全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (4): 442-450, w w w .chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2009.04.005
收稿日期 : 2009-02-18; 接受日期 : 2009-04-22
基金项目 : 国家自然科学基金 (No.30671082)
* 通讯作者。E-mail: jiajf 38@nw u.edu.cn
.研究报告.
草木樨状黄芪和木本霸王的科间体细胞杂交
张改娜1, 2, 贾敬芬2*
1河南科技大学农学院 , 洛阳 471003; 2西北大学生命科学学院陕西省生物技术重点实验室, 西安 710069
摘要 在成功培养原生质体的基础上, 用改进的PEG-高pH高钙法诱导草木樨状黄芪(Astragalus m eli lo toides)和木本霸王
(Zygophyllum xanthoxylum)原生质体融合, 得到了科间体细胞杂种融合细胞。采用罗丹明-6G预处理草木樨状黄芪原生质
体以及UV-B辐照霸王原生质体, 使双亲原生质体及其同源融合产物均不能持续分裂而死亡, 融合后的杂种细胞由于生理互补
可恢复持续分裂能力而被筛选出来。融合产物经培养分裂获得了2个杂种细胞系, 其中1个分化出芽。染色体计数和分子鉴定
证明了杂种的真实性。初步比较了杂种细胞系及亲本对盐分和水分胁迫的耐受性, 结果表明杂种细胞系对盐分和水分胁迫的
耐受性介于两个亲本之间。
关键词 草木樨状黄芪 , 原生质体融合 , 体细胞杂交 , 木本霸王
张改娜 , 贾敬芬 (2009). 草木樨状黄芪和木本霸王的科间体细胞杂交 . 植物学报 44, 442-450.
通过原生质体融合和培养产生体细胞杂种是克
服有性不亲和性、实现远缘遗传重组和转移多基因
控制性状的可行途径。植物体细胞杂交是植物生物
技术的重要组成部分。随着技术手段的不断改进,
在植物种内、种间、属间甚至科间的原生质体融合,
都已成功获得了体细胞杂种。一些优良的性状, 特
别是野生种的抗病(Gavri lenko et al. , 1992; 张丽等,
2008)、抗旱(Begum et al., 1995)和胞质雄性不育
(Kofer et al. , 1992)等性状已通过体细胞杂交被成功
地转移到栽培植物中。植物的抗逆性状多为多基因
控制, 因此较之转基因技术, 体细胞杂交在提高植物
抗逆性方面有一定的优势。本研究所用的草木樨状
黄芪(Astragalus melilotoides)是一种生长在西北地区
的多年生豆科牧草和优良饲草 , 有较强的离体再生
能力, 其组织培养(陈刚等, 2001 )和原生质体培养
(Zhang e t a l. , 2008)均已获得成功。木本霸王
(Zygophyllum xanthoxylum)则是生长在沙漠地区的一
种蒺藜科灌木 , 抗旱固沙能力很强, 本研究组已建立
这种植物的原生质体培养体系。本研究通过不对称
原生质体融合技术建立了这 2种植物科间体细胞杂
交的实验体系 , 探索将沙漠植物引入离体遗传操作
的新途径 , 以期为开发利用沙漠植物遗传资源提供
理论依据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
草木樨状黄芪(Astragalus melilotoides Pall.)种子采自
中国科学院宁夏沙坡头治沙站, 用种子苗叶片分离原
生质体; 木本霸王(Zygophyllum xanthoxylum Maxim)
种子采自新疆吐鲁番沙漠植物园, 用种子苗下胚轴诱
导的愈伤组织分离原生质体。
1.2 方法
1.2.1 亲本原生质体的分离、收集纯化及活力检测
草木樨状黄芪原生质体的分离和收集参照 Zhang等
(2008)报道的方法。取转代培养第 14天的木本霸王
愈伤组织, 分离和收集原生质体, 具体步骤参照我们
已报道的方法(张改娜等, 2006)。采用酚臧花红染色
法(W idholm, 1972)检测原生质体的活力。
443张改娜等: 草木樨状黄芪和木本霸王的科间体细胞杂交
1.2.2 亲本原生质体的预处理
罗丹明 -6G(Rhodamine-6G, R-6G)处理液的配制 : 将
R-6G溶解于含 100.0 g.L-1 二甲基亚砜(dime thy l
sulfoxide, DMSO)的Ca(NO3)2洗液(0.275 mol.L-1, pH
5.8)中, 配成 1 mg.mL-1的母液, 过滤灭菌。设 6种
R-6G处理浓度, 即 40、50、60、80、90和 100 mg.
mL-1。将纯化的草木樨状黄芪原生质体用R-6G溶液
处理 10 分钟, 再用 Ca(NO3)2 洗液和 DPD 培养液
(Durand et al., 1973)分别离心(400 x g)洗涤 1次, 悬
浮于培养液中 , 调整细胞密度为 1×106.mL-1, 作为杂
交亲本备用。以未处理的原生质体为对照 , 每个处理
设 3次重复。DPD培养液为附加有2.0 mg.L-1 2,4-D、
0.2 mg.L-1 6-BA、2% 蔗糖和 0.3 mol.L-1甘露醇的
DPD液体培养基。
将纯化的霸王原生质体悬浮在 DP D培养液中 ,
调整细胞密度至 3.5×105.mL-1, 平铺在直径为 6 cm
的玻璃培养皿中(1.5 mL每皿), 形成薄层, 用波长为
297 nm的紫外线(UV)照射处理。照射强度为 80 mJ.
s-1.cm-2, 分别照射 0、1、2、3、5、10和 15分钟后,
液体浅层培养 24小时, 观察原生质体活力 , 每个处
理设 3次重复。
1.2.3 原生质体诱导融合
将预处理后的双亲原生质体以大约 1:1的比例, 混合
悬浮于 Ca(NO3)2洗液中, 然后将混合液滴加到直径
为 6 c m 的培养皿中, 静置 20 分钟。将聚乙二醇
(polyethylene glycol, PEG)融合诱导液(Xia and Chen,
1996)一对一地滴在原生质体混合液滴上, 静置 5分
钟, 然后加入两倍体积的Ca(NO3)2洗液, 在室温下静
置 30分钟, 使原生质体贴到培养皿底部。然后将洗
液吸去, 用DPD液体培养基洗涤3次, 每次间隔10分
钟。最后加入 DPD培养液, 用 parafilm膜封口, 25°C
暗培养直至形成杂种小愈伤组织。
实验同时采用下列组合作为对照: (1)未经 R-6G
处理的草木樨状黄芪原生质体单独培养; (2)未经紫外
线照射处理的霸王原生质体单独培养; (3)经过紫外线
照射处理的草木樨状黄芪原生质体培养; (4)经过 R-
6G处理的霸王原生质体培养 ; (5)未经诱导融合处理
的双亲原生质体混合培养。融合物与对照皆用DPD
培养液进行液体浅层培养。
1.2.4 杂种融合细胞的鉴别和筛选
用上述 Ca(NO3)2洗液将异硫氰酸荧光素(fluorescein
isothiocyanate, FITC)配制成1 mg.mL-1的母液, 使用
浓度为 20 µg.mL-1。在诱导融合之前标记霸王原生
质体 10分钟。在 Leica荧光显微镜下 , 霸王原生质体
细胞质呈绿色, 草木樨状黄芪原生质体中含叶绿体,
细胞质呈红色 , 异核体同时显示两种荧光而被鉴别。
此外, 适当浓度R-6G处理的草木樨状黄芪原生质体 ,
细胞质失活而不能分裂。适当剂量紫外线(UV-B)处
理的霸王原生质体 , 因DNA受损伤也失去分裂能力。
只有异源融合细胞由于生理互补效应, 可以恢复活力
并持续分裂。根据这一筛选体系 , 可淘汰两亲本的原
生质体及同源融合产物 , 筛选出杂种细胞。
1.2.5 杂种融合细胞的培养和杂种愈伤组织的形成
及分化
培养在 DPD 培养液中的融合细胞部分恢复分裂能
力, 持续分裂形成小愈伤组织。经在附加相同激素的
DPD固体培养基上扩增后, 将杂种愈伤组织转入附加
有适当浓度6-BA(0.5-1.5 mg.L-1)、2-iP(0.1-1.5 mg.
L-1)和 ZT(0.1-0.5 mg.L-1), 并含脯氨酸(500 mg.L-1)
和谷氨酰胺(500 mg.L-1)及 3%或 6%蔗糖的MS培养
基上诱导芽的分化。
1.2.6 染色体计数
取双亲及杂种继代培养第 10天的分裂旺盛的疏松的
愈伤组织为材料 , 参照张改娜等(2006)的方法进行染
色体计数。
1.2.7 杂种愈伤组织的RAPD和线粒体CAPS(PCR-
RFLP)分析
采用 CTAB法(顾红雅和瞿礼嘉 , 1998)从双亲及杂种
愈伤组织中提取模板 DNA。RAPD分析参照Williams
444 植物学报 44(4) 2009
等(1990)的反应体系, PCR反应程序为: 94°C预变性
8分钟, 36°C退火 60秒, 72°C延伸 90秒, 1个循环;
94°C变性 60秒, 36°C退火60秒, 72°C延伸 90秒, 45
个循环; 72°C延伸5分钟。将扩增产物在含有0.5 mg.
mL-1溴化乙锭的 1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳分析 ,
用凝胶成像系统观察结果并拍照。
线粒体 CAPS分析参照Guo等(2004)的方法。采
用线粒体特有基因 18S rRNA 和 5S rRNA 及 nad4
exon1和 nad4exon2的 2对引物, 扩增线粒体特有片
段, 并用限制性内切酶 Taq I单酶切。采用 3.0%的琼
脂糖凝胶电泳分析酶切产物。
1.2.8 杂种愈伤组织对渗透胁迫的抗性分析
将杂种和 2个亲本的愈伤组织分别移至盐胁迫培养
基和水分胁迫培养基上培养 25天, 然后统计愈伤组
织的相对生长量(愈伤组织增加的重量占接种时愈伤
组织重量的百分比), 分析杂种愈伤组织对盐胁迫和
水分胁迫的耐受程度。
盐(N aCl )胁迫培养基为 M S 分化培养基附加
0.7%琼脂, NaCl浓度设 0、0.5%、1% 和 1.5% 4个
梯度。pH值调至 5.8。
水分胁迫培养基为 MS 基本培养基附加甘露醇 ,
浓度设 0、10%、15%和 20% 4个梯度; 或者附加聚
乙二醇(PEG, 分子量为 6 000 Da), 浓度设 0、10%、
15%和 20% 4个梯度。调 pH值至 5.8, 高压灭菌。
1.2.9 PEG胁迫下杂种愈伤组织的游离脯氨酸含
量测定
将杂种愈伤组织和 2 个亲本愈伤组织分别移至含
10%PEG的模拟干旱胁迫培养基上生长 30天, 然后
采用酸性茚三酮法(龚富生和张嘉宝 , 1995)测定愈伤
组织中游离脯氨酸的含量 , 以此比较杂种及2个亲本
愈伤组织对 PEG干旱胁迫的耐受能力。
2 结果与讨论
2.1 不同浓度的R-6G处理对草木樨状黄芪原生
质体活力的影响
用 6种不同浓度的 R-6G溶液处理新分离出来的草木
樨状黄芪叶肉原生质体 , 洗涤后调整细胞密度为
1×106.mL-1, 在 DPD培养液中培养 24小时后, 观察
原生质体的活力。结果如表 1所示, 与未处理对照相
比, 40 µg.mL-1处理组的活力明显降低, 而 R-6G浓
度超过 60 µg.mL-1的各处理组, 原生质体活力已经
很低, 成活的原生质体不能持续分裂。据此, 本研究
采用 60 µg.mL-1 R-6G处理 10分钟的草木樨状黄芪
原生质体作为诱导融合的一个亲本。
2.2 紫外线照射对木本霸王原生质体活力的影响
用 UV-B 对刚分离出来的霸王原生质体辐照后培养
24小时, 观察原生质体的活力。由表 2可以看出, 照
射 0.5分钟时, 原生质体活力已有极显著下降; 照射
3分钟时, 原生质体活力降至2.7%。照射超过5分钟,
表 1 不同浓度的罗丹明 -6G(R-6G)处理对草木樨状黄芪原
生质体活力的影响
Table 1 The ef fect of diff erent concentrations of rhodamine-
6G (R-6G) on the v iability of protoplas ts of As tragal us
melil otoides
Concentration of R-6G (mg.mL-1) V iability of protoplasts (%)
0 (CK) 68.5
40 21.0
50 11.7
60 0.5
80 0
90 0
100 0
表 2 不同紫外线照射时间对霸王原生质体活力的影响
Table 2 The effec t of diff erent duration of UV radiation on the
viability of protoplasts of Zygophyl lum xanthoxyl um
Duration of UV radiation (min) Viability of protoplasts (%)
0 70.8
0.5 12.8
1 4.8
3 2.7
5 0
10 0
15 0
445张改娜等: 草木樨状黄芪和木本霸王的科间体细胞杂交
原生质体培养24小时后, 几乎全部死亡。因此选择UV
处理 3分钟和 5分钟的霸王原生质体作为融合亲本 ,
未经紫外线照射的原生质体为对照, 共设 2个组合。
此外还发现, 经 UV照射的霸王原生质体与对照
相比, 细胞聚集现象较少 , 且分裂较晚。培养24小时
后对照细胞已经变大 , 一部分成为椭圆形 , 2-3天发
生了第1次分裂, 而紫外线照射后的原生质体细胞变
形现象却发生得较晚, 一般约在第 3天, 第 1次分裂
也延迟到第 9天。
2.3 融合原生质体细胞的分裂
在初始培养的1-2天, 原生质体异源融合细胞的细胞
质中叶绿体还未均匀分布, 异核体较易识别(图 1A)。
在荧光显微镜下观察, 可见绿色的霸王原生质体与红
色的草木樨状黄芪原生质体粘连(图 1B)。经过融合
处理并培养 1天后, 原生质体粘连界限消失, 形成融
合原生质体。单独培养的亲本原生质体及混合培养
的双亲原生质体在 2-3天开始分裂, 并在 1个月后形
成小愈伤组织。而融合细胞培养 9天之后才出现第1
次分裂, 以后的细胞分裂也比较缓慢, 且分裂频率很
低, 多数融合培养物进行了1次或少数几次分裂后就
不再分裂。经UV照射 3分钟的霸王原生质体与经R-
6G处理的草木樨状黄芪原生质体融合产物(图1C)培
养 2个月后, 出现了 2块直径为 1.5-2 mm的结构致
密的小愈伤组织 , 分别编号为 1#和 2#。
2.4 杂种愈伤组织的扩增和芽的分化
上述 1#和 2#杂种小愈伤组织经过继代培养 , 获得了
扩增的杂种细胞系 1#和2#(图 1D, E)。在多种分化培
养基上进行杂种愈伤组织的分化 , 结果显示, 仅在 6-
BA(1.5 mg.L-1) + 2-iP(1.0 mg.L-1) + ZT(0.5 mg.L-1)
的 MS 培养基上, 杂种 1#愈伤组织分化出少量幼芽
(图 1E), 存活大约 20天, 未能长成植株。
体细胞杂交技术虽然从理论上可以克服远缘杂
交不亲和, 但双亲分类距离过远, 其核质即使通过体
细胞杂交仍有排斥现象。当部分染色体缺失后 , 由于
不可知的原因 , 虽然得到了杂种克隆的细胞系, 但是
它们却很难分化出再生植株。杂种植株的再生与其
染色体的消减程度密切相关(Wang et al. , 2005)。
2.5 杂种愈伤组织的染色体计数
染色体计数结果表明, 草木樨状黄芪的染色体数目为
32(图 2A), 木本霸王为 22(图 2D), 杂种 1#为 45条(图
2B), 杂种 2#为 48条(图 2C)。2个杂种细胞系的染色
体数目均少于两亲本染色体数目之和, 表明原生质体
图 1 草木樨状黄芪和木本霸王原生质体的融合及杂种愈伤
组织的获得
(A) PEG诱导的双亲原生质体融合; (B) 荧光显微镜下观察的
草木樨状黄芪 (红色)和霸王(绿色)原生质体融合 ; (C) 2个杂种
细胞克隆 ; (D) 杂种细胞克隆 2#愈伤组织; (E) 杂种细胞克隆
1#愈伤组织分化芽(箭头所示)
Bar=30 mm
Figure 1 Protoplas t fusion and culture of hybr id calli be-
tw een As tragalus meli lotoides and Zygophyllum xanthoxyl um
(A) Protoplast f us ion induced by PEG; (B) Protoplast f us ion
betw een Astragalus melilotoides (red colour ) and Zygophyllum
xantho xyl um (green colour ) obse rved by f luo rescent
microscopy; (C) Tw o hybrid cell clones; (D) Calli f rom hybr id
cell clone 2#; (E) Calli from hybrid cell clone 1#, w ith the arrow
show ing dif ferentiated buds
Bar=30 mm
446 植物学报 44(4) 2009
融合体中双亲遗传物质的组合是不对称的, 有部分染
色体被排斥。研究表明在不对称体细胞杂交中 , 经各
种射线辐照的原生质体的染色体易被排斥(Forsberg
et al., 1998), 且随着 g和 x射线照射剂量的增大 , 完
整的染色体减少(Zhou et al., 2001), 但是也有相反的
结果(Trick et al., 1994)。
近年来 UV 被作为辐射源应用于体细胞杂交中 ,
研究发现 UV 照射最初引起了染色体的片段化而不
是染色体整体的丢失。Xiang和Xia(2003)首次通过基
因组原位杂交(genomic in s itu hybridization, GISH)
技术直接观察到在小麦 (Trit icum aestivum)与燕麦
(Avena sativa)的杂交中, UV照射剂量的增高确实引
起了供体染色体消减程度的提高, 并且还造成了多位
点的燕麦染色体小片段插入及易位 , 表现出明显的
UV 辐射剂量效应。在科间远缘体细胞杂交中, 曾有
不少例子, 发生双亲染色体的相互排斥, 甚至产生了
染色体数目比受体本身还要少的杂种细胞系或者植
株(Forsberg et al., 1998; Zhou et al. , 2001)。可见杂
种中染色体的数目主要是由供体受辐射的程度和双
亲亲缘关系远近共同决定的。
2.6 杂种愈伤组织的分子鉴定
2.6.1 杂种愈伤组织的 RAPD分析
以双亲总 DNA 为模板, 用 20对随机引物进行筛选。
取其中 S65(GATGACCGCC)、S66(GAACGGACTC)、
S68(TGGACCGGTG)、S71(AAAGCTGCGG)、S73
(AAGCCGCGTC)和S74(GACGGATCAG) 6个带型稳
定、重复性好的引物 , 用于体细胞杂种及其双亲愈伤
组织的 RAPD分析。结果如图 3所示, 杂种及其双亲
在所用的 6个随机引物扩增时产生 30多条扩增带。
不同引物产生的扩增条带数目在 1-9条之间, 大小
分布在 200-2 000 bp之间, 随机引物对亲本和杂种
愈伤组织的扩增产物在条带数目及条带分布上均有
明显差异。杂种与亲本扩增带型的差异主要表现为,
杂种除含有双亲的不同特征带型外 , 还包含新的带
图 2 杂种及其双亲染色体 (箭头所指为双亲染色体片段 )
(A) 32条草木樨状黄芪染色体 ; (B) 45条杂种 1#染色体 ;
(C) 48条杂种 2#染色体 ; (D) 22条霸王染色体
Bar=1 mm
Figur e 2 Chromosome of somatic hybrid calli and their par-
ents (The arrow s indicate the chromosome segments of both
parents)
(A) As tragal us mel ilotoi des (32 chromosomes); (B) Hybr id 1#
(45 chromosomes ) ; (C) Hybr id 2#(48 chromosomes ); (D)
Zygophyl lum xanthoxylum (22 chromosomes)
Bar=1 mm
图 3 杂种细胞及其双亲愈伤组织的 RA PD分析
M: lDNA/Hi ndIII+EcoRI DNA 分子量标准; 1: 亲本草木樨状黄
芪 ; 2: 杂种克隆 1#; 3: 杂种克隆 2#; 4: 亲本霸王
新带型 ; 与一个亲本相同的带型
Figur e 3 RAPD patterns of hybrid calli and their parents
M: lDNA /HindIII+EcoRI DNA marker; 1: Astragalus melilotoides;
2: Hybr id c lone 1#; 3: Hybr id clone 2#; 4: Zygophyl l um
xanthoxyl um
New s trip type; The same s trip w ith one parent
447张改娜等: 草木樨状黄芪和木本霸王的科间体细胞杂交
型, 如用引物 S65和 S74扩增时, 杂种 1#和杂种 2#
产生了相同的新带型; 或者表现为缺失某些双亲特征
带型, 如用 S74扩增时, 2个杂种均缺失了大部分的
双亲特征带型 , 同时产生了新的带型。
从图 3的 S65、S66、S71和 S73四条随机引物
扩增结果可以看出 , 杂种 1#具有较多的亲本草木樨
状黄芪的 RAPD特征带, 而杂种 2#在S65、S66、S68
和 S73四条随机引物扩增带中则具有更多的亲本霸
王特征带型。2个杂种的另 2条随机引物扩增带或者
含较多另一亲本的特征带 , 或者含有较多的新带型。
这表明高剂量 UV 照射可导致双亲染色体的片段化 ,
致使染色体重组或丢失。
根据对2个杂种克隆进行的染色体计数和RAPD
分析表明, 杂种细胞系中 , 部分双亲染色体有被排斥
而丢失的现象。其中杂种 1#含较多受体亲本草木樨
状黄芪的染色体 , 而杂种 2#含供体亲本霸王的染色
体较多。由于霸王原生质体来源于继代培养次数较
多的愈伤组织 , 已经没有分化能力 , 因此含有较多霸
王染色体的杂种 2#愈伤组织也未能分化。而草木樨
状黄芪是一种较易分化的豆科牧草, 其原生质体细胞
来源的愈伤组织也很容易分化, 但由于部分染色体受
到排斥, 杂种1#愈伤组织的分化能力也很有限 , 仅分
化出 2个小芽。在其它研究结果中也曾出现相同情
况(Yue et al. , 2001)。
2.6.2 杂种愈伤组织的线粒体 CAPS (PCR-RFLP)
分析
为了证实杂种细胞的胞质特性, 本研究进行了线粒体
的 CAPS分析。CAPS分析结果显示 , 线粒体 DNA引
物及酶切组合(nad4exon1-nad4exon2/Taq I, 18S
rRNA-5S rRNA/Taq I)能够区分体细胞杂种的双亲
——霸王和草木樨状黄芪。杂种 1#和 2#的线粒体在
nad4exon1-nad4exon2/Taq I组合中除双亲特征带型
外, 都产生了新带型(图 4A)。在 18S rRNA-5S rRNA/
Taq I组合中, 体细胞杂种 1#产生了一条新带型, 而
体细胞杂种 2#未出现新带型, 但含有双亲特征带型
(图 4B)。说明杂种1#和2#的胞质是双亲胞质的杂合 ,
由于杂种线粒体在nad4exon1-nad4exon2/Taq I组合
中存在异于双亲的新带型 , 可认为双亲线粒体的
nad4exon1-nad4exon2间在杂种细胞中发生了重组。
Kobayashi 等(1991)和 Moreira等(2000)在以脐橙
(Citrus sinensis)叶肉原生质体和茂谷柑愈伤组织原
生质体为亲本进行的融合研究中曾发现杂种胞质中
仅含有愈伤组织亲本的线粒体, 而本研究发现杂种胞
质中同时存在双亲线粒体 , 并且发生了重组。因此体
细胞杂种中双亲线粒体是否排斥可能与植物种类或
品种有关。
2.7 杂种愈伤组织的抗逆性分析
2.7.1 杂种愈伤组织对盐胁迫的耐受性
NaCl 胁迫下培养 25天后 2个杂种系愈伤组织和双
亲愈伤组织的相对生长量均有显著差异(图5A), 其中
亲本霸王和 2个杂种愈伤组织系的相对生长量呈极
图 4 杂种及其亲本愈伤组织的线粒体 CAPS(PCR-RFLP)多
态性分析(图中箭头指示新带型 )
(A) nad4exon1-nad4exon2/Taq I单酶切 ; (B) 18S rRNA -5S
rRNA /Taq I单酶切
M: 200 bp DNA分子量标准 ; 1: 草木樨状黄芪; 2: 杂种 1#; 3:
杂种 2#; 4: 霸王
Figure 4 Polymorphism analys is of plastochondr ia CAPS
(PCR-RFLP) of hybrids and parents calli (The ar row s indicate
the new str ip type)
(A) nad4exon1-nad4exon2/Taq I s ingle enzyme digestion;
(B) 18S rRNA-5S rRNA /Taq I single enzyme digestion
M: 200 bp DNA marker; 1: As tragalus meli lotoi des; 2: Hybr id
clone 1#; 3: Hybrid clone 2#; 4: Zygophyl lum xanthoxyl um
448 植物学报 44(4) 2009
显著差异, 亲本草木樨状黄芪和2个杂种愈伤组织系
的相对生长量呈显著差异。
单因素方差分析表明 , 霸王在较低浓度(0.5%和
1.0%)NaCl的胁迫下, 相对生长量的差异呈显著水平,
而在高浓度(1.0% 和 1.5%)NaCl 胁迫下呈极显著差
异。亲本草木樨状黄芪和 2个杂种系的相对生长量
则在低浓度NaCl条件下呈极显著变化; 高浓度时, 相
对生长量仅呈显著变化。从图5A中可以看到相同的
结果, 同时 2个杂种的相对生长量处于双亲之间。这
说明霸王对 NaCl的耐受能力高于草木樨状黄芪 , 而
杂种则处于 2个亲本之间。
2.7.2 杂种愈伤组织对水分胁迫的耐受性
甘露醇胁迫下 2个杂种愈伤组织和双亲愈伤组织培
养 25天后的相对生长量如图 5B所示, 亲本霸王愈伤
组织与 2个杂种系愈伤组织的相对生长量均随着培
养基中甘露醇浓度的增加而下降, 但下降的程度有差
异。在10%甘露醇胁迫下 , 2个杂种系愈伤组织的相
对生长量介于 2个亲本之间, 杂种 1#的相对生长量
略高于杂种 2#。说明杂种对甘露醇胁迫的耐受能力
比亲本霸王差 , 但强于另一亲本草木樨状黄芪。
图 5C 显示杂种及其双亲对不同浓度聚乙二醇
(PEG)胁迫的耐受性 , 其相对生长量的变化与甘露醇
胁迫下的相对生长量变化相似。进一步的单因素方
差分析表明, 亲本霸王在非胁迫条件下的相对生长量
显著高于 PEG胁迫条件下的相对生长量。10%PEG
胁迫下的霸王相对生长量显著高于 15%和 20%2个
浓度 PEG胁迫下的相对生长量 , 但是 15%和 20%浓
度 PEG胁迫下的相对生长量则差异不显著。亲本草
木樨状黄芪在非胁迫条件下的相对生长量也显著高
于胁迫条件下的相对生长量, 但在 3个浓度 PEG胁
迫下的相对生长量差异不显著。说明亲本霸王对
PEG胁迫的耐受性比草木樨状黄芪强。杂种 1#在非
胁迫条件及不同浓度PEG胁迫下的相对生长量均呈
显著差异, 较接近亲本霸王的变化趋势。而杂种 2#
的相对生长量变化趋势则与亲本草木樨状黄芪相同。
上述杂种愈伤组织的抗逆性分析结果表明 , 2个杂种
图 5 双亲及杂种愈伤组织的抗盐性(A)、甘露醇抗性(B)及
聚乙二醇(PEG)抗性(C)分析
ZX: 木本霸王 ; AM: 草木樨状黄芪
Figur e 5 A nalysis of the resistance to salinity (A), mannitol
(B) and polyethylene glycol (PEG) (C) of parents and somatic
hybrids
ZX: Zygophyl lum xanthoxylum; AM: As tragal us meli lotoides
449张改娜等: 草木樨状黄芪和木本霸王的科间体细胞杂交
愈伤组织对盐胁迫和水分胁迫的抗性均高于亲本草
木樨状黄芪 , 其中杂种 1# 的抗旱能力又高于杂
种 2#。
2.7.3 PEG胁迫下杂种及其亲本愈伤组织的脯氨
酸含量
采用 Perk in Elmer Lambda 25型分光光度计测定不
同浓度脯氨酸标准样品的OD值, 获得脯氨酸含量测
定的标准曲线及线性回归方程 y = 0.135x。
经测定培养在 10%PEG胁迫条件下的杂种及其
亲本愈伤组织的 OD515 分别为: OD霸王 = 0.276 1、
OD杂种 1# = 0.174 6、OD杂种 2# = 0.193 0、OD草木樨状黄芪
=0.146 6。即愈伤组织游离脯氨酸含量, 霸王为2.045
µg.g-1, 草木樨状黄芪为 1.086 µg.g-1, 杂种 1#为
1.293 µg.g-1, 杂种 2#为 1.430 µg.g-1。在干旱条件
下生长的植物体内游离脯氨酸的积累量与植物对这
种逆境的抗性有关 , 游离脯氨酸的积累量越多 , 表明
该植物对逆境的抵抗能力越强 (龚富生和张嘉宝 ,
1995)。本研究中 2个杂种愈伤组织中的游离脯氨酸
积累量低于亲本霸王 , 而高于亲本草木樨状黄芪 , 介
于2个亲本之间, 说明杂种对干旱胁迫的抵抗力高于
草木樨状黄芪, 这与前述杂种愈伤组织对盐胁迫和水
分胁迫的抗性分析结果是一致的。
植物的抗逆性状往往由多基因或者某些未知的
抗性基因所控制, 而目前的转基因技术只能将一个或
少数几个基因转移到植物中, 因此针对这类由多基因
控制的性状通过转基因技术实现品种改良尚存在困
难。体细胞杂交可以克服种性界限 , 将一个亲本的全
部或部分染色体转移给另一亲本, 同时实现双亲胞质
融合, 即杂种细胞还可以获得双亲核基因组以外的遗
传物质, 故体细胞杂交技术是转移或组合多基因的生
物技术, 可用来转移抗旱、抗盐等性状来改良物种的
抗逆境能力(Yue et al. , 2001)。本研究中采用的亲本
霸王具有很强的抗旱能力, 是有待开发的抗旱基因资
源, 而这种抗旱能力与其特有的形态结构和抗旱基因
是分不开的。本研究所提供的实验体系不仅为通过
体细胞杂交手段对牧草进行抗逆改良提供了可行途
径, 也对通过体细胞杂交改良其它植物的抗旱能力具
有一定的参考价值。
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Interfamilial Somatic Hybridization Between Astragalus melilotoides
and Zygophyllum xanthoxylum
Gaina Zhang1, 2, Jingfen Jia2*
1Co lle ge of Agri cul ture, Hen an University of Scien ce and Techno log y, Luo yan g 47 100 3, Chi na
2Sh aan xi P rovincial Key La borato ry o f B iotech nolo gy, Schoo l of Li fe Sci ence s, Northw est Uni versit y, X i’a n 7 100 69, Chi na
Abstract On the basis of protoplast culture, w e per formed protoplas t fusion betw een Astragalus meli lotoides Pall. and
Zygophyl lum xanthoxylum Maxim us ing a modif ied PEG high-pH, high-Ca2+ method. The protoplas ts of A. meli lotoides w ere
pretreated w ith Rhodamine-6G and those of Z . xanthoxylum w ith UV radiation. Both parent protoplasts w ere unable to undergo
sus tained divis ion, but the interfamilial somatic hybrid cells could be selected because fusion cells renew ed their sus tained divis ion
capability ow ing to physiological complementation betw een the tw o parents . We obtained tw o hybrid cell lines through this selec ted
procedure. Few buds w ere induced from only one hybrid cell line. Chromosome checking and molecular biological charac terization
confirmed the hybrid characters of the tw o hybr id cell lines . Physiological analyses revealed the salt and drought tolerance of the
hybrid cell lines.
Ke y words Astrag alu s meli loto ide s, pro topl ast fu sion , soma tic hyb rid , Zygo phyl lum xa ntho xyl um
Zhang GN, Jia J F (200 9). Inte rfa mil ia l soma tic hybridi zat ion be tween Astraga lu s meli lo toi de s a nd Zygop hyl lum xanthoxylu m. Chi n
Bul l Bo t 44 , 44 2-45 0.
* Author for correspondence. E-mail: jiajf38@nw u.edu.cn
(责任编辑: 刘慧君)
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