全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 2期·研究报告·
收稿日期：2008-07-08
基金项目：国家 863 计划项目（2006AA02Z153），上海市科委生物医药重大科技攻关项目（06DZ19020）
作者简介：夏明星（1982-），男，重庆万州人，硕士研究生，主要从事天然药物与血管生成抑制方面的研究；E-mail：mingxing825@yahoo.com.cn
通讯作者：金坚（1960-），男，教授，博士生导师，从事细胞与分子药理学研究；Tel：0510-85918219，E-mail：jinjian31@126.com
肿瘤血管生成为肿瘤的生长提供营养和氧气，
同时也为肿瘤的转移提供通路。 因此，抑制肿瘤血
管生成是肿瘤生物防治的新策略。内皮细胞作为血
管生成的主要成分在血管生成中具有中的作用。因
此， 抑制内皮细胞的生长就能阻止血管的形成，进
而对肿瘤起到抑制作用。目前围绕血管生成各个环
节所形成的靶点，成为筛选新化合物的工具 ，已广
泛应用的先导化合物的筛选 [1]。 中医药是否具有抑
制肿瘤血管生成的作用，是否能通过抑制肿瘤新生
血管生成达到抑制肿瘤生长的目的，国内学者已经
王不留行中抗人微血管内皮细胞增殖的有效组分
的分离和纯化
夏明星 冯磊 张莲芬 李英 储敏 金坚
（江南大学医药学院细胞与分子药理实验室，无锡 214122）
摘 要： 从中药王不留行中筛选具有抑制内皮细胞增殖的有效单一组分。大孔树脂吸附法进行总皂甙的分离纯
化，分别收集不同浓度乙醇溶液洗脱液用SRB法进行细胞活性检测，选择有效部分用AKTA Resource柱分离，按紫外吸
收峰收集洗脱液并进行活性验证，通过蒸发光散射检测组分复杂程度，选择活性高、丰度大、成份简单的峰进行C18柱分
离。结果表明，王不留行提取液经大孔树脂分离和细胞活性检测发现50%~90%乙醇浓度洗脱液具有细胞活性，经AKTA
Resource柱分离得7种组份群（0～6），细胞活性测得3～6号组分有活性，选择4号组分过C18柱得5组分（A~E），B组分
为有紫外吸收的主峰，但无细胞活性，其活性分布于D和E组分中，其IC50值为3.75μg/ml，D组分经蒸发光散射检测
为单峰。经上述方法分离纯化获得抑制人微血管内皮细胞增殖的单一组分群，其单一化合物具有潜在的利用价值。
关键词： 王不留行 内皮细胞 分离纯化
Isolation，Purification and Identification of Chemical Compound
from Semen vaccariae to Inhibit Endothelial Cells
Xia Mingxing Feng Lei Zhang Lianfen Li Ying Chu Min Jin Jian
（Laboratory of Cell and Molecular Pharmacology，School of Medicine and Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract： The study aimed at screening a unity chemical compound fromsemen vaccariae to nhibit roliferation
and growth of endothelial cells. Isolation and purification of total saponin in macroporous resin，and gradient elution by
the alcohol with diversity of concentration were carried out. The utility region was isolated by AKTA Resource column，
where the elution was collected based on ultraviolet absorption. Meanwhile，detecting the elution by ELSD and choosing
the fraction with high activity，abundance and reconstituent simply to further segregation were accomplished. Finally，the
unity chemical compound were obtained by C18column. Results showed that，semen vaccaria extracts were isolated by
macroporous resin，with 50%~90% alcohol concentration elution that have the activity to inhibit the endothelial cells.
Seven groups（0~6）were obtained，and the 3~6 samples were proved to have the capability to inhibit the target cells.
Five groups （A~E） were further separated from sample 4 where the B groups were the main peak with obvious
ultraviolet absorption，but no inhibition on endothelial cells，D and E groups that had the activity in ECs. Thus，the
homogeneous chemical which can inhibit proliferation and growth of endothelial cells compound had been discovered.
Key words： Semen vaccariae Endothelial cell Isolation and purification
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
作了一些研究，包括对中药提取物，中药注射剂，以
及单味中药煎剂和中药复方等进行了研究 [2]。
王不留行为石竹科植物麦蓝菜[Vaccaria seget-
alis（Neck）Garcke]的干燥成熟种子，异名为不留行，
王不流行，王母牛，大麦牛，金剪刀草，金盏银台，麦
蓝子。主产于河北、山东、辽宁、黑龙江等地，以河北
产量最大。王不留行的药用部位，多系根、茎、叶、花
与种子并用，而目前则用种子。 王不留行中主要含
有三萜皂苷、黄酮苷、环肽、类脂和脂肪酸，单糖等。
该植物苦、平；入肝、胃经。 对行血通经，催生下乳，
消肿敛疮、妇女闭经、乳汁不通 、难产、血淋、痈肿、
金疮出血等有很大效用 [3]。 鉴于王不留行的潜在价
值，国内外对其化学成分进行了广泛研究。 20 世纪
60 年代前苏联学者曾报道从中分得皂甙， 日本学
者又从中分得 5 个环肽 [4]。 桑圣民等 [5]从河北产麦
蓝菜 （Vaccaria segetalis）的种子的乙醇提取物中分
得 22 个化合物，并鉴定了氢化阿魏酸（hy2droferulic
acid）、尿核苷 （uridine）、王不留行环肽 A （segetalin
A）、王不留行环肽 B（segetalin B）、王不留行环肽 D
（segetalin D）和王不留行环肽 E（segetalin E）等 6 种
化合物 [6]。 目前，还未见报道有关王不留行抑制肿
瘤血管生成的研究，因此从王不留行中提取抑制内
皮细胞增殖的化合物具有潜在的意义。
1 材料及仪器
1.1 药品及仪器
中药材王不留行购于三禾中药饮片公司，大孔
树脂 D101 购于安徽三星树脂有限公司； 人微血管
内皮细胞（HMEC-1）法国国立卫生所惠赠；MCDB131
培养基（购于 SIGMA），SRB 染液（购于 SIGMA），EGF
表皮生长因子 （SIGMA），小牛血清 （上海冠羽生物
科技有限公司），双抗（青霉素 ，链霉素），胰蛋白酶
（Ameresco），乙腈和甲醇 （TEDIA 美国 ），Multiskan
MK3 酶标仪 ， 蛋白分离纯化系统 （AKTA 瑞典 ），
THERMACO2 培养箱（美国），低温冷冻干燥仪 （La-
bconco），agilent1100HPLC（美国 ），NIKON 倒置显微
镜（日本）；96 孔细胞板（COSTAR 3599）购于美国。
1.2 内皮细胞培养
人微血管内皮细胞接种于 MCDB131 培养液中
培养， 含 10%新生小牛血清，100 U/ml 青霉素，100
μg/ ml 链霉素，于 37℃、5 %CO2 及饱和湿度的培养
箱中孵育，用胰酶消化传代，每 2 d 传代一次，取对
数生长期的细胞用于活性检测试验 [7]。
2 方法
2.1 SRB 法细胞增殖抑制试验
将悬浮好的细胞加到 96 孔板中培养 ， 每孔
8 000 个。 常规培养 24 h 后加药后继续放到培养箱
中培养 48 h 取出，倾去培养基，每孔加入 10%TCA
100 μl，4℃固定 30～40 min。 再倾去固定液，并用超
纯水侧向冲洗， 置于通风橱晾干， 加入 SRB 染液
100 μl /孔，染色 30～40 min。 最后用 1%的醋酸溶液
冲洗细胞板并烘干，每孔加入 100 μl Tris.HCl，用酶
标仪在 540 nm 波长下测吸收值，并计算 IC50 值。
2.2 大孔树脂分离王不留行活性组份群
准确称量 200 g 王不留行中药材， 加入适量水
（2 L）煎煮 ，合并煎煮液，高速离心（8 000 r/min，10
min），离心液冷却至室温，得上清液 2 L 待用。 大孔
树脂经预处理、装柱等过程，方法见文献 [8]。 将药
液注入柱中吸附，用 2～3 倍柱体积去离子水洗去不
吸附的杂质，用 30%、50%、70%和 95%的乙醇溶液
进行洗脱。 收集不同浓度的洗脱液，并经旋转蒸发
和低温冷冻干燥得固体粉末，准确称取一定量的粉
末配成溶液，用微孔滤膜过滤除菌备用。
2.3 AKTA Resource 柱进一步分离活性组分群
经大孔树脂分离所得有效组分群用 AKTA Re-
source 柱进一步分离 ，进样 15 ml，流动相为乙腈 。
洗脱条件 ：用 5%的乙腈平衡 1 个柱体积 （CV），然
后线性梯度洗脱 10 个 CV， 乙腈浓度由 5%递增到
20%。 接着线性梯度洗脱 5 个 CV， 乙腈浓度增至
40%， 最后用 100%的乙腈洗 1 个 CV 完成 1 个循
环。 样品的收集依据紫外吸收图谱进行分段收集，
然后将各段收集的样品进行旋转蒸发，除去有机溶
剂，并用低温冷冻干燥的固体粉末。 所得的固体经
细胞活性检测，判断有活性的分段区域。
2.4 HPLC蒸发光散射检测 Resource柱分离的样品
样品用超纯水配制成 1 mg/ml 溶液待用，进样
20 μl。 色谱柱为 Dikma HPLC column diamonail C18
（十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，250 mm×19 mm，
5 μm），流动相为水和甲醇。 洗脱条件为起始浓度
50%甲醇，线性梯度洗脱至终浓度 100%甲醇。 流速
0.8 ml/min，柱温 30℃，洗脱时间 40 min，甲醇浓度
94
2009年第 2期

(n)
µg/ml
1 2 3 4
100 11.304±4.300 12.565±3.433 91.303±1.297
90.462±2.685

50 8.930±3.238 6.107±0.780 90.555±3.752 89.858±0.726
30 7.648±5.328 7.158±3.094 52.905±6.911 42.162±4.688
15 15.398±4.575 2.243±3.927 19.038±3.547 11.400±5.049


到达 100%后维持 4 min。
2.5 C18 柱进一步分离
制备性 C18 柱（Waters sunfireTM prep C18 OBD）购
于 WATERS 公司 （型号：19×150 mm，5 μm）。 分离
条件由分析性的 C18 柱得出，进样量为 2 ml，其固含
物小于 50 mg。 流动相为水和甲醇，洗脱起始浓度
为 50%甲醇，平衡 1 个 CV，线性梯度洗脱 8 个 CV，
终浓度至 100%甲醇，并维持 1 个 CV 洗脱。 紫外检
测波长为 215 nm，根据紫外信号进行分段收集。 将
收集的样品旋转蒸发除去流动相中的有机溶剂，并
低温冷冻干燥制得样品。最后将样品进行细胞增殖
抑制试验，选出具有细胞活性的组分。
2.6 HPLC 蒸发光散射检测 C18 柱分离的样品
将 C18 柱分离得到的组分进行 HPLC 蒸发光散
射检测 ，色谱柱为 Agilent ZORBAX Eclipse XBD-C18
（用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ，250 mm×19
mm，5 μm），流动相水和甲醇。进样 20 μl，洗脱条件
为起始浓度 50%甲醇 ， 线性梯度洗脱至终浓度
100%甲醇 。 流速 0.8 ml/min，柱温 30℃；洗脱时间
24 min，甲醇浓度到达 100%后维持 5 min。
2.7 统计分析
实验数据经统计软件 SPSS 16.0 处理， 试验结
果以 x±s 表示，组间比较采用 t 检验。 P <0.05 为差
异有统计学意义。
3 结果
3.1 乙醇洗脱液细胞活性检测结果
SRB 法用于检测不同浓度乙醇洗脱液对内皮
细胞的增殖作用， 图 1 表明 100 μg/ml 的不同浓度
洗脱液对内皮细胞的抑制率。 加药 48 h 后 70%乙
醇洗脱液具有极强抑制细胞增殖活性，其抑制率达
到 95.17%，比原液的抑制率稍高。 50%乙醇洗脱液
的活性次之，其抑制率为 51.89%。 其它浓度的洗脱
液和阴性对照无明显差异，没有细胞增殖抑制活性。
3.2 AKTA Resource 柱分离图谱及所得组分细
胞活性检测
将 70%的乙醇洗脱液 （2 L） 旋转蒸发浓缩到
200 ml，经 AKTA Resource 柱分离，每次进样 20 ml，
所得分离图谱见图 2。 紫外吸收波长为 215 nm。 在
制备收集过程中，共分成 6 部分进行收集（1~6），其
具体的收集起始体积见图 2，SRB 细胞活性结果表
明 1 号和 2 号组分没有细胞抑制效果，而 3、4、5 和
6 各组分都有细胞活性，它们之间活性效价差异不
大，其中 3 号的活性最高。 当给药浓度为 10 μg/ml
时 ，3 号样品细胞抑制率为 79.12%，4 号抑制率为
70.00%，6 号抑制率为 77.47%（表 1，表 2）。 将有活
性的组分进行累积收集，并旋蒸和冷冻干燥后得固
含物 ， 分别称重 3 号 1.346 g，4 号 0.891 g，5 号
0.546 g，6 号 2.574 g。
3.3 HPLC 蒸发光散射检测 Resource 柱分离样品
的结果
将 Resource 柱分离得到的组分首先进行了细
胞活性检测，通过细胞增殖抑制试验发现活性主要
分布在组分 3、4、5 和 6 中。因此将这 4 部分同时进
行蒸发光散射检测，通过检测结果发现 4 号组分中
成分复杂程度较其它组分低。 图 3 所示，其中 B 峰
具有紫外吸收，而 D 峰无紫外吸收。 因此在制备的
过程中能通过紫外信号将 B 峰和 D 峰分开。
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1 2 3 4 5 6
细
胞
生
长
抑
制
率
（ %
）
1.水 ；2.乙醇30%；乙醇3.50%；乙醇4.70%；乙醇5.5%；6.原液
图 1 乙醇洗脱液对细胞生长抑制的测定结果
表 1 各组分细胞活性抑制率百分比 (x±s) ( n=4)
注：* 与空白对照比较 P<0.05
夏明星等：王不留行中抗人微血管内皮细胞增殖的有效组分的分离和纯化 95
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
3.4 4 号样品经制备型 C18 柱的分离及其细胞活
性检测结果
通过对各样品活性、 丰度及复杂程度的考察，
选择 4 号组分往下分 。 色谱柱为制备型 C18 柱
（Waters sunfire）， 在制备收集过程中， 共分成 5 组
分进行收集，分离结果如图 4 所示。 其紫外信号与
HPLC 检测时一致。在收集过程中共分成 5 段收集，
B 峰和 D 峰按峰型收集， 其余组分为区间段收集。
同时也将这 5 组分进行细胞活性检测，结果表明 D
峰及其后面的组分具有抑制活性，B 峰和 B 峰前的
部分没有活性。 表明 B 峰与 D 峰对细胞增殖的抑
制率，其中 D 峰的 IC50 为 3.75 μg/ml（图 5）。同时在
倒置显微镜下也能观测到细胞形态的变化（图 6）。
3.5 D 峰的蒸发光散射检测结果
由于 D 峰的紫外吸收很弱， 仅在 215 nm 波长
下有吸收，而 215 nm 波长为非特征波长，因此选用
蒸发光散射检测器（ELSD）进行信号采集。 根据该
检测器的原理，它的应用范围很广，能检测到没有
紫外吸收且不挥发的物质 。 通过图谱可以得出 D
峰是比较纯的化合物（图 7）。

(n)
µg/ml
1 2 3 4
40 98.505±0.630
96.768±1.426
99.210±0.321
98.723±0.666

20 95.850±1.822 88.404±2.880 75.342±8.110 99.182±0.357
10 83.912±3.771 67.880±12.764 79.855±4.013 77.552±7.660


表 2 各组分细胞活性抑制率百分比 (x±s) ( n=4)
注：* 与空白对照比较 P<0.05
mAU
4000
3000
2000
1000
0
0 200 400 600 800 1 000 1 200 1 400 ml
图 2 70%乙醇洗脱液经 Resource 柱分离图谱
0.0～900 ml；1.900~1 010 ml；2.1 010～1 140 ml；3.1 140~1 272 ml；
4.1 272~1 360 ml；5.1 360~1 420 ml；6.1 420~1 520 ml
图 3 4 号蒸发光散射检测图谱
图 4 4 号样品经制备型 C18 分离图谱
A.0～120 ml；B.120～135 ml；C.135～200 ml；
D.200～220 ml；E.220～380 ml
图 5 B 峰与 D 峰抑制内皮细胞增殖活性比较
浓度（μg/ml）
图 6 B 峰与 D 峰抑制内皮细胞增殖活性比较
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2009年第 2期
4 讨论
传统的肿瘤治疗方法有化疗 、 放疗和手术治
疗，但这些治疗都有各自缺点，使肿瘤的治疗效果
不理想。如今肿瘤生物防治作为新的治疗策略给肿
瘤治疗注入了新的活力，目前围绕抗肿瘤血管生成
药物的研究正如火如荼地进行。一些抗血管生长抗
体已进入临床实验，同时对于血管生成相关的信号
调控研究也在逐步深入。中国的传统中药通过调节
身体机能，增强抵抗力，起到了一定的治疗效果。但
随着科技的发展，一些新技术的应用，促使了对中
药作用机理的认识，加速了中药现代化的进程。
以内皮细胞为筛选参照，从中药中分离纯化有
活性的化合物，并通过 HPLC 进行纯度验证及细胞
活性的时时追踪，最后分离得到 D 峰，该化合物经
细胞增殖抑制试验测定其 IC50 值为 3.75 μg/ml。 通
过倒置显微镜观测到加药后的细胞形态发生明显
变化，细胞固缩变圆，细胞数量减少。表现出明显的
细胞抑制活性。由于中药中所包含的化合物种类繁
多，结构复杂，含量低，这给分离纯化带来极大的困
难，其最后得到的物质的量往往很少 ，使后续试验
难以推进。同时其结构的复杂给结构解析和化学合
成带来极大困难。鉴于各种原因本试验只分离纯化
了其中的一部分，对于其它具有活性的区域还需要
进一步研究。
活性方面只进行了抑制内皮细胞增殖试验，因
此还需要对抑制肿瘤血管生成活性进行深入研究，
如对内皮细胞粘附性的影响， 细胞迁移的影响，以
及抑制内皮细胞增殖的机理研究。同时通过体内血
管生成模型构建，考察该化合物是否能抑制血管生
成。 作为药物还应考虑安全因素，进行体内和体外
毒理试验，确定最高致死量和半数致死量，这些都
是后续需要研究的课题。
参考文献
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图 7 D 峰蒸发光散射检测图谱
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