全 文 ：植物学通报 2005, 22 (增刊): 37~42
Chinese Bulletin of Botany
①通讯作者。Author for correspondence. E-mail: hlhuang@genetics.ac.cn
收稿日期: 2004-07-05 接受日期: 2004-12-30 责任编辑: 孙冬花, 于昕
实 验 简 报
胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建立
2张 娅 1曾君祉 1周志勇 2陈毓荃 1黄华木梁①
1(中国科学院遗传与发育生物学研究所 北京 100101) 2(西北农林科技大学生命科学学院 杨凌 712100)
摘要 为了建立高效的胡萝卜遗传转化体系, 本实验选用3个胡萝卜(Daucus carota var. sativa)栽培品
种: ‘金笋五寸’、‘Carol’和‘改良黑田七寸’, 以它们的下胚轴和子叶为外植体, 首先建立了高频愈伤诱
导体系。在此基础上, 以Carol的下胚轴和愈伤组织为受体材料, 利用根癌农杆菌LBA4404介导转化质
粒pBI121。经X-Gluc染色, 证明GUS基因瞬间表达成功, 经PCR方法鉴定, 证明GUS基因已整合到胡
萝卜的染色体中, 从而建立了高效的胡萝卜遗传转化体系。
关键词 胡萝卜, 组织培养, 遗传转化, GUS基因
Carrot Tissue Culture and the Establishment of an Effective
Genetic Transformation System
2ZHANG Ya 1ZENG Jun-Zhi 1ZHOU Zhi-Yong 2CHEN Yu-Quan 1HUANG Hua-Liang①
1(Institute of Genetics and Developmental Biology, the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101)
2(College of Life Science, Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry, Yangling 712100)
Abstract In order to establish an effective genetic transformation system of carrot, we firstly
established an effective callus-inducible system of carrot by using hypocotyls and cotyledons
as explants from 3 kinds of carrot (Daucus carota var. sativa) breeding lines. Hypocotyls and
calli of carrot were infected with Agrobacterium tumefaciens LBA4404 harboring pBI121. By
using X-Gluc staining, we confirmed the transient expression of the GUS gene. PCR analysis of
regenerated plants confirmed that the GUS gene had been introduced into the plant genome.
All of these results indicated that the effective genetic transformation system had been
established.
Key words Carrot, Tissue culture, Genetic transgenic, GUS gene
胡萝卜(Daucus carota var. sativa) 作为
一种最早的植物组织培养模式植物之一, 其组
织培养和转化的研究已经取得了一定的成
果。目前, 以胡萝卜块根、叶柄、子叶、下
胚轴等作为外植体,进行组织培养、悬浮培
养、原生质体培养, 通过器官形成或体细胞
胚途径获得再生植株均有现成的方法可供
借鉴。胡萝卜的叶柄、子叶、下胚轴、根、
愈伤组织及悬浮细胞都能作为遗传转化受
体。Scott和Draper (1987)就指出胡萝卜的悬
38 22(增刊)
浮细胞是十分理想的研究外源基因表达的模
式系统。同年, 刘稚等(1987)报道了农杆菌转
化胡萝卜悬浮培养细胞的研究结果, 转化效率
约为 10-4。刘明志(1996)发现酚类化合物可
以促进农杆菌对胡萝卜悬浮细胞的转化, 以乙
酰丁香酮的效果最显著; 并且首次报道了GUS
基因在转化苗的各器官中的表达。赵秀英等
(2000)将乙肝病毒表面抗原基因通过电击法导
入胡萝卜悬浮细胞, 并在转化的愈伤组织细胞
团中检测到 GUS基因的表达; 同时从转化的
愈伤组织中提取总蛋白, 通过双夹心ELISA检
测到HBsAg。王凌健等(2001)以胡萝卜无菌
苗的下胚轴和子叶为外植体, 实现了肺结核杆
菌分泌蛋白MPT64的转化。上述工作虽然取
得了很多的成果, 但是由于胡萝卜的总蛋白浓
度较低, 这给转化苗的鉴定工作带来了很大困
难, 尤其是翻译水平的鉴定。所以用一种快
速有效的方法鉴定目的基因是否整合与表达
十分必要。本实验以胡萝卜栽培品种‘金笋
五寸’、‘Carol’和‘改良黑田七寸’无菌苗的
下胚轴、子叶为外植体, 建立了高频愈伤诱
导体系。用根癌农杆菌介导的遗传转化将
GUS基因导入胡萝卜的下胚轴和愈伤组织细
胞, 获得了转 GUS基因的转化苗, 并利用 X-
Gluc染色, 实现了对转化苗的快速有效鉴定,
建立了高效的胡萝卜遗传转化体系。
1 材料与方法
1.1 植物材料
胡萝卜(Daucus carota var. sativa)‘金
笋五寸’, 购自北京市种子公司;‘Carol’ (法国
品种)、‘改良黑田七寸’(日本品种), 由北京
市农林科学院蔬菜研究中心孙盛湘老师惠
赠 。
1.2 菌株与质粒
大肠杆菌 (Escherichia coli) Top10, 购自
美国 Invitrogen Corporation; 根癌农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404为本实
验室自存。质粒 pBI121为本实验室自存, 带
有选择性标记基因 NPTII和报告基因 GUS。
1.3 胡萝卜无菌苗的获得
胡萝卜种子经75%乙醇浸泡30秒, 无菌水
冲洗2遍, 再用0.1%升汞浸泡10分钟, 无菌水
冲洗3～5次后, 接种于不含任何激素的 1/2
MS固体培养基(含1.5%蔗糖)上, 于24 ℃暗
培养条件下萌发7～10天后, 将子叶和下胚
轴切成 0.5 cm的截段作为组织培养和遗传
转化的材料。
1.4 胡萝卜的组织培养
1.4.1 不同品种及外植体最佳培养基选择
试验 将3个胡萝卜品种的子叶和下胚轴, 分
别接种于含不同浓度激素的诱导培养基上, 待
愈伤组织形成后转接于分化培养基上, 分化芽
和根,长成植株。愈伤组织诱导采用MS(Mura-
shige and Skoog, 1962)和B5(Gamborg et al.,
1968)2种基本培养基, 分别补加1 mg.L -1 2,4-D
+ 0 mg.L-1 KT(代号为MS和B5)、1.5 mg.L-1
2,4-D+ 0 mg.L-1 KT(MS1) 和1 mg.L-1 2,4-D
+0.2 mg.L-1 KT (代号为MS+KT和B5+KT) 3种
激素组合; 继代和分化培养基采用不含激素的
MS培养基(MS0)。上述培养基的蔗糖浓度除
MS1培养基为5%外, 其余均为3%; pH值为5.8;
生根培养基为不含激素的MS培养基, 蔗糖浓
度为1.5%(MS01)。
1.4.2 暗培养与冷处理后愈伤组织的诱导
按1.3节所述方法, 分别将萌发的‘Ca-rol’和‘改
良黑田七寸’无菌苗放在24 ℃暗培养箱中培养
10天后, 将外植体截段接种于B5培养基上, 24
℃, 12小时/天散射光下培养, 诱导愈伤组织。
将未经暗培养和冷处理的材料作为对照, 统计
出愈数, 计算出愈率, 比较暗和冷处理对诱导
愈伤组织的影响。
1.5 胡萝卜的遗传转化
农杆菌菌液(OD600=0.3～0.5)20 mL, 1 760
g离心10分钟, 收集菌体后用5 mL 1/2MS液
体培养基重悬。将经过冷处理的下胚轴在上
392005 张 娅等: 胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建立
述菌液中侵染10分钟, 接种在无抗生素的B5
固体培养基上, 26 ℃、黑暗条件下共培养两
天。再转接于附加 50 mg.L-1 卡那霉素(Km)
和500 mg.L-1羧苄霉素(Cb)的B5培养基上, 10
天后转接于附加50 mg.L-1 Km和300 mg.L-1
Cb的B5培养基上, 每 10天转接 1次, 筛选抗
性愈伤组织。愈伤组织的转化方法同下胚轴
相同, 共培养选用MS0培养基。将抗性愈伤
组织转接于附加100 mg.L-1Km和300 mg.
L-1Cb的MS0培养基上, 每 10天转接 1次, 待
愈伤组织分化出绿芽后, 转接于合50~100 mg.
L-1 Km和100 mg.L -1 Cb的MS01培养基上, 诱
导长根、形成苗后, 转接于无抗生素的 1/2
M S 培养基上。
1.6 转化苗的鉴定
分别取抗性植株和未转化植株的叶片各
0.2 g, 用 CTAB法(Murray and Thompson,
1980)提取植物总DNA。以提取的DNA为模
板, PCR扩增外源 DNA片段, 上游引物为
CaMV35S启动子一段序列(35S), 5AGATT-
AGCCTTTTCAATTTCAGAA3, 下游引物为
G U S 基因中部一段序列 ( m i d G U S ) ,
5TCTTCATGACGACCAAAGCC3。PCR反
应条件为: 95 ℃, 预变性 10～15分钟; 95 ℃,
变性 30秒, 55 ℃, 退火 30秒, 72 ℃, 延伸 30
秒, 25个循环; 72 ℃, 延伸 5分钟。参照《植
物分子生物学实验指南》(Maliga et al., 2000),
对转化 4天后的愈伤组织和转基因植株的叶
片进行GUS基因组织化学鉴定, 观察GUS基
因在转化苗中的表达情况。
2 实验结果
2.1 愈伤组织的诱导
2.1.1 不同基因型及外植体对愈伤组织诱
导的影响 表1结果表明, 以3个胡萝卜品种
的子叶为外植体诱导愈伤组织, 出愈率最高为
‘金笋五寸’, 达50%; 在培养基中同时添加2,4-D
和KT的效果比只添加2,4-D差; 蔗糖浓度的增
加(见MS1培养基)没有提高出愈率; 从总体效
果看, B5培养基略优于MS培养基。表2结果表
明, 3个胡萝卜品种中最高出愈率情况为接种
‘Carol’ 的下胚轴在B5培养基上, 达到91%。其
他条件的最优选择结果与接种子叶的相同。
综上所述, 3个胡萝卜品种以‘Carol’的出
愈率为最高; 外植体子叶与下胚轴比较, 无论
是什么培养基, 下胚轴的出愈率都要高于子
叶。所以在下面的实验中可以选择胡萝卜
‘Carol’的下胚轴为受体材料, 接种在B5培养
基上, 这样出愈率可以达到最大。
2.1.2 暗与冷处理对胡萝卜愈伤组织形成
的影响 结果表明, 暗处理对‘Carol’和‘改良
黑田五寸’的出愈率没有多大影响; 但冷处理
后的下胚轴出愈率有明显提高。
至此, 我们建立了胡萝卜的高频愈伤诱导
体系, 即接种经低温处理10天的‘Carol’品种的
下胚轴在 B5培养基上, 诱导愈伤组织。并希
望在此基础上获得高效的遗传转化体系。
2.2 胡萝卜的转化
表 1 3个胡萝卜品种子叶最佳培养基选择实验
Table 1 The experiment of selecting the best culture medium for 3 carrot varieties’ cotyledons
Variety Culture medium
MS B5 MS+KT B5+KT MS1
‘Jinsunwucun’ Inoculation account 29 24 27
Induction account (induction rate %) 2(6.3) 12(50) 2(7.4)
‘Carol’ Inoculation account 46 47 62 18 1 1 0
Induction account (induction rate %) 17(37) 9(20.5) 1(1.6) 7(38.9) 7(6.4)
‘Gailliang’ Inoculation account 85 65 82 1 1 9
‘Heitianqicun’Induction account (induction rate %) 4(4.7) 22(33.8) 15(18.3) 9(7.6)
40 22(增刊)
分别以‘Carol’经冷处理的下胚轴和愈伤
组织作为受体材料, 利用根癌农杆菌LBA4404
介导转化质粒 pBI121。
2.2.1 下胚轴的转化 卡那霉素抗性实验表
明, 接种在附加 30 mg.L-1 Km的培养基上的
未经转化的下胚轴不能诱导形成愈伤组织。
而经转化的下胚轴接种于附加50 mg.L-1 Km
的B5培养基上, 9~10周后开始形成抗性愈伤
组织。转化的 124块下胚轴中, 有 42块分化
出抗性愈伤组织, 频率为33.9%。形成的抗性
愈伤组织可以继续分化出芽和根, 长成抗性植
株 。
2.2.2 愈伤组织的转化 卡那霉素抗性实验
表明, 接种在附加80 mg.L-1 Km的培养基上的
未经转化的愈伤组织可分化出白化苗, 而且很
容易死亡, 这与Km抑制叶绿素合成的机理是
一致的。而接种在附加 100 mg.L-1 Km的培
养基上则愈伤组织不能分化出芽。将经过农
杆菌侵染转化的愈伤组织接种于附加100 mg.
L-1 Km的培养基上, 4周后开始分化出绿色的
抗性芽, 并继续分化出根, 长成抗性植株。得
到的 32株抗性植株, 经 PCR鉴定, 有 17株可
以扩增出目的条带, 转化效率为 53.1%。
转化下胚轴与愈伤组织相比, 转化下胚轴
得到抗性植株的周期比较长, 需大约4个半月
的时间; 而转化愈伤组织, 从开始转化到得到
第一株抗性苗仅需要两个月, 时间缩短了一半,
但转化苗的假阳性较高, 在得到的32株卡那霉
素抗性苗中仅有17株可以扩增出特异性的目
的基因片段, 这可能是由于转化的愈伤组织接
种在抗性培养基上时, 不可能每部分转化材料
都接触到培养基, 这样不利于Km对细胞壁的
渗透, 而增加了假阳性的比率。
2.3 转化苗的鉴定
2.3.1 转化苗的 PCR检测 以 35S和
midGUS为上、下游引物对GUS基因进行PCR
检测, 结果在1 000 bp左右扩增出特异的条带。
2.3.2 GUS基因的组织化学鉴定 由于
pBI121含有GUS报告基因, 所以用LBA4404/
pBI121转化得到的转化体可以通过X-Gluc的
表 2 不同胡萝卜品种下胚轴最佳培养基选择实验
Table 2 The experiment of selecting the best culture medium for 3 carrot varieties’ hypocotyls
Variety Culture medium
MS B5 MS+KT B5+KT MS1
‘Jinsunwucun’ Inoculation account 57 32 63
Induction account (induction rate %) 9(15.8) 20(62.5) 25(39.7)
‘Carol’ Inoculation account 55 66 166 14 248
Induction account (induction rate %) 37(67.3) 60(91) 35(21.1) 9(64.3) 58(23.4)
‘Gailliang’ Inoculation account 116 107 125 117
‘Heitianqicun’ Induction account (induction rate %) 25(21.6) 77(72) 51(40.8) 16(13.7)
表 3 暗与冷处理对胡萝卜愈伤组织生成的影响
Table 3 Effects of light and low temperature treatments on callus induction
Variety Different treatment Explant account Callus account Induction rate (%)
‘Carol’ Dark treatment 197 112 56.9
Non-dark treatment 214 123 57.4
Low-temperature treatment 379 108 28.5
No low-temperature treatment 586 101 17.2
‘Gailliang’ Dark treatment 69 21 30.4
‘Heitianqicun’ Non-dark treatment 73 25 34.2
412005 张 娅等: 胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建立
染色来证明 GUS基因的存在。
图2中转化的愈伤组织被染成蓝色, 而未
经转化的愈伤组织无阳性着色反应。图 3 中
转化苗的叶片可以被染成蓝色, 而对照非转化
苗的叶片未被染色。说明 pBI121的 GUS基
因在愈伤组织中得到表达。
3 讨论
建立高效、稳定的植物组织培养的再生
系统是植物转基因研究的前提。植物品种的
不同, 外植体类型的不同, 培养基中激素种
类、浓度的不同等都会影响诱导愈伤组织的
频率。我们通过对这些因素的探讨, 获得了
胡萝卜的较为理想的高频愈伤诱导体系, 最高
的出愈率可以达到 91%。在本试验中以刚萌
发的无菌苗的下胚轴和子叶为外植体, 下胚轴
的出愈率要明显高于子叶。另外, 在本实验
中, 以MS为基本诱导培养基的出愈率明显低
于B5培养基, 出愈率最高仅为67%, 而用B5培
养基可以达到 91%。同时实验还发现, 暗处
理对诱导愈伤组织的频率没有什么影响, 而低
温处理则会提高诱导愈伤组织的频率。
在以往的胡萝卜转化实验中,虽然有许多
成功的例子, 但是转化效率却有很大的差别。
如Takaichietal(2000)以LBA4404菌株为转化
媒介, 对2个胡萝卜品种(‘Kuroda-gosun’ and
‘NantesScarlet’)进行遗传转化, 转化率分别为
1.2%和11.8%。当用农杆菌菌株C58C1介导
转化时, 2个品种的转化率分别为6.8%和6.1%,
平均转化率为6.4%。部分实验表明使用乙酰
丁香酮后转化效率有所提高(刘明志, 1996; 郑
回勇等, 2002)。王凌健等(2001)对胡萝卜的无
菌苗进行低温处理,子叶和下胚轴的抗性愈伤
诱导频率大大提高,比未经处理的对照高出
2～3倍,最高的达77%(未经处理的子叶和下胚
轴抗性愈伤诱导频率分别为 3 0 . 6 % 和 3 7 .
9%)。在本试验中, 将胡萝卜萌发 7天的下胚
轴经过低温处理10天后, 接种于1 mg.L-1 2,4-
D的B5培养基上, 诱导愈伤组织, 利用农杆菌
介导转化愈伤组织, 其最高的转化效率可以达
图 1 转化苗中GUS基因的 PCR检测
M. DL2000 Marker; 1. 阳性对照 pBI121; 2. 未转
化苗; 3~8. 转化苗
Fig. 1 PCR assay of GUS gene in transgenic
plants
M. DL2000; 1. Positive control pBI121; 2. Non-
transformed plant; 3-8. Transgenic plants
图2 非转化愈伤组织(A)和经LBA4404/ pBI121
转化的愈伤组织(B)的X-Gluc染色
Fig. 2 X-Gluc dying of the non-transformed calli
(A) and the LBA4404/pBI121 transformed calli(B)
图 3 非转化苗(A)和转化苗(B)叶片的X-Gluc染
色
箭头所指为染成的蓝色
Fig. 3 X-Gluc dying of the non-transformed
laminae(A) and the transformed laminae(B)
Arrows indicate the position of the blue for dyeing
42 22(增刊)
到53.1%, 与以前的实验结果相比是较理想的
遗传转化体系。同时我们发现在转化胡萝卜
下胚轴细胞的过程中, 无菌苗的萌发时间很重
要, 一般选择萌发7～10天后的无菌苗下胚轴,
此时的植物细胞处于活跃分化的状态, 易于转
化。过于幼嫩的下胚轴, 在受到农杆菌侵染
后, 两端的切口部分会变褐、腐烂、细胞坏
死, 这一点在花椰菜转化过程中也同样存在(徐
淑平等, 2002)。另外, 在农杆菌介导转化胡萝
卜的愈伤组织过程中, 我们也发现转化材料以
选择下胚轴接种在B5培养基上6周后形成的
愈伤组织, 转化效率最高。此时的愈伤组织
胚性最强, 易于转化和分化出苗, 而愈伤组织
分化时间过长, 会失去胚性, 降低分化能力, 降
低转化效率。这些都说明受体材料的生理状
态十分重要。同时经冷处理的下胚轴诱导形
成的愈伤组织, 转化效率有增高的趋势, 这一
点与王凌健的实验结果相同(王凌健等, 2001),
最高的转化效率可以达到52%, 是较理想的高
效遗传转化体系。
GUS基因的活性在转化愈伤组织 4天后
就可以通过X-Gluc染色确定, 这对于鉴定目的
基因整合与表达快速而有效。
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