全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (4): 465-468, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2008-04-22; 接受日期: 2008-06-05
* 通讯作者。E-mail: sqsong@ibcas.ac .cn
.组织培养简讯.
甜高粱再生体系的建立
赵利铭 1, 2 , 刘树君 2 , 宋松泉1, 2*
1中国科学技术大学生命科学学院, 合肥 230026; 2中国科学院植物研究所, 北京 100093
摘要 利用甜高粱成熟种子和成熟胚作为外植体, 通过愈伤组织再生途径建立了植株再生体系。结果表明, 成熟种子在添加
1.38 g.L-1脯氨酸、500 mg.L-1水解酪蛋白和3.0 mg.L-1 2 , 4-D的MS培养基上可以较快地诱导出生长状态良好的愈伤组织;
成熟胚在添加1.38 g.L-1脯氨酸、500 mg.L -1水解酪蛋白、2.5 mg.L-1 2 , 4-D和0.1 mg.L-1KT的MS培养基上也能诱导出生
长良好的愈伤组织。将愈伤组织转移到MS+1 m g.L-1 IAA + 0.5 m g.L-1 6-BA培养基上诱导芽, 然后再转移到MS+3 m g.L- 1
IBA培养基上生根后, 可发育成为完整的植株。
关键词 愈伤组织, 成熟胚, 再生体系, 种子, 甜高粱
赵利铭 , 刘树君 , 宋松泉 (2008). 甜高粱再生体系的建立. 植物学通报 25, 465-468.
甜高粱是普通粒用高粱(Sorghum bicolor)的一个变
种, 具有适应性较强和种植地域广泛的特性。在一些气
候和生产条件较差的地区, 如干旱半干旱地区、盐碱地
区、土壤瘠薄的山区和半山区种植的甜高粱均表现出
良好的经济和能源性状。甜高粱茎秆的汁液可生产燃
料乙醇, 榨汁后的秆渣可发酵或者直接作为饲料, 用于发
展畜牧业。甜高粱是目前公认的具有产业化应用前景
的能源作物。但到目前为止, 还缺乏高产、优质和高
抗逆性的新品种, 特别是适合不同区域和生境的高产优
质新品种。
利用基因工程技术, 对现有的甜高粱品种 (系) 进行
分子设计和定向改良, 有望在短期内获得高生物量和高
抗逆性的新品种(系)。因此, 建立高效的甜高粱再生体
系和遗传转化体系就成为目前亟待解决的关键技术。
前人利用高粱的幼胚(马鸿图和 Liang, 1985)、茎尖(张
明州等, 2006)和幼穗 (韩福光和赫庞, 1993; 白志良等,
1995; 石太渊等, 1995)作为外植体获得了再生植株, 但
再生率较低。Rao等(1995)发现在培养基中添加脯氨
酸、天门冬酰胺以及头孢氨噻肟可以提高愈伤组织的
再生率。Kishore等(2006)通过丛生芽途径得到了高粱
再生植株。目前用种子或者成熟胚为外植体得到再生
植株的报道较少(MaeKinnon et al. , 1986; Rao et al. ,
1995 )。本研究以甜高粱成熟种子及其成熟胚为材料,
通过愈伤组织途径获得了甜高粱的再生植株, 从而为深
入研究甜高粱奠定了技术基础。
1 材料和方法
1.1 材料
供试材料为甜高粱(Sorghum b icolor Moench)考利和
M81-E的种子, 由中国科学院植物研究所北京植物园谷
卫彬老师惠赠。
1.2 方法
1.2.1 愈伤组织的诱导
成熟种子作为外植体: 将甜高粱种子用75%的乙醇灭菌
1分钟, 然后用0.1%的升汞灭菌12-15分钟, 最后用无
菌水洗涤 4-5次。将灭菌后的种子接种于愈伤组织诱
导培养基上, 培养基成分为MS + 1.38 g.L-1脯氨酸 +
500 mg.L-1水解酪蛋白+ 2.0-3.0 mg.L-1 2, 4-D + 0-
0.3 mg.L-1 KT。培养时注意胚的部位要接触培养基。
成熟胚作为外植体: 成熟种子消毒后在无菌水中吸
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涨 12小时, 然后在超净工作台上剥取胚, 接种于愈伤组
织诱导培养基上。
上述 2种外植体均在(25±2)°C 黑暗条件下培养。
1.2.2 植株再生
将生长良好的愈伤组织接种于生芽培养基 (MS + 1 mg.
L-1 IAA + 0.5 mg.L-1 6-BA) 上, 培养 30天后将芽转入
生根培养基 (MS + 3 mg.L-1 IBA) 上。培养条件为(25±2)
°C, 每天 16小时光照, 光照强度为 35 mmol.m-2.s-1。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织的诱导
甜高粱种子在含浓度为2.0-3.0 mg.L-1 2, 4-D的MS培
养基上均可诱导出愈伤组织, 其中在添加 3.0 mg.L-1
2, 4-D的培养基上诱导出的愈伤组织较好且用时较短。
考利和M81-E 的种子均可在 4周内长出致密的愈伤组
织, 且其愈伤组织的诱导率分别为 76% 和 88%。诱导
形成的愈伤组织转移到添加 2.5 mg.L-1 2, 4-D和 0.1
mg.L-1 KT的MS 培养基上继代培养。诱导和分化过
程如图 1 所示。甜高粱种子接种到愈伤组织诱导培养
基上萌发, 然后在芽的基部膨大, 诱导出愈伤组织。图
1B 是生长 30天后的愈伤组织。成熟胚形成愈伤组织
的方式 (图 1 E-H) 与种子类似, 只是成熟胚在添加
2.5 mg.L-1 2, 4-D和 0.1 mg.L-1KT的培养基上生长
较好。考利和M 81-E 成熟胚的愈伤组织诱导率分别
为 94% 和 95%。如果在继代培养的过程中愈伤组织
出现水渍状, 可以采取提高继代培养基的琼脂浓度来改
图 1 甜高粱再生植株的形成过程
(A)-(D)成熟种子诱导再生植株的形成过程 (A)种子在诱导愈伤组织的培养基上萌发; (B)由种子诱导形成的胚性愈伤组织; (C)诱导形
成的不定芽; (D)转到生根培养基上生根 (E)-(H)成熟胚诱导再生植株的形成过程 (E), (F)由成熟胚诱导生成的愈伤组织; (G)转移到
生芽培养基上首先形成的芽点; (H)转移到生根培养基上生根
Figur e 1 Plant regeneration of sw eet sorghum
(A)-(D) Plant regeneration induced by mature seeds. (A) Germination of seeds on callus induc tion medium; (B) Embryonic callus
produced by seeds ; (C) A dventitious bud produced on medium of shoot grow th; (D) Roots produced on rootage medium (E)-(H)
Plant regeneration induced by embryos of mature seeds. (E) , (F) Callus induced by embryos of mature seeds; (G) Adventit ious bud
produced on medium of shoot grow th; (H) Roots produced on rootage medium
467赵利铭等: 甜高粱再生体系的建立
善此现象。
2.2 植株再生
选择黄色、生长良好且质地紧密的愈伤组织转接到MS
+ 1 mg.L-1 IAA + 0.5 mg.L-1 6-BA的生芽培养基上, 2
周后在愈伤组织表面形成绿色的芽点 (图1G), 4周后长
出不定芽。待不定芽长至 3-5 c m 时移入生根培养基
上, 2周后可观察到根长出 (图 1D, H)。
3 讨论
本实验采用甜高粱的成熟种子和成熟胚作为外植体诱导
愈伤组织, 愈伤组织形成的部位主要在芽的基部。在愈
伤组织的诱导过程中, 种子先萌发产生幼苗, 然后在芽的
基部形成愈伤组织并一直膨大生长。此外, 接触培养基
的幼叶也可以形成愈伤组织, 这可能是因为这些部位具
有较强的细胞分生能力, 所以比较容易得到愈伤组织。
在诱导愈伤组织的培养基中添加 1.38 g.L-1脯氨酸
和500 mg.L-1水解酪蛋白, 得到的愈伤组织能在生芽培
养基上诱导成苗, 再生效率较高。本实验结果与刘明等
(2004) 在高粱愈伤组织诱导中的结果相似。值得注意
的是部分愈伤组织转移到生芽培养基上会先长出根, 生
根后就很难再生芽, 这主要是因为形成的愈伤组织是由
根原基形成的。将根原基部分清除, 或者挑选淡黄色的
颗粒状愈伤组织诱导成苗, 可避免此现象发生。另外,
愈伤组织在继代培养的过程中, 往往会出现水渍状, 这种
愈伤组织没有再生能力。避免此现象发生的方法是提
高培养基的琼脂或蔗糖浓度, 将琼脂浓度提高到 1% 较
为理想。
本实验获得的高效甜高粱再生体系有利于后续的遗
传转化研究。目前, 高粱的再生体系大部分是以幼穗或
者未成熟胚作为外植体诱导得到愈伤组织, 而幼穗和幼
胚的取材往往受生长季节的限制。本实验利用成熟种
子和成熟胚通过形成愈伤组织的方式得到再生植株, 可
以不受生长季节的限制, 这将为今后甜高粱的基因改良
研究提供方便的植株再生技术。
参考文献
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Efficient Induction of Callus and Plant Regeneration from Seeds and
Mature Embryos of Sweet Sorghum
Liming Zhao1, 2, Shujun Liu2, Songquan Song1, 2*
1Schoo l of Li fe Sci ences, Uni versit y o f Scien ce and Techno log y o f China , Hefe i 2 300 26, Chi na
2In sti tute of Bo tan y, Chi nese Acade my of Sci ence s, Bei jin g 1 0009 3, Chi na
Abstr act Sw eet sorghum, w hich can grow and develop normally in non-cultivated soil due to higher tolerance to drought, salinity
and nutritional deficiency, is one of the most important energy c rops . Mature seeds and embryos of tw o sw eet sorghum cultivars
(Sorghum bi color cv . Cow ley , M81-E) w ere used as explants, and regeneration sys tems of sw eet sorghum plants w ere success-
fully established via callus pathw ay. The results show ed that Murashige and Skoog (MS) medium containing 1.38 g.L-1 proline, 500
mg.L-1 hydrolyzed casein and 3.0 mg.L-1 2,4-D w as a better medium for induction and grow th of callus f rom mature seeds, and that
containing 1.38 g.L-1 proline, 500 mg.L-1 hydrolyzed casein, 2.5 mg.L-1 2,4-D and 0.1 mg.L-1 KT w as a better medium for mature
embryos. The shoots w ere induced on MS medium containing 1 mg.L-1 IA A + 0.5 mg.L-1 6-BA v ia callus. The roots w ere induced
and w hole plants w ere produced after shoots w ere transferred to MS medium containing 3 mg.L-1 IBA.
Ke y w ords call us, mature em bryo, rege nerati on system, se eds, sweet so rgh um
Zhao LM , Liu SJ, Song SQ (20 08 ). Ef fi ci en t i nd ucti on of cal lus a nd p lan t re ge nerat io n fro m se ed s a nd m ature e mb ryos of swe et
so rghu m. Ch in Bull Bo t 25 , 46 5-46 8.
* Author for correspondence. E-mail: sqsong@ibcas.ac.cn
(责任编辑: 白羽红)