子叶 、下胚轴和带下表皮
的小块小条游离的原生质体远不如叶肉 。
3
.
1
.
2 酶液 酶液是游离的重要关键 , 不同材料因其细胞壁成分和结构不同 , 所用酶的种
类 、浓度和处理时间均有差异 , 需经试验确定 。 配制的 3 种混合酶液经反复试验证明 , 3 号酶
液效果最佳 , 其游离的原生质体培养 5 天后分裂率达 56 . 5 % (表 1 ) , 1 、 2 号仅为 5 . 0 %和 12 .
o%
;在 25 ℃无光条件下游离 5 ~ 7 小时最为合适 , 少于 5 个小时游离不出原生质体 ,超过 7
个小时原生质体破碎 。
农 1
T a b le 1 M
a in
三种酶液主要成分 (m g / 2 0m l)
eo m p o n e n ts o f e n z ym e s o lu tio n
酶液编号
N O
.
纤维素酶
C ellu la s e
半纤维素酶
H e m ie e llu lo s e
果胶酶
Pe e tina
s e
离析酶
M a e e r o z ym e
培养 5 天后分裂率(% )
n
v is io n r a t e aft e r 5 d ay
, 5 e u lt u r e
5.12564 0 0
4 0 0
2 0 0
16 0
10 0
表 2 渗透压液体培养墓
T a ble 2 Liq u id e u lt u r a l m e diu m o f diffe re n t o s m o t ie p r e ss u r e
(m o l/ L )
培养基号
M ed iu m N o
D s D ;
甘露醉
M a n n it o l
葡萄糖
G lu e o s e
蔗糖
S u e r o s e
培养情况
C u lt u r e
S lt U a t 1O n
原生质 培养 4 天后分裂率 加液停
体破碎 56 一 69 % 止分裂
P r o t o Pla s t 以 v is io n r a te 15 5 6一 6 9 以 v isio n
s m a sh a ft e r 4 d a y
, 5 e u ltu r e s t o P
加液停
止分裂
D iv isio n
s t O P
分裂率 28 %
n
v is io n
加液后分
裂旺盛
V ig o ro u s
d iv is io n
分裂旺盛
V ig oro u s
d ivi sio n
3
.
2 培养
3
.
2
.
1 建立悬浮培养体系 将上述改良的 MS 培养基加入收集到的原生质体中 , 在无光条
件下 , 作浅层液体悬浮培养 。 首先调节原生质体的密度 , 在 3 种密度试验中 : 1 ~ 2 X 1 0’ 、 1~ 2
x 1 0s 和 1 ~ 2 x 1 06 , 以其中第 2个密度的原生质体分裂率最高 , 为最佳密度 , 达到 5 6 ~
第 1 期 白静仁等 : 野生黄花首楷叶肉原生质体培养和植株再生
6 9%
, 第 1 和第 3 个密度的分裂率仅有 2 . 1 %和 9 . 9 % 。 在适宜的条件下 , 培养第 2 天原生
质体变大 , 第 3 天细胞器集中在原生质体的一边 。 第 4 天时出现第一次分裂 。 根据观察大部
分原生质体呈不均等分裂 , 7 天后出现第二次分裂 。 10 天后有多次分裂出现 。 原生质体分裂
的同时也是壁再生的开始 , 一旦壁再生 , 培养液的渗透压应该相应降低 。所以 , 这时要用降渗
培养基定期加液或换液 。降渗培养基在起始培养基的基础上 , 改变其中的渗透压稳定剂种类
和浓度 , 从 7 种渗透压培养基筛选出 3 种适宜的降压培养基 (表 2 ) 。 培养前期用 D : 为宜 , 后
期 D ‘和 D , 为宜 。 第二次分裂到多次分裂之间加液一次 , 加量为原培养基的 1 /3 。 多次分裂
后采用换液的方式 , 每次换去原来的 2 / 3 。 加液和换液使悬液中细胞保持旺盛的分裂力 , 并
能防止有毒物质的积累和细胞团的老化 。 培养 30 天后逐渐形成大细胞团 , 60 天左右就有肉
眼可见的约 1 m m 的大细胞团形成 。
3
.
2
.
2 诱导愈伤组织 在形成 1 m m 的大细胞团后 , 应及时转到 固体培养基培养 , 使其增
衰 3 诱导愈伤组织培养荃
T a b le 3 M d
e iu m fo r e a lii in d u e tio n
(M S
,
m g / l)
培养基号
M e d iu m N o
K T Z
,
4
一
D R N A
平均愈伤组织块数(。. Znil 原生质体液)
A ve rag
e ea lliPiec es in 0
.
2 rnl p ro t
o p las t s o lu t io n
1738905
殖成为愈伤组织 , 这时
施加 1 5 0 0 L u x 的光
照 。 配制的 3 种诱导
愈伤组织培养基 (表
3 )
, 其 中最 好 的是
M S
: , 经反复试验 , 0 .
Z m l 的悬浮培养液
平均可诱导 出 38 块
愈伤组织 , 最多 76 块 。
M S z 1
.
0
M SZ 0
.
5
M S 3
培养基中外源激素有重要作用 , 必须加入 2 , 4 一D 和 K T , 2 , 4 一D 在 。
5一 1 . 5 m g / L 之间随着用量的增加愈伤组织有增加的趋势 。 2 , 4 一D 和 K T 之 比以 3 : 1 的效
果较好 。
3
.
2
.
3 愈伤组织的分化培养 愈伤组织长到 3 m m 左右时 , 由诱导培养基转移到分化培
养基进行分化培养 。 此时光照加到 3 0 0 0 L u x 。 经过 3 次和 5 次继代培养 , 产生了乳白色 、淡
绿色 、褐绿相间和上紫下绿的愈伤组织 , 并有不同程度的分化 。 分化长出芽 、小叶 、胚状体
等 。 配制的 6 种分化培养基 (见表 4 ) ,分化率较大的是 M S 。和 MS , , 但均未能形成完整的植
株 。
表 4 分化培养荃
T a b le 4 D iffe r e n tia t io n e u lt u r e o n d if e r e n t m e diu m
(M S
·
m g / L )
培养基号
M e d iu m N o
.
K T B A ZT IA A N A A
接入愈伤组织
C a llis in o eu la tio n
芽等的分化
以ffe r e n tia tio n o f b u d
分化率 (% )
以lfe r e n tia tio n r a te
O
。
O
. l0s
O
。
O
。
O
。
O
。
1 0 0
1 0 0
1 0 0
1 0 0
1 00
1 00 :; :;
5M
3
.
3 再生植株的形成 转移到 M S ‘ 的由上紫下淡绿色的愈伤组织 , 经过 40 一60 天的培养
分化成为完整的植株 。 这些愈伤组织都是来源于 M S : 。 MS : 的 2 , 4 一D 用量较大 , 说明诱导阶

第 1 期 白静仁等 : 野生黄花首稽叶肉原生质体培养和植株再生 · 6 3 .
段 2 , 4 一D 高些对以后的植株分化有利 。
4 讨论
4
.
1 关于野生黄花首稽的原生质体培养 , D · M · Gi lm ou r 等 (1 9 87 ) , 以子叶作游离材料 ,
联用 KP S 、 UM 和 M s 等 3 种培养基 , 运用看护培养的方法 , 得到了再生植株 。本项研究以叶
肉为游离材料 , 仅用一种 M S 培养基 , 不用看护培养技术 , 就获得 了再生植株 。幼叶作为游离
材料有以下优点 : ¹ , 利用盆栽方法调节生活环境 ,使细胞处于 良好的生理状态 , 因而能游离
出高质量的原生质体 ; º , 幼叶能再生 , 可连续不断的取材 ; » , 能观察比较母株与再生植株
的生长和遗传等情况 。研究结果表明 , 野生黄花首藉叶肉组织是一个很好的原生质体培养材
料 。 仅用一种培养基 , 加之不用看护培养技术 , 大大简化了培养过程 ,提高了成功的可能性 。
4
.
2 在野生黄花首蓓原生质体的培养中 ,最主要的技术关键是建立有效的悬浮培养体系和
后期的植株分化培养等 ,这就需要进一步研究 , 提高效率完善技术 。
参 考 文 献
1 黄绍兴等 , 19 9 0 , 紫花首楷原生质体植株再生及遗传转化的研究 , 中国科学院遗传研究所《研究工作年
报》科学出版社 , p 74 ~ 75
2 DO
s s a n t o s
,
A
.
V
.
P
.
D
.
E
.
O u t k a
, E
.
C
.
C o e k认g a n d M . R . Da n e y
.
19 8 o , O r g a n o g e n e s is a n d s o m a t ie e m -
b r yo g e n e s is in t i s s u e s d e r i v e d fr o m 玩a f . p r Q to Pla s t s , a n d le a f e即la n t s o f M七d ic 4 g o s a t i . 口 , 2 .
P fla n z e n p k y s i o l
, B d 9 9
.
5
.
2 ’1一 27 0
3 G ilm o u r , D
.
E
.
M
.
R
.
D a v e y a n d E
.
C
.
C o e k i n g
.
19 8 7 , Pla n t r e g e n e r a t io ri
‘
fr o m e o t yle d o n o f w ild
材亡d i e a g o s P e e ie s , P la n t Se ie n e e , 4 8 : 10 7 ~ 112
4 K a o K
.
N
. a n d M
.
R
.
M e e h a y lu k
. , z 9 s o . Pla n t r e g e n e r e t io n f r o m m e s o p h yll p r o t o闰郎t s o f a l和lfa . Z .
P fla n z e n Ph y 5 10 1
.
9 6 : 135 ~ 14 1
5 L u , D
.
Y
.
M
.
R
.
D a v e y a n d E
.
C
.
C o e k in g l9 8 3
,
A e o m p a r is o n o f th e e u lt u r a l b e h a v i o u r o f p r o t o p la s t s
fr o m le a v e s
, e o tyle d o n s a n d r o o t s M七d i c 。砂 s a t i v a . Pla n t Sc ie n e e L e t t e r s . 31 : 8 7一 9 9
6 X u , Z
.
H
.
M
.
R
.
D a v e y a n d C o e ki n g
.
19 82 , O r g a n o g e n e s is fr o m r o o t p r o t o pla s t s o f th e fo r a g e le g u m e s
材云d i c a g o sa t i v a a n d T r i g o n e lla fo e n u m 一 g ra e e u m . 2 . Pfla n z e n p h ys io l. B d . 10 7 . 5 . 231一235
P L A N T R E G E N E R A T I O N FR OM M E SO P H Y L L PR O T O PL A ST S
O F W IL D 材万D I CA G O F A L CA T A
B a i Jin g r e n H e M a o ta i Y u a n Q in g S h a r e n L i Y o n g g a n
( I n s t i t u t e o f G ra s s la n d C AA S
. ,
H u h e ho t 0 10 0 10 )
A b s tr a e t : M e s o p hy ll p r o t o pla s t s o f w ild M e d i c a g o fa l
c a t a w e r e is o la t e d fr o m y o u n g le a v e s ( lo w e r e p i
-
d e rm i s w a s t o r e d o ff) o f 15一 20 d a y s o ld b y 乓ix e d e n z y m a t ie s o lu t io n e o n t a in i n g e e llu la s e l% , h e m i“llu -
la s e l% a n d p e e t i n a s e 0
.
5%
.
T he p r o t o p la s t s w e r e 。u lt u r e d i n d a rk , in t h in 一la ye r 。 u lt u r e flu id o f im p r o v e rd
M S m e d i u m w i th 6
一
BA lm g / L
, 2 , 4 一D 0
.
0 5
,
0
.
sm g / L a n d N AA lm g / L
, a n d u n d e rw e n t t he fir s t t im e e e ll
d iv is io n a ft e r 4 d a y
‘ 5 e u lt u r e
.
T h r o u g h m a n y t im e s e e ll d iv i s i o n , th e r e g e n e r a t e d e e lls fo rm e d a bo u t lm m
( in d ia m e t e r ) m u lt ie e llu la r e lu s t e r s i n e ha n g e d e u lt u r e flu id w ith lo w e r o s m o t ie p r e s s u r e
.
T h e e lu s t e r s d e
-
v e lo p e d in t o e a lli o n a g a r s o lid ifi e d M S me d i
u m w ith K T a n d Z
, 4一D ( t he be s t r a t io o f K T a n d Z
, 4一D 15 2 :
3) , t h e n t he e a lli r e g e n e r a t e d e o m ple t e p la n t a ft e r 4 一 5 t im e s s u be u lt u r e o n d iffe r e n t ia t i n g m e d iu m
.
K ey W o r d s
:
W ild M 七d i c a g o fa le a厂a ; Pr ot o p la s t ; C u ltu r e ; R e g e n e r a t e d p la n t
.