全 文 ：植物学通报 2004, 21 (3): 306~311
Chinese Bulletin of Botany
①山东省优秀中青年科学家科研奖励基金。
②通讯作者。Author for correspondence.
收稿日期：2003-03-10 接受日期：2003-06-26 责任编辑：崔郁英
甘薯同一不亲和群内品种间体细胞杂种①
1王晶珊 1孙世孟② 1王维华 2毕英娜 1徐丽娟 1孟祥霞
1 (莱阳农学院 山东莱阳 265200) 2 (威海双丰电子传感有限公司 山东威海 264209)
摘要 利用PEG融合方法，融合甘薯(Ipomoea batatas ) B不亲和群内品种‘koganesengan’和‘bitambi’
的原生质体。将融合处理的原生质体进行培养，共获得45株再生植株。4株再生植株形态上表现出融合
双亲的中间特性，其中2株染色体数为融合两亲之和 （2n = 12x (2n + 2n) = 180），另外2株分别为
41～103和35～100，因细胞不同而不同。经RAPD分析，这4株再生植株分别具有双亲特异的DNA扩增
带或双亲都不具有的新扩增带。鉴定这4株再生植株为杂交不亲和的B群内品种间体细胞杂种。
关键词 甘薯，不亲和群，原生质体融合，体细胞杂种
Somatic Hybrids Between Cultivars of the Same Cross-
Incompatible Group in Sweet Potato
1WANG Jing-Shan 1 SUN Shi-Meng② 1WANG Wei-Hua 2BI Ying-Na
1XU Li-Juan 1MENG Xiang-Xia
1(Laiyang Agricultural College, Shandong, Laiyang 265200)
2(Weihai Shuangfeng Electronic Sensor Limited-Company, Shandong, Weihai 264209)
Abstract The protoplasts of Ipomoea batatas ‘koganesengan’ and Ipomoea batatas ‘bitambi’
were fused with PEG method. Forty-five plants were obtained from fusion-treated protoplasts. Four of
the regenerated plants are considered to be somatic hybrids. They show various intermediate
characters between the two parents. Among them, two have chromosome numbers that corre-
sponds to the sum of their parents (2n=12×（2n+2n）=180), the other two have chromo-
somes varying from 45 to 103 and from 35 to 100, respectively, in cells. The hybridity is confirmed
by RAPD markers.
Key words Ipomoea batatas, Incompatibility, Protoplast fusion, Somatic hybrid
甘薯存在着多个杂交不亲和群，由于同一不亲和群内的品种间不能进行正常杂交，成为
甘薯育种及亲本选配的一大障碍。近年研究表明，体细胞杂交法能够克服这种杂交不亲和性
（Bravo and Evans,1985）。如果甘薯体细胞杂交法应用一旦成功，将为甘薯育种开辟一条新
的途径。
甘薯与其近缘野生种间原生质体融合及体细胞杂种再生已陆续报道（Liu et al., 1993; Wang
3072004 王晶珊等：甘薯同一不亲和群内品种间体细胞杂种
et al., 1998；刘庆昌等, 1994; 1998；王晶珊等, 2003），但甘薯同一不亲和群内品种间体细胞
杂交法研究却很少。Murata等（1993）用电融合方法进行甘薯品种间原生质体融合，并获
得少量再生植株，但未对再生植株进行杂种性鉴定。本研究利用日本重要的加工用及食用品
种‘koganesengan’和与其杂交不亲和品种‘bitambi’为材料进行原生质体融合，获得大
量再生植株。利用形态特征、细胞学观察及 RAPD分析等对再生植株进行了杂种性鉴定。
1 材料和方法
1.1 植物材料
实验材料为甘薯(Ipomoea batatas) B不亲和群品种‘koganesengan’和同一群品种
‘bitambi’。前者利用无菌植株叶柄，后者利用离体茎尖培养诱导的胚性愈伤组织分离原
生质体。
1.2 原生质体分离和融合
叶柄和胚性愈伤组织原生质体分离分别参照 Liu等（1991）和Murata等（1994）的方
法进行。
将分离得到的‘koganesengan’和‘bitambi’的原生质体用W5液（Negrutiu et al.,
1986）分别调整至约 106个 /mL，并以 1∶1的比例混合后，用 PEG融合液参照Liu等（1993）
的方法进行融合处理。
1.3 融合处理原生质体培养和植株再生
将融合处理原生质体悬浮于含有 0.05 mg·L-1 2,4-D和 0.5 mg·L-1 KT 的改良MS培养基
中，在黑暗和 27℃条件下进行培养。
在液体培养基中培养 8～9周后，将形成的小愈伤组织转移到添加 0.05～0.2 mg· L-1
2,4-D和 0～0.5 mg·L-1 KT，或添加 2.0 mg·L-1 NAA和 1.0 mg·L-1 BAP 的MS固体增殖
培养基(pH5.8)上培养，使其增殖。转移 3～5周后，将增殖得到的愈伤组织再转移到MS
基本培养基上，约 3周继代培养 1次，诱导愈伤组织再生植株。固体培养均在 27± 1℃、
13 h.d-1光照和 3 000 Lx条件下进行。
1.4 再生植株的杂种性鉴定
1.4.1 形态学观察 将再生植株及融合双亲经驯化后移栽于田间，对其植株形态、分枝数、叶
片形状及大小，茎及叶柄颜色、顶部叶片颜色、薯形和薯皮颜色等形态特征进行观察和比较。
1.4.2 细胞学观察 以杂种植株的培养幼根为材料,参照Yamaguchi和Shiga (1993)的方法处理
幼根进行染色体观察。
1.4.3 RAPD分析 用试管苗的叶片参照 Sakai等(1995)的方法提取DNA。用于 PCR反应液
（25 mL）含有 2.5 mL 10× buffer，2 mL dNTPs（每种 2.5 mmol.d-1），0.15 mL Taq 酶(50
unit.mL-1)，1 mL引物（10 pmol.mL-1）和 25 ng DNA。所用 PCR仪为 Program Temp Control
System PC-700。随机使用种引物（Kit A, B, C, D, E, F, Operon Technologies）。PCR扩增条件
为 94℃变性 1 min，35℃退火 2 min，72℃延伸 2 min，循环 45次。扩增DNA用 1.5%琼脂
糖电泳分离。
1.5 体细胞杂种的育性
杂种及融合双亲分别用牵牛花作砧木嫁接，栽培于温室诱导开花。用醋酸洋红进行花粉
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染色，镜检并统计花粉育性率。用‘九州 3 0 号’（C 不亲合群品种）的花粉进行授粉，
调查结实率。
2 结果和讨论
2.1 融合原生质体培养和植株再生
‘koganesengan’和‘bitambi’的原生质体以 PEG融合液融合后培养在液体培养基中。
培养 3 d后细胞开始分裂，之后继续分裂并形成细胞团。培养 8周后长成直径为 1～2 mm的
小愈伤组织。将这些小愈伤组织转移到固体增殖培养基上，之后迅速增殖，进一步转移到MS
基本培养基上进行培养，获得 45株再生植株。
2.2 再生植株的杂种性鉴定
2.2.1 形态特征及细胞学观察 45株再生植株中，4株（SH-1, SH-2, KS, BS）分别在各种形
态上表现出融合双亲的中间特征。SH-1和
S H - 2 叶片形状约为心脏形，相似于
‘b i t a m b i’，但叶缘上有欠刻，又表现
了‘k o g a n e s e n g a n’的特征（图 1），
并且顶部叶片为紫色（‘bitambi’颜色）
和绿色（‘koganesengan’颜色）相间，
表现出融合双亲的中间特征；KS薯皮为
黄褐色间有粉红色斑块，表现出
‘koganesengan’（黄褐色）和‘bitambi’
（粉红色）的中间特征；BS顶部叶片为
淡绿 -淡紫色，也表现出‘koganesengan’
（淡绿色）和‘bi tambi’（紫色）的中
间特征（表 1）。细胞学观察，SH-1 和
SH-2 染色体数为整倍数（2n = 12x (2n +
2n) = 180）；KS和BS染色体数分别为45～
103和 35～100，因细胞不同而不同（图
2，表 1）。为证实以上 4 株再生植株的
杂种性，对‘koganesengan’和‘bitambi’
原生质体再生植株进行了形态特征和细胞
学观察，它们分别表现各自亲本的形态特
征，未发现性状变异，染色体数均为 90
（2n = 6x = 90），说明以上 4株再生植株
的变化并非体细胞无性系变异。
2.2.2 RAPD分析 对以上4株再生植株
进行RAPD分析，SH-2在使用引物OPF-
05和OPA-09，SH-1在使用OPA-09时扩
增的多态性分子标记显示分别具有双亲特
图 2 体细胞杂种根尖一个细胞的染色体
（2 n = 1 8 0）
Fig.2 Chromosomes in a root-tip cell of somatic
hybrid (2n=180)
图 1 体细胞杂种( S H )、‘k o g a n e s e n g a n’ ( K )、
‘bitambi’(B)和‘bitambi’原生质体再生植株(B-P)
的叶片特征
Fig.1 Leaf shape of somatic hybrid (SH), ‘koganesengan
’(K), ‘bitambi’ (B) and regenerated plant from proto-
plast of ‘bitambi’(B-P)
3092004 王晶珊等：甘薯同一不亲和群内品种间体细胞杂种
异的DNA扩增带（图 3A, B）；KS在使用引物OPA-10、OPC-01和OPF-15，BS在使用OPC-
02时分别显示双亲都不具有的新扩增带（图 3C）。而‘bitambi’原生质体再生植株仅具有
与‘bi tambi’完全相同的扩增带，无任何不同扩增带出现（图 3B）。
从以上形态特征、染色体数以及 R A P D 分析等表明 S H - 1、S H - 2、K S 以及 B S 为
‘koganesengan’和‘bi tambi’的体细胞杂种。
本实验中体细胞杂种KS和BS染色体数并非融合两亲之和，并且因细胞不同而不同，认
为可能是培养过程中染色体丢失所致（刘庆昌等，1994），染色体丢失现象也在其他植物体
细胞杂种中观察到（Gleddie et al.，1986；Handley et al.，1986；Sihachakr et al.，1988；
Yamaguchi and Shiga，1993）。杂种 BS和KS分别显示双亲都不具有的新扩增带，这些扩增
带可能是双亲的互补扩增带，同样现象也在甘薯与 I. lacunosa的体细胞杂种中出现（刘庆昌
等，1 9 9 8）。
2.3 体细胞杂种的育性
杂种 SH-1、SH-2和 BS生长势较差，移栽大田 6周后，蔓长及分枝数均低于融合双亲。
可育花粉率很低，以‘九州 30 号’花粉授粉未得到种子（表 1）。KS 生长势较强，花粉
育性较高（94.4%），以‘九州 30 号’花粉授粉结实率为 88.9%（表 1）。栽种大田第一
年薯块及薯梗极为细长，第二年种植皆缩短（图 4）。
本研究成功地获得了甘薯同一不亲和群内品种间体细胞杂种，为克服甘薯杂交不亲和性和
开辟甘薯新的育种方法奠定基础。
表 1 体细胞杂种及其融合双亲(‘koganesengan’和‘bitambi’)的形态特征和染色体数
Table 1 Morphological characteristics and chromosome number of the somatic hybrids and their two
patents (‘koganesengan’ and ‘bitambi’)
‘Koganesengan’ 体细胞杂种 ‘B i t a m b i’
Somatic hybrids
SH-1 SH-2 KS BS
Chromosome number 90 180 180 45-103 35-100 90
Leaf shape Incised Intermediate Intermediate Incised Cordate Cordate
Leaf size (cm) 11.9× 11.5 7.0× 7.5 8.5× 8.2 10.0× 9.4 8.1× 7.9 11.7× 10.6
(Length×width)
Apical leaf Pale green Purple or Purple or Pale green Pale green to Purple
color alternate alternate pale purple
with green with green
Skin color Yellowish Pink Pink Yellowish- Pink Pink
of root tuber -brown brown with pink
Stem length (cm) 1) 75.0 45.0 71.3 103.8 75.0 166.3
Branch number 2） 5.8 2.0 3.2 6.3 2.5 10.0
Pollen fertility (%) 92.8 0 12.2 94.4 13.1 80.0
Pistil fertility (%) 88.9 0 0 88.9 0 88.2
1 ) 移栽大田 6 周后。2）移栽大田 6 周后，侧蔓长度大于 5 c m。
1) After 6 weeks of transplanting to field; 2) After 6 weeks of transplanting to field, branch was longer than 5 cm
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图 4 大田栽培第一年(1)和第二年(2)体细胞杂种(KS)、‘koganesengan’ (K)和‘bitambi’ (B)的薯块
特征
Fig.4 Root tuber characteristic of somatic hybrid (KS), ‘koganesengan’ (K) and‘bitambi’ (B) cultivated
in the first year (1) and in the second year (2)
图 3 使用引物OPF-05 (1)、OPA-09 (2)和OPC-01 (3)的RAPD图
原生质体再生植株；SH-1、SH-2和KS为体细胞杂种 箭头分别指示杂种显示的双亲特异扩增带和
新扩增带
Fig.3 RAPD profiles generated by primer OPF-05 (1), OPA-09 (2) and OPC-01 (3)
M. Marker(1kb ladder)；K.‘koganesengan’；B.‘bitambi’；B-P.‘bitambi’
M. Marker (1 kb ladder); K.‘koganesengan’; B.‘bitambi’；B-P. Regenerated plant from protoplast of
‘bitambi’; SH-1, SH-2 and KS. Somatic hybrids.
Arrows indicate parents’bands and the new band
3112004 王晶珊等：甘薯同一不亲和群内品种间体细胞杂种
参 考 文 献
王晶珊，刘庆昌，孟祥霞，王维华，徐丽娟，翟红，2003 .甘薯和近缘野生种 Ipomoea t r i l oba 的种间体细
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