全 文 ：植物学通报 2005, 22 (2): 169~174
Chinese Bulletin of Botany
①国家自然科学基金重大研究计划项目(90202016)、面上项目(40152002)及国土资源部岩溶动力学重点实
验室开放基金资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: yulongjiang@mail.hust.edu.cn
收稿日期：2003-12-18 接受日期：2004-04-27 责任编辑：孙冬花, 于昕
实 验 简 报
西南岩溶地区黄荆叶片碳酸酐酶的稳定性①
曾宪东 余龙江② 李 为 杨 英 吴 云
(华中科技大学生命科学与技术学院 武汉 430074)
摘要 研究表明西南岩溶地区几种植物叶片中含有明显活性的碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA)，
从黄荆(Vitex negundo)叶片提取碳酸酐酶，该酶具有良好的热稳定性。阴离子及岩溶环境主要金属离
子对碳酸酐酶活性有一定的影响，Ca2+、Mg2+低于10 mmol.L-1，Mn2+ 、Zn2+低于0.01 mmol.L-1，
Co2+、Cu2+低于0.001 mmol.L-1，NO3-、Cl-、Br-、I-、NO2-低于0.01 mmol.L-1时，酶活性较稳定。
0.001~0.01 mmol.L-1的Ca2+、Mg2+对该酶有激活作用。研究结果表明, 该酶比较适应岩溶土壤水体的
离子环境从而保持酶活性的相对稳定。
关键词 碳酸酐酶(CA)， 热稳定性，金属离子，阴离子，岩溶地区
Stability of Carbonic Anhydrase in Leaves of Vitex negundo in
Karst Areas of Southwest China
ZENG Xian-Dong YU Long-Jiang② LI Wei YANG Ying WU Yun
(School of Life Science & Technology, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430074)
Abstract This paper describes the determination on the activity of carbonic anhydrase (CA,
EC4.2.1.1) of plant species in karst areas of Southwest China. CA was extracted from leaves of
Vitex negundo. The thermostability of CA and the effects of anions and metallic ions on CA
activity were investigated. CA activity was stable at different temperatures and relatively stable
when the concentration of Ca2+ and Mg2+ was lower than 10 mmol.L-1; Co2+ and Cu2+ lower than
0.001 mmol.L-1; and Zn2+, Mn2+, NO3-, Cl-, Br-, I- and NO2- lower than 0.01 mmol.L-1. CA could
be activated by Ca2+ and Mg2+ at 0.001~0.01 mmol.L-1. Thus, CA had a relative adaptability and
could maintain the activity well in the ions condition of soilwater and karstwater.
Key words Carbonic anhydrase(CA) , Thermostability , Metallic ion , Anion , Karst area
碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA, EC4.
2.1.1)是植物中普遍存在的一种金属酶，它的
活性中心含有一个催化活性所必需的锌原
子，催化 CO2进行可逆水合反应(Smith and
Ferry, 2000; Tripp et al., 2001)。淡水微藻
(Park et al., 1999)、大型海藻(侯和胜, 1997)
以及豆类(Johansson and Forsman, 1993)、玉
米(Lu and Stemler, 2002)等作物中碳酸酐酶的
170 22(2)
研究报道较多。有关文献表明，碳酸酐酶在
光合作用中起着重要作用(Badger and Price,
1 9 9 4 )，该酶在微藻细胞表面和胞内介导
HCO3-、CO2等无机碳的转运，被认为是藻
类 C O 2 浓缩机制( C O 2 - c o n c e n t r a t i n g
mechanism, CCM)的重要组分(Moroney and
Somanchi, 1999; 何培民等, 2002)。可以说，
碳酸酐酶是植物体细胞内外碳素转移和利用
的一个重要调节物。
另一方面，岩溶地质学提出岩溶动力系
统是碳酸盐(CaCO3) -CO2 -H2O三相循环的开
放不平衡系统(袁道先, 1993)，而生物圈的碳
循环以CO2为中心，生物体及生物酶的作用
可能加速该系统的运行(袁道先, 2001)。H+作
为碳酸盐岩溶解的侵蚀剂促使CO2和H2O向
H+和HCO3-转换是碳酸盐岩风化的第一步，
此反应可能是碳酸盐岩溶解速率的决定因素
(刘再华, 2001)，而碳酸酐酶正是该反应专一
的生物催化剂。刘再华和Dreybrodt (2001)将
牛的碳酸酐酶用于石灰岩溶蚀试验，发现不
同 CO 2分压都能使石灰岩溶解速率增加数
倍。上述研究所用的酶都来源于动物，酶活
性在岩溶环境中是否稳定是酶在岩溶发育中
发挥作用的基础，有关这方面的研究尚未
见报道。本文以西南岩溶地区高等植物
为材料研究碳酸酐酶的稳定性，为评价
植物碳酸酐酶在生物岩溶中的作用和地位
提供了理论参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料来源
选取广西岩溶地区典型植物黄荆(Vitex
negundo)、桂花(Osmanthus fragrans)、檵
木(Loropetalum chinensis)、苦丁茶(Ilex
kudingcha)、金银花(Flos lonicerae)和任豆
(Zenia insignis)等，测定其叶片碳酸酐酶活
性，并从黄荆新鲜叶片中提取碳酸酐酶进行
酶稳定性的研究。
1.2 碳酸酐酶的提取
岩溶环境中的土壤由于钙镁元素的大量
迁移而呈偏碱性(蒋忠诚, 1999)。采集黄荆新
鲜叶片，冰箱保存。取 7 g叶片剪碎加液氮
研磨，每克叶片加入 8 mL 提取缓冲液(50
mmol.L-1 HEPES-KOH，10 mmol.L-1 DTT，
pH 8.2)匀浆，7 000 r.min-1 离心 5分钟，上
清液即为粗提液。粗提液加入固体(NH4)2SO4至
相对饱和度为 30%，放置 6小时后，4 000
r.min-1离心15分钟除去沉淀，上清液继续加
入(NH4)2SO4至相对饱和度为65%，4 ℃放置
过夜，4 000 r.min-1离心 15分钟，收集沉
淀，溶于8 mL 50 mmol.L-1 (pH8.2)的HEPES-
KOH缓冲溶液中，透析 12小时，每 3小时
换一次缓冲溶液，透析液定容至100 mL后于
4 ℃保存。以上操作均在 4 ℃下进行。
1.3 碳酸酐酶活性的测定
碳酸酐酶活性的测定参照 Brownell 等
(1991)方法略作改进，在一个4 ℃的冷冻反应
室中, 加入5 mL巴比妥-KOH缓冲液(pH8.3, 20
mmol.L-1)，并加入0.5 mL煮沸或未煮沸的样
品液，再注入 4.5 mL冰冷的CO2饱和水，测
定 pH下降的速度差异。酶活单位数(U)由公
式 10(T0/Te-1)求得，T0和 Te分别为加入煮
沸和未煮沸样品液测得的pH下降一个单位所
需时间。酶活性以每 mg蛋白含有的酶活单
位数(U.mg-1)表示。蛋白含量测定采用福林-
酚法 (李如亮, 1998)。
1.4 碳酸酐酶的热稳定性
将 1.2 节所得透析液分别在 1 0、2 0、
30、40、5 0 和 6 0 ℃温浴一定时间 ,测定
其酶活性。以 0 ℃的酶活性为对照，其
他温度处理下的测定的酶活性与之相比的
百分数定义为相对活性。
1.5 储存的黄荆叶片碳酸酐酶稳定性
称取新鲜黄荆叶片，每份1 g，分别在0~5
℃，10~15 ℃，20~25 ℃，30~35 ℃储存，每
2天取 1份检测叶片粗提液的碳酸酐酶活性。
1712005 曾宪东等: 西南岩溶地区黄荆叶片碳酸酐酶的稳定性研究
1.6 金属离子和阴离子对碳酸酐酶活性的
影响
配制好一定浓度的 Zn2+、Ca2+、Mg2+、
C o 2 +、C u 2 +、M n 2 + 以及 C l-、B r-、I-、
NO2-、NO3-溶液，低温保存。将酶液与离
子溶液按1:1混合使各种离子达到所需的终浓
度，低温下平衡 40分钟，检测酶活性。数
据为 3次平行测定的均值。
2 结果与分析
2.1 广西岩溶地区几种典型高等植物的碳
酸酐酶活性
所选取的几种高等植物在西南岩溶地区
分布较广，有一定的代表性。采集新鲜叶片
及其新近凋落的枯叶，测定碳酸酐酶活性。
结果表明(表1)，这些植物新鲜叶片中有明显
的碳酸酐酶活性，枯叶中也有一定的酶活
性。以黄荆、桂花和苦丁茶为例，同等重
量的枯叶中的酶活性平均为新鲜叶片中酶活
性的 14%～32%。
2.2 碳酸酐酶的热稳定性
碳酸酐酶活性以相对活性表示(表2)，在
0～40℃范围内保温30分钟后碳酸酐酶活性受
温度影响较小，酶活性保持 85% 以上；温
度更高，对酶活性影响较大，但在 60℃温
浴处理 20分钟，酶活性依然保存 54.7%。可
见，常温下，该酶具有良好的热稳定性。
2.3 储存的叶片中碳酸酐酶稳定性
如图 1所示，不同的储存温度代表不同
季节的环境温度。结果表明，0~5℃、10~15℃、
20~25℃和30~35℃下储存 10天，新鲜叶片中
碳酸酐酶相对活性分别为 91.8%、92.5%、
88.7%和 79.1%。30~35℃下的酶活性稍
低；随储存时间推延，酶活性下降相对较
快。储存第 1 4 天，磷酸酐酶相对活性依
次为 72 .8%、77 .0%、65 .4% 和 28 .8%。
可见，储存温度对酶活性有一定影响，但
初期活性变化的差别不大，相对比较稳
定。这与 2.1 中枯叶仍含较高的酶活性的
实验结果相一致。
表 1 几种典型植物叶片的碳酸酐酶活性
Table 1 CA activity in the leaves of several typical plants
Vitex Osmanthus Loropetalum Flos Ilex Zenia Ilex
negundo fragrans chinensis lonicerae kudingcha insignis kudingcha
(G/D) (G/D) (G/D) (G/D) (G/D) (G/D) (G/D)
CA activity 32.8/4.67 37.9/5.35 3.79/1.03 9.22/1.91 54.81/17.8 41.51/9.9 38.33/6.8
(U.g-1 leaves)
G. 绿叶; D. 落叶 G. Green leaf; D. Defoliation
表 2 温度对碳酸酐酶活性的影响
Table 2 Effect of temperature on CA activity
Temperature (℃) Control (0) 10 20 30 40 50 60 (20 min)
Relative activity of CA (%) 100.0 103.3 103.5 97.0 85.6 64.3 54.7
图 1 储存叶片中碳酸酐酶活性变化曲线
Fig.1 Change in CA activity in stored leaves
172 22(2)
2.4 金属离子对碳酸酐酶活性的影响
参照广西弄拉岩溶地区的元素背景，本
实验选取几种主要金属离子进行研究，结果
表明(图2)，一定的金属离子浓度范围内酶活
性稳定。以不加离子为对照，0.001~0.01
mmol.L-1 的Ca2+和Mg2+对碳酸酐酶活性有一
定的激活作用，当浓度高于0.01 mmol.L-1时开
始表现微弱的抑制作用。Ca2+和Mg2+浓度
为 1 mmol.L-1的条件下，酶的相对活性分别
为 95.4%和 92.5%。钙、镁离子浓度达到 10
mmol.L-1 (数据未列出)时，酶活性仍可保持
75%以上。对于 Mn 2+ 和 Zn 2+，当浓度为
0.01 mmol.L-1时，酶相对活性分别为90.6%
和 85 .7%，浓度更高抑制作用较明显。而
Co2+和Cu2+在浓度为 0.001 mmol.L-1时，酶
的相对活性分别为 75.9%和 81.0%，离子浓
度增大则抑制作用很强，当 Co 2 +浓度为
0.1 mmol.L-1时相对活性为43.9%。金属离子
对碳酸酐酶的作用在于酶活性中心的锌可能
会由于其他金属离子的替代等原因而影响催
化活性(王夔, 1996)，同时，Co2+和 Cu2+等
重金属可导致酶构像改变，蛋白变性，活性
受到抑制。
2.5 阴离子对碳酸酐酶活性的影响
如图 3所示，几种阴离子对碳酸酐酶活
性有一定的影响，在阴离子浓度低于 0 .01
mmol.L-1时，酶活性比较稳定。随着浓度增
大，阴离子对碳酸酐酶的抑制作用依次为
NO2-＞ I-＞ Br-＞ Cl-，而 NO3-对碳酸酐
酶的抑制作用与 I -大致相同。其中，
NO3-、Cl-、Br-和 I-浓度为 0.01 mmol.
L-1时，酶的相对活性分别为86.5%、92.9%、
91.6%和80.0%；而NO2-的抑制作用较强，
该浓度下相对活性为57.2%。碳酸酐酶构像
变化的热力学研究表明，Cl-、Br-和 I-等阴
离子作为碳酸酐酶的阻化剂可以影响酶分子
构像的改变，并且随着阴离子半径的增加，
它们与碳酸酐酶的结合会更加牢固(刘云娜和
谈夫, 1997)。本实验结果与上述研究结果一
致 。
3 讨论
碳酸酐酶是迄今已知催化速率最高的
酶，其催化作用能把二氧化碳水合反应的速
率提高 7个数量级(王夔, 1996)。同时，它在
图 2 金属离子对CA活性的影响
Fig.2 Effects of metallic ions on CA activity
A. Mg2+; B. Co2+; C. Ca2+ ;D. Zn2+; E. Cu2+ ; F. Mn2+
图 3 阴离子对CA活性的影响
Fig.3 Effects of negative ions on CA activity
A. NO2-; B. I-; C. Br-;D. Cl-; E. NO3-
1732005 曾宪东等: 西南岩溶地区黄荆叶片碳酸酐酶的稳定性研究
光合作用、钙化、维持 pH平衡和离子输送
等过程中也具有重要生理功能(王夔, 1996;
Henry, 1996)。自然界碳酸酐酶分布广泛，
而且含量相当可观，某些植物中磷酸酐酶
占可溶性蛋白的 1 %～2 % (郭敏亮和高煜
珠 , 1989)。本研究结果表明，在西南岩
溶地区的黄荆、桂花和苦丁茶等多种典
型植物中都含有较高的碳酸酐酶活性，
可以推断西南岩溶地区环境植被中含有
丰富的碳酸酐酶。
本文选取桂林岩溶试验场植物黄荆为材
料进行研究，结果表明碳酸酐酶的热稳定性
较好。在 0~40 ℃处理 30分钟酶活性保持良
好，50 ℃、60 ℃分别处理 30分钟、20分
钟后仍保存 64.3%、54.7%的活性。多种高
等植物碳酸酐酶都具有良好的热稳定性，豌
豆碳酸酐酶在 60 ℃下处理 15 分钟仍保持
40%的活性，棉花碳酸酐酶在 55 ℃处理20
分钟仍有 60%的活性，其碳酸酐酶的热失
活活化能比较高，为146.3 kJ(郭敏亮和高煜
珠, 1989)。
对黄荆新鲜叶片在不同温度储存过程中
碳酸酐酶的活性变化进行研究，表明储存初
期10天中碳酸酐酶活性比较稳定，而后活性
下降加快，但两周内存留活性仍然较高。另
外，离子浓度分别对碳酸酐酶有一定的影
响，而在离子浓度各自为[Ca2+]、[Mg2+]≤
10 mmol.L-1, [Mn2+]、 [Zn2+]≤0.01 mmol.L-1，
[Co2+]、[Cu2+]≤ 0.001 mmol.L-1，[NO3-]、
[Cl-]、[Br-]、[I-]、[NO2-]≤ 0.01 mmol.L-1
时，酶活性稳定。其中，0.001~0.01 mmol.
L-1的 C a 2 +、M g 2 + 对该酶有激活作用。
对照广西弄拉岩溶泉水和土壤水的元素
背景值(蒋忠诚, 2000)，由表 3可见，Cu2+、
Co2+含量远低于 0.001 mmol.L-1，Mn2+含量
也远低于0.01 mmol.L-1，Zn2+在土壤水中含
量较高时接近 0.01 mmol.L-1，相比而言，
Ca2+、Mg2+含量较高但也都低于10 mmol.L-1。
综合本实验结果可知，植物碳酸酐酶对该岩
溶环境中几种主要金属离子的浓度有较好的
适应性，酶活性相对稳定。
生物在岩溶发育过程中的作用越来越多
地受到重视，随着研究的深入和发展形成了
新兴的交叉边缘学科——生物岩溶学。生物
岩溶作用包括直接作用和间接作用，后者即
生物通过新陈代谢改变周围环境的物理化学
性质(对岩溶而言主要是CO2和水文动态)，形
成生物微环境，作用于碳酸盐岩(曹建华和袁
道先, 1999)，进而在地球表层带形成一个复
杂的岩溶生态系统。根据国际地质对比计划
IGCP379项目的研究，生物及其特种酶在岩
溶动力系统的运行中具有十分重要的作用(袁
道先和蒋忠诚, 2000)。研究表明碳酸酐酶对
碳酸盐岩的溶解具有催化加速作用(Liu and
Dreybrodt, 1997)，本文对岩溶地区植物的碳
酸酐酶进行研究，结果为进一步评价植物碳
酸酐酶在生物岩溶中的作用和地位提供了有
价值的理论依据。
表 3 广西弄拉岩溶环境中主要金属离子的含量(蒋忠诚, 2000)
Table 3 Several main metallic ionic concentration in karst environment of Nongla, Guangxi
Ionic concentration in soilwater Ionic concentration in karstwater
(mmol.L-1) (mmol.L-1)
Mg2+ 0.345~1.00 0.980~1.625
Ca2+ 0.452~2.819 1.717~1.971
Zn2+ 0.0016~0.0103 0.00012
Mn2+ 0.0002~0.0014 0.00007~0.00005
Cu2+ 0.00002~0.00005 0~0.00004
Co2+ 0.0001~0.0003 0.00005~0.0001
174 22(2)
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通讯, (3): 75-80
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