全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
原生质体紫外诱变选育 癸内酯高产菌株
徐勤 王昌禄 李风娟 王玉荣 陈勉华
(天津科技大学食品工程与生物技术学院 食品营养与安全省部共建教育部重点实验室,天津 300457)
摘 要: 为选育 癸内酯高产菌株, 以毕赤酵母 TT009(P ichia guillierm ond ii TT009)为出发菌株进行原生质体紫外诱
变, 确定原生质体形成和诱变的最佳条件为菌龄 16 h, 酶解浓度 1% ,酶解时间 50 m in,酶解温度 28 , 15W 紫外灯于 30 cm处
照射 25 m in。经初筛和复筛,得到 癸内酯高产菌株 M 6,利用该菌株进行摇瓶发酵, 癸内酯产量达到 125 g /L,比出发菌株
提高了 288%。
关键词: 癸内酯 原生质体 紫外诱变
Breeding on H igh Y ield DecalactoneM utants by
ProtoplastUVMutagenesis
Xu Q in W ang Chang lu L iF eng juan W angYurong Chen M ianhua
(K ey Laboratory of F ood Nutrition and Safety , M inistry of Education, T ianjin University of Science& Technology, T ianjin 300457)
Abstrac:t Breed ing on high y ield o fdeca lac tone produced by mutant o fP ichia gu illiermond ii TT009 w as stud ied byUV proto
p last mutagenesis. Th is optim iza tion o f pro top last form ation and regeneration w ere as fo llow ing, 16 h o f yeast incuba tion tim e, 1% of
enzyme concentra tion, 28 of enzym e tem pera ture. Results ind icated tha t the op tim ization ofUV protoplast mutagenes is w as as fo llow
ing, 15W UV light, 30 cm o f lighting distance for 25 m in. Through the pre lim inary and continua l selection, a h igh y ield decalactone
mu tantM 6 was ob tained, wh ich the y ie ld o f deca lactonew as 125 g /L, im prov ing the activ ity about 288% com pared w ith TT009.
Key words: decalactone P rotop last UV m utagenesis
收稿日期: 20100104
作者简介:徐勤,女,硕士研究生,研究方向:食品生物技术; Em ai:l xuq in1104@ yah oo. cn
通讯作者:王昌禄,男,教授,博士生导师,研究方向:食品生物技术; Em ai:l changluw ang@ yahoo. com
癸内酯 ( GDL )是含有五元内酯环的十碳化
合物, 具有奶香、果香及留香时间长、香气圆润、增香
等特点,是香料中需求较大的产品之一 [ 1]。目前,
国内在调配各种食用香精中所使用的 癸内酯主
要由化学方法合成, 需要特殊催化剂并通过多步反
应完成,产物也缺少立体选择性 [ 2]。利用微生物转
化生产 癸内酯的设备简单, 原料来源广泛且成本
低,转化产物与天然产物更为接近,可以代替化学合
成法制备 癸内酯, 满足消费者对绿色产品的需
求,已引起了国内外的广泛关注。但菌株活力不高,
导致生物法生产 GDL产量较低, 难以实现工业化生
产,通过选育优良菌株来提高 癸内酯产量是关键
因素之一。
目前,国内研究者在 癸内酯高产菌株的分离
筛选方面做过研究 [ 3, 4] , 通过紫外诱变 [ 5]和复合诱
变 [ 6]可以提高 癸内酯产量, 因不能消除细胞壁对
诱变效果的影响, 产量没有大幅度提高。本研究采
用原生质体紫外诱变来筛选 癸内酯高产菌株, 通
过液态发酵可以获得较高产量 GDL, 为今后工业化
生产 GDL奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
毕赤酵母 (P ichia guilliermond ii TT009)由本研
究室分离自桃子表面。三丁酸甘油酯培养基 ( g /
L ) :酵母膏 10,三丁酸甘油酯 02%, 葡萄糖 3,琼脂
20,用 6 mo l/L NaOH 调 pH71。液体种子培养基
( g /L ):葡萄糖 15,酵母膏 25, 蛋白胨 35, KH 2 PO 4
05, M gSO 424, NaH2 PO4 12,表面活性剂 04%, 发
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
酵培养基:同液体种子培养基, 添加 4%蓖麻油。渗
透压稳定剂 (简称渗稳剂 ): 08 mo l/L山梨醇, 用
02mo l/L磷酸缓冲液 ( pH 58)配制。以上灭菌条
件为 121 , 20 m in。 01%的 巯基乙醇 PB溶液:
蜗牛酶 (联星生物公司生产 ), 用渗稳剂配制, 045
m微孔膜过滤除菌。 癸内酯标样: A lfa Aesar公
司。YC211恒温培养摇床 (上海欣蕊自动化设备有
限公司 ) ; SHZ88A型恒温水浴振荡器 (江苏太仓市
实验设备厂 ) ; GC14B (日本岛津公司 )。
1. 2 原生质体的制备
参照陈冬纯 [ 7 ]的方法制备原生质体。研究了
菌龄、酶液浓度、酶解时间 ( 30、40、50、60 和
70 m in)、酶解温度 ( 26、28、30和 32 )等条件对原
生质体形成率与再生率的影响。
1. 3 原生质体紫外诱变
将原生质体用渗稳剂稀释制成悬液, 活菌计数。
取 1 mL菌悬液置于直径 6 cm的培养皿中, 磁力搅
拌, 15W紫外灯, 照射距离 30 cm,照射时间为 5、
10、15、20、25和 30m in。诱变结束后将原生质体悬
液用渗稳剂稀释至浓度为 1 105个 / mL, 吸取
01mL涂布于再生平板上,用锡纸避光, 28 培养。
为避免光复活, 以上操作均在红光下进行。再生培
养 5 d后进行菌落计数, 原生质体的诱变致死率计
算公式:
诱变致死率 (% ) = (A - B) /A 100
式中, A为诱变前原生质体再生率, B为诱变后
原生质体再生率。
1. 4 高产菌株的筛选
选取诱变致死率在 80%左右再生平板上的单
菌落,每个再生平板选 3株,移入三丁酸甘油酯平板
培养, 根据透明圈大小进行复筛, 每个平板接种 9
株,再进行第 2次筛选,从每个平板中选出 3株进行
下一轮筛选,反复筛选 3次,选出 5株透明圈较大的
诱变株进行摇瓶发酵, 装液量 50 mL /250 mL, 温度
28 ,转速 200 r/m in, 发酵时间 78 h, 接种量 8%。
按文献 [ 8]进行发酵液后处理及 GDL产量测定。
1. 5 传代稳定性试验
将 癸内酯高产菌株接种于斜面培养基, 30
培养,连续传代 4次,摇瓶发酵检验所选育酵母菌的
传代稳定性。
2 结果与讨论
2. 1 毕赤酵母 TT009的生长曲线
根据 TT009酵母的生长曲线可知其延滞期为
8 h,在此期间菌体生长较慢, 12- 32 h为对数生长
期, 生长迅速, 32- 52 h为稳定生长期, 52 h后进入
衰退期。
2. 2 不同生长时期对原生质体形成率的影响
分别选取对数生长早期 (菌龄 12、16 h) 、后期
( 28、32 h)、稳定期 ( 48 h)和衰退期早期 ( 60 h)的菌
体进行原生质体制备,结果见图 1。从图 1可知, 采
用对数生长早期 16 h的细胞原生质体形成率较高。
图 1 菌龄对原生质体形成率的影响
2. 3 酶解浓度对原生质体形成率的影响
考查了浓度为 05%、10%、15%、20% 和
25%的蜗牛酶液对原生质体形成率的影响, 结果见
图 2。原生质体形成率与酶的浓度密切相关, 浓度
大于 1%原生质体制备率的提高程度缓慢, 再生率
降低幅度较大,对该酵母而言, 用 1%蜗牛酶制备原
生质体比较适宜。
图 2 酶解浓度对原生质体形成率
和再生率的影响
2. 4 酶解时间对原生质体形成率的影响
酶解时间对原生质体形成率与再生率的影响结
190
2010年第 5期 徐勤等 :原生质体紫外诱变选育 癸内酯高产菌株
果见图 3。从图 3可知,酶解时间越长,原生质体形
成率越高, 而再生率则越低, 这是由于酶解时间越
短,细胞壁脱壁越不完全,较易再生出细胞壁, 酶解
时间过长,导致去壁程度过深, 原生质膜易被酶液破
坏,失去合成细胞壁的引物使再生较困难,确定酶解
时间为 50m in。
图 3 酶解时间对原生质体形成率和
再生率的影响
2. 5 酶解温度对原生质体形成率的影响
将处理后的酵母菌分别在不同温度下用蜗牛酶
酶解,结果见图 4。由图 4可以看出, 酶解温度过低
( 26 ) , 酶解不彻底, 产生的原生质体数及再生率
较低; 酶解温度过高 ( 32 ), 原生质体大量生成,但
高温致使再生率降低。综合考虑, 控制酶解温度在
28 为宜。
图 4 酶解温度对原生质体形成率和
再生率的影响
综上所述, 毕赤酵母原生质体形成与再生的最
佳条件为选择摇瓶中培养 16 h的菌体, 28 , 1%蜗
牛酶液,酶解 50 m in, 此时原生质体形成率可达到
94%,原生质体再生率为 25% - 35%。
2. 6 原生质体紫外诱变剂量选择
紫外线具有杀菌和诱变双重生物学效应。过高
剂量致死率容易产生负突变,据报道 [ 9] ,一般致死率
在 70% - 80%左右剂量诱变效果更好, 其结果见图
5。由图 5可知, 随着照射时间延长,致死率明显提
高。确定合适诱变剂量为置于 15W紫外灯 30 cm处
照射 25m in,致死率约为 87%。
图 5 紫外诱变时间对原生质体致死率的影响
2. 7 诱变株的筛选
诱变 3次,筛选出 5株透明圈较大的酵母菌, 再
次筛选, 结果见图 6。由图 6可知, 诱变所筛菌株
M6发酵培养后其 癸内酯产量达到 125 g /L, 较
TT009的 癸内酯产量提高了 288%。
图 6 不同突变株对 癸内酯产量的影响
2. 8 传代稳定性
酵母菌株 M6连续传代 4次, 癸内酯产量稳定
在 10 g /mL左右。通过转代试验证明,原生质体诱
变后筛选获得的突变株 M6的遗传性状基本稳定。
3 结论
以从桃子表面分离的毕赤酵母 TT009(P ichia
(下转第 202页 )
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(上接第 191页 )
guilliermond ii TT009)为出发菌株, 对该菌株的原生
质体进行紫外诱变, 再生, 初选, 摇瓶复选, GDL产
量达到 125 g /L, 比诱变前提高了 288%。由此可
见,用原生质体紫外诱变的方法提高 GDL产量效果
比较显著,为今后的研究提供了一定的参考。
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