全 文 ：植物学通报 2006, 23 (6): 634~641
Chinese Bulletin of Botany
收稿日期: 2006-01-16; 接受日期: 2006-05-30
基金项目: 国家自然科学基金(No. 30440041)和国家 863计划(No. 2002AA213021)
* Author for correspondence. E-mail: fangch2000@163.com
.研究论文.
麻疯树脂酶全长基因克隆、表达及其蛋白质结构预测
王小行1,彭峰2,牛冬云2,李钢2,陈放1*
1四川大学生命科学学院, 成都 610064; 2四川川大光耀生物工程有限公司, 成都 610065
摘要 脂酶(Lipase, EC3.1.1.3)是普遍应用于皮革、饲料及生物柴油工业的工业酶制剂, 具有广泛的应
用价值。目前对植物来源的脂酶研究较少。本研究用在生物柴油中具有应用前景的油料植物——麻疯树
(Jatropha curcas)作为研究对象, 克隆了该物种的脂酶基因(JcLIP)。通过多序列比对并结合物种的亲缘关
系设计了具有较高特异性的简并引物, 通过使用RT-PCR和RACE技术, 最终获得了麻疯树脂酶基因的全
长序列并成功地在大肠杆菌中表达, 酶活测定结果表明, 麻疯树脂酶在大肠杆菌中表达在包涵体中, 但
是能产生具有活力的蛋白质, 酶活约为0.8 U.mL-1。结构预测和比较表明, JcLIP蛋白质具有脂酶的结构
核心和催化活性中心, 而在非核心区具有较毛霉脂酶更多的插入和随机卷曲, 这可能是决定二者之间酶
活差异的重要原因。
关键词 脂酶, 麻疯树, 简并引物, 蛋白质结构
Cloning and Expression of Lipase Gene JcLIP in Jatropha curcas
and Its Protein Structure Prediction
Xiaoxing Wang1, Feng Peng2, Dongyun Niu2, Gang Li2, Fang Chen 1*
1College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China
2Sichuan Chuanda Guangyao Bioengineering, Ltd., Chengdu 610065, China
Abstract Lipase is one of the most widely used enzymes in industries such as leather, food and bio-diesel
production. It is valuable for its application to other fields. But research into lipase from plants is less reported
than that of other lipases. In this paper, we describe the cloning of a lipase gene from Jatropha curcas, which
has great potential in bio-diesel production. Degenerated primers were designed according to multiple align-
ments with homologous sequences relative to J. curcas. RT-PCR and random amplification of cDNA ends
(RACE) were performed to obtain full-length cDNA of JcLIP. The lipase was expressed in E. coli. The results
of enzyme assay showed that the protein was in inclusion body, with the activity of the supernate only 0.8 U.
mL-1. Structural prediction and comparison revealed JcLIP protein with the right structural core and catalytic
activity site of lipase. The random coils and insertions of the JcLIP protein sequence is partially different in
structure from that of lipase of Rhizomucor miehei, which may imply a different activity.
Key words Lipase, Jatropha curcas, degenerated primer, protein structure
脂酶(Lipase, EC3.1.1.3)是催化甘油三脂水 解反应的水解酶类, 在动物、植物、真菌以及
6352006 王小行 等: 麻疯树脂酶全长基因克隆、表达及其蛋白质结构预测
细菌中普遍存在, 不同生物的脂酶在蛋白质分子
量、底物或键特异性以及催化效率等方面均
有所不同, 但是它们与酯酶(esterase)具有很大差
异, 主要表现在脂酶的催化活性只有在油水界面
才能被激活(Jaeger and Eggert, 2002)。脂酶底
物具有多样性, 比如天然油脂分子、合成非天
然油脂、油脂的对映体等, 因此脂酶广泛应用
于油脂工业、饲料添加和酶制剂工业。目前
脂酶从能够利用油脂细菌和真菌中分离和纯化,
比如米黑根毛霉(Rhizomucor miehei) (Brady et
al., 1990)和假丝酵母(Candida sp.) (聂开立等,
2003), 而且这些脂酶都通过固定化酶技术应用
于制造生物柴油的生物催化研究中, 而植物源的
脂酶国内外研究比较少, 主要由于植物脂酶难以
分离纯化, 加之脂酶之间序列具有很大的差异,
因此加大了植物来源的脂酶研究难度。
麻疯树(Jatropha curcas)隶属于大戟科
(Euphorbiaceae), 麻疯树属(Jatropha), 主要分布
于热带和亚热带地区, 在我国广泛分布于云南、
四川、广西、广东、海南等地, 其种子含油
量达到30％以上, 麻疯树油脂肪酸组成和菜籽
油非常相似, 是生物柴油的理想原料(Ouedraogo
et al., 1991)。本文首次克隆了麻疯树的脂酶基
因并鉴定了该基因功能, 旨在将麻疯树脂酶应用
于麻疯树油脂的生物催化反应, 以增加生物催化
的特异性, 从而更有效地利用麻疯树油脂资源。
1 实验材料
1.1 植株
麻疯树(Jatropha curcas)种子由四川大学
生命科学学院植物资源研究实验室保存。
1.2 菌种
大肠杆菌DH5α和BL21(DE3), 由四川大学
生命科学学院植物资源研究实验室保存。
1.3 试剂盒
SMART™ RACE Kit和Advantage 2 PCR
Kit, 购自 Clontech公司。Trizol试剂购自
Invitrogen公司。反转录试剂盒 RT-PCR Kit、
PCR试剂盒ExTaq™ PCR Kit和TA克隆试剂盒
均购自宝(TaKaRa)生物工程有限公司。小量
胶回收试剂盒购自Qiagen生物工程有限公司。
2 研究方法
2.1 麻疯树的组培
将麻疯树种子在75％乙醇溶液中消毒1分
钟, 再用0.1% HgCl2溶液消毒10分钟, 无菌水
洗4次, 剥开种壳, 将胚在MS培养基中生长(陆
伟达等, 2003), 待到四叶期收获叶片。
2.2 麻疯树总RNA提取
按照Trizol试剂盒说明书提取麻疯树叶片
总RNA, 取0.1 g新鲜叶片于研钵中, 用液氮法
将其磨碎成粉末, 将粉末转移至Eppendorf 管中
并加入1 mL Trizol试剂, 待粉末充分分散后, 按
照试剂说明书步骤进行实验, 获得总 RNA。
2.3 简并PCR扩增麻疯树脂酶基因EST序
列
通过NCBI检索获得拟南芥的全长基因序
列, 将拟南芥脂酶基因的核酸序列提交至无冗余
数据库和 E S T 数据库进行相似性搜索
(tBLASTx), 获得与拟南芥脂酶相似的脂酶基因
和同源的未注释的EST序列, 分析所有序列读
框并将其翻译成氨基酸序列, 使用 Invitrogen
公司的Vector NTI 9.0进行多序列比对, 选择
3～4个脂酶基因的同源区段, 用于设计同源简
并引物。
将提取的麻疯树总RNA按照反转录试剂
盒说明书进行反转录, 获得麻疯树cDNA, 然后
使用Vector NTI 9.0计算简并引物退火温度的范
围, 以麻疯树cDNA作为模板, Lip5-1和Lip3-1
作为引物进行第一轮的梯度PCR, 再使用内侧
巢式引物Lip5-2和引物Lip3-1, 以第一轮PCR产
物为模板进行第二轮的梯度PCR, 最后电泳回
收预期大小的片断, 克隆并测序。
2.4 麻疯树脂酶基因的cDNA末端扩增
使用Premier公司的Primer Premier 5.0软件
设计 3’RACE、5’RACE 的 GSP引物, 按
636 23(6)
SMART™ RACE cDNA Amplification Kit操作
说明书对麻疯树脂酶基因cDNA 的5’、3’端未
知序列进行扩增。回收RACE样品中预期大小
的电泳片断, 克隆并测序。
使用Vector NTI 9.0软件对JcLIP基因EST,
cDNA 3’端序列和5’端序列的测序结果进行拼
接, 同时对拼接结果中不一致的位点加以更正。
然后用Primer Premier 5.0设计全长引物, LIP5, 5’
ATGCGCACGGAAGGCGTTT3’, LIP3, 5’
CTAAACACGGTTACCTCCAT3’, 验证RACE拼
接结果的正确性。
2.5 麻疯树脂酶基因在大肠杆菌中的表达
根据JcLIP基因cDNA序列设计全长ORF
引物, 如下: LIPORF-5, 5’GAATTCATGCGG
C A C G G A A G G C G T T T 3’; L I P O R F - 3 ,
5’GCGGCCGCCTAAACACGGTTACCTCCAT3’,
下划线分别为EcoRI 和NotI位点。将JcLIP基
因的扩增片断克隆入T载体中, 测序正确后, 克
隆载体通过 EcoRI 和 NotI 双酶切, 然后将基
因片断亚克隆到 pET28a载体中, 转化 BL21
(DE3)菌株, 随机选取20个阳性克隆, 使用
0.1 mol.L-1 IPTG在菌体浓度为OD600=0.6时诱
导过夜, 然后离心取菌体, 用PBS缓冲液重悬细
胞后, 通过超声波裂解, 取上清液进行蛋白质电
泳, 获得正确表达的菌种。
2.6 表达产物的活性测定
将实验获得的阳性克隆接种于50 mL LB液
体培养基中, OD600=0.6时使用 0.1m mol.L-1
IPTG诱导3小时, 菌悬液于10 000×g离心5分
钟, 收集菌体, 用PBS缓冲液重悬细胞后超声波
破碎, 10 000×g离心15分钟, 取上清液, 根据
Mark等(1992)的方法, 以三丁酸甘油酯为底物,
采用浊度比色法在Ultrospec 4300 pro上检测酶
活 。
2.7 生物信息学分析
将JcLIP基因最长编码框编码的氨基酸序
列向NCBI提交进行相似性搜索。麻疯树脂酶
蛋白质序列三级结构预测是由网站 SWISS-
MODEL (www.expasy.org/swissmod/ SWISS-
MODEL.html)提供的同源建模法进行预测。
3 实验结果
3.1 简并引物的设计
通过NCBI相似性搜索获得拟南芥和水稻
的脂酶全长基因, 然后用这2条序列对核酸数据
库和EST序列数据库进行相似性搜索, 根据得
分和序列长度筛选获得18条EST序列, 将获得
的EST序列根据BLAST结果翻译成蛋白质进
行比对(图1), 从比对中选择3个保守区域设计
简并引物(表 1)。
为了降低引物的简并度, 增加简并PCR的
特异性, 在依据序列同源性的同时, 参考了物种
的亲缘关系, 即在所选序列中根据物种分类地
位, 选择与麻疯树同属于 Eurosids I 总目中的
表 1 依据多序列比对获得的简并引物
Table 1 Degenerated primer designed from multiple alignments
Code Conserved region Location
Degenerated primer Modified degenerated primer
Sequence Degeneracy Sequence Degeneracy
Lip5-1 DL(Y/F/I/L) 150-155 GA(T/C)(T/C)T(G/A/ 192 GA(T/C)TT(A/G) 32
WKQ T/C)T(T/A)(C/T/A) T(T/A)(T/C)TGG
TGGAA(A/G)CA AA(A/G)CA
Lip5-2 (A/S)Y(H/N) 175-180 GC(T/A)TA(T/C)(C/ 384 GC(T/A)TA(T/C) 32
NT(T/I) T/A)A(T/C)AA(T/C)AC CA(T/C)AA(T/C)
(A/G)(T/A)(T/C) AC(A/G) AC
Lip3-1 MTFGQPR 233-239 C(T/G)(T/A)GG(T/C) 256 C(T/G)(T/A)GG(T/C) 8
TG(T/C)CC(A/G)AA TG(T/C)CCAA
(G/A/T/C)GTCAT A TCAT
6372006 王小行 等: 麻疯树脂酶全长基因克隆、表达及其蛋白质结构预测
Glycine max、Malus sieboldii和 Poulus
balsamifer 3个物种的核酸序列作为参考, 降低
部分位点的多态性, 以降低引物简并度, 针对简
并引物简并度较高的区域舍去那些没有在这类
物种中出现的碱基(表 1)。
3.2 麻疯树脂酶基因的克隆及其表达
3.2.1 简并RT-PCR获得疯树脂酶基因EST
序列 麻疯树总RNA提取结果如图 2A, 使用
所设计的简并引物对麻疯树反转录产物进行2
轮梯度PCR, 实验结果表明, 第1轮的梯度PCR
没有获得预期260 bp左右的片断, 但是通过第
2轮巢式PCR在不同温度梯度下均获得了预期
大小的扩增片段, 约 190 bp (图 2B)。
3.2.2 RACE获得麻疯树脂酶基因全长cDNA
序列 以获得的 190 bp EST序列设计RACE
GSP引物, 根据多序列比对推算3’RACE片断约
800 bp, 将800 bp附近的条带回收测序, 最终确
定箭头所示片段为 JcLIP基因 3’端序列, 梯度
图 1 不同物种来源的脂酶基因多序列比对(粗线标注位置为简并引物的位置)
AAN31885. 拟南芥; CAD32696. 小麦; XP479442. 水稻; CD824932. 油菜; CF805901. 大豆; CN915685. 三
叶海棠; CN550394. 杨树; CA121754. 甘蔗; CF436222. 洋葱; AJ559926. 金鱼草; BQ873713. 莴苣; BM065100.
辣椒; CK860723. 马铃薯; CO076981. 雷蒙德氏棉; CF515353. 葡萄
Fig. 1 Multiple alignments of lipases from different organisms (Sequences marked with thick lines were the
position of degenerated primers)
AAN31885. Arabidopsis thaliana; CAD32696. Triticum aestivum; XP479442. Oryza sativa; CD824932. Bras-
sica napus; CF805901. Glycine max; CN915685. Malus sieboldii; CN550394. Poulus balsamifer; CA121754.
Saccharum officinarum; CF436222. Allium cepa; AJ559926. Antirrhinum majus; BQ873713. Lactuca sativa;
BM065100. Capsicum annuum; CK860723. Solanum tuberosum; CO076981. Gossypium raimondii; CF515353.
Vitis vinfera.
638 23(6)
PCR结果表明目的条带扩增的特异性不显著,
但是在较高退火温度时, 条带的特异性相对加强
(图 3A)。5’RACE的扩增条带较 3’RACE特异
性强, 经测序确定该扩增条带为JcLIP基因5’端
序列(图 3B)。
将JcLIP基因 cDNA末端序列和EST序列
拼接成完整序列, 序列全长 1 582 bp。同时使
用全长ORF引物对反转录产物进行扩增, 获得
一条单一的扩增条带(图3C), 说明JcLIP基因全
长正确。将麻疯树脂酶最长读框翻译成蛋白
质, 全长356个氨基酸, 同其它植物的脂酶序列
进行蛋白质序列比对, 结果表明麻疯树脂酶与拟
南芥、大麦和水稻的脂酶同源, 相似性分别为
71.6％、69.1％和61.5％, 与同属于Eurosids I 总
目的G. max、M. sieboldii、P. balsamifer 3个
物种的脂酶部分片断相似性分别高达80.9％、
图 2 JcLIP基因简并RT-PCR结果
A. 麻疯树总RNA结果; B. 简并RT-PCR结果(箭头示扩增的 EST序列)。1~6. 分别为不同退火温度 62
℃、59℃、56℃、53℃、50℃和 47℃; 7. CK; M. Marker
Fig. 2 Degenerated RT-PCR of lipase gene of Jatropha curcas
A. Total RNA of J. curcas; B. Amplification result of RT-PCR (Target fragment was marked with arrow). 1-6.
Represented different annealing temperature of 62℃, 59℃, 56℃, 53℃, 50℃, 47℃ for each; 7. CK; M. Marker
图 3 JcLIP基因RACE实验结果
A. 3’RACE 结果(箭头示目标条带); 1~8. 分别为不同退火温度 62℃、60℃、58℃、56℃、54℃、52
℃、50℃和 48℃; 9. CK; M. Marker; B. 5’RACE 结果 1, 2. 5’RACE; M. Marker; C. 全长ORF验证 1. 全长
ORF验证; M. Marker
Fig. 3 Rapid amplification of JcLIP gene cDNA ends
A. 3’RACE result, target fragment was marked with arrow 1-8. Represented different annealing temperature of
62℃, 60℃, 58℃, 56℃, 54℃, 52℃, 50℃, 48℃ for each; 9. CK; M. Marker; B. 5’RACE 1, 2. Result of 5’RACE;
M. Marker; C. PCR of full length ORF 1. PCR of full length ORF; M. Marker
6392006 王小行 等: 麻疯树脂酶全长基因克隆、表达及其蛋白质结构预测
82.6％和85.6％, 说明脂酶基因在植物中具有很
高的保守性。基因聚类结果表明, 麻疯树脂酶
与杨树的脂酶具有较近的亲缘性, 而且和同一总
目下三叶海棠和大豆的遗传距离都较近, 而与水
稻和大麦具有较远的亲缘关系, 这个结果和简并
引物设计结果相吻合(图 4)。
3.2.3 麻疯树脂酶基因在大肠杆菌中表达
将JcLIP基因全长ORF构建到pET28a载体中,
并且成功表达了该基因(图5), IPTG对不同阳性
克隆诱导实验表明JcLIP在大肠杆菌中表达的
融合蛋白大小约53 kD, 表达量比较小, 而且在
不同的样品中JcLIP的表达量不一致, 选择较强
表达的菌株命名为BL-pET28a(+)- lipase。
3.2.4 麻疯树脂酶基因在大肠杆菌中表达
产物酶活的测定 将菌株BL-pET28a(+)- lipase
在0.1 mmol.L-1 IPTG浓度下, OD600=0.6时诱导
表达脂酶, 实验结果表明表达的脂酶蛋白一部分
形成包涵体, 一部分以可溶蛋白存在。取裂解
后上清液测定酶活 0.8 U.mL-1左右, 尽管酶活
偏低, 但可以说明脂肪酶基因得以成功克隆, 并
有所表达。
3.3 麻疯树脂酶蛋白质三级结构预测
使用SWISSMODEL同源模建麻疯树脂酶
的三级结构, 以米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)
脂酶实测结构(PDB No.4tgl)作为模板, 得到预测
三级结构。预测结果表明, 麻疯树脂酶蛋白质
预测结构属于脂酶蛋白质家族, 它具有a/b水解
酶的8个β折叠, 呈左手状态分布, 同时平行排
列的折叠与上下的8个α螺旋形成一个α/β/
α的三层结构, 是典型的水解酶超家族特征(图
6B)。但是在麻疯树预测结构中它缺少了毛霉
脂酶结构中N端的一个β折叠以及与之紧连的
α螺旋一部分(图6A, B), 而且通过结构比较发
现, 虽然麻疯树蛋白质序列与实测的毛霉脂酶序
列相似性很低, 但是其构成的核心结构是高度相
似的, 如图6C蓝色和粉红色重合部分, 只有在
一些非核心结构的随机卷曲区域存在插入序列,
如图6C深紫色部分所示, 这些说明麻疯树脂酶
具有脂酶的结构特征, 应属于脂酶类。
尽管如此, 通过比较我们发现决定脂酶在
催化时变构的所谓“盖子”(lid structure)结构
(Derewenda et al., 1992)在2个蛋白质之间存在
很大差异, 在麻疯树的结构中存在比毛霉脂酶结
构中更长的“盖子”结构, 如图 6C绿色和紫
图 4 部分植物脂酶基因的聚类图(括号中数字表示遗传距离)
Fig. 4 Phylogenetic tree of lipase of plants (The number in the bracket is the genetics distance of each orgnism)
图5 麻疯树脂酶基因在大肠杆菌中的表达 (箭头示
JcLIP基因表达条带)
1~3, 5, 6. 样品; 4. 对照; M. Marker
Fig. 5 Expression of JcLIP gene in E. coli (The target
fragment was marked with arrow)
1-3, 5, 6. Samples; 4. CK; M. Marker
640 23(6)
红色部分, 这可能会使二者在酶活上存在差异,
同时针对催化中心的活性位点进行了比较, 结果
发现二者的活性位点在空间结构上具有保守性
(图 6D), 分别是毛霉脂酶 Ser144、Asp203和
His257以及麻疯树脂酶 Ser177(133)、Asp236
(189)和His296(252)(括号外数字代表序列中的
位置, 括号内数字代表预测结构中的位置), 脂酶
的活性中心在蛋白质结构中就像一个突出的平
台, 这样可以更好地结合底物分子, 由于麻疯树
脂酶具有较多随机插入, 因此在活性中心周围存
在较毛霉脂酶更多的随机卷曲, 但从结构上看这
并没有影响活性中心的暴露。总之, 由于序列
的差异导致麻疯树脂酶和毛霉脂酶在一些结构
上的差异势必会导致两者在酶活上的差异。
图 6 麻疯树脂酶蛋白质结构预测
A. 实测结构PDB Num. 4gtl; B. 预测结构, A和B的结构使用Rasmol软件观测; C. 实测结构与预测结构的
比较, 粉红色为4gtl, 蓝色为预测结构, 深紫色为预测结构中与实测结构差异较大区域, 紫红色为实测脂酶
蛋白质的lid 区域, 绿色为预测结构中lid区域; D. 催化结构域比较, 左边为预测结构, 右边为实测结构4gtl。
ASP. 天门冬氨酸 (紫红色部分); HIS. 组氨酸 (亮蓝色部分); SER. 丝氨酸(黄色部分)。C和D的结构使用
Swiss-PdbViewer 3.7软件观测。
Fig. 6 Structure prediction of JcLIP protein
A. PDB 4gtl; B. Predicted structure, the structure was viewed by Rasmol software; C. Comparison between 4gtl
and predicted structure, 4gtl was marked as pink, predicted structure was marked as blue, different region between
two structures was marked as modena, lid region of 4gtl was marked as amaranth, lid of predicted structure was
marked as dark green; D. Comparison of active sites of two structures. Left was predicted structure and right was
known structure 4gtl. The modena region marked with ASP was aspartic acid. The light blue region marked with
HIS was histidine. The yellow region marked with SER was serine. The structure of C and D was viewed by
Swiss-PdbViewer 3.7.
6412006 王小行 等: 麻疯树脂酶全长基因克隆、表达及其蛋白质结构预测
4 讨论
本文在基因序列信息较少的情况下首次克
隆了麻疯树脂酶基因, 运用了EST序列数据库
的序列, 通过相似性搜索获得了较多同源序列,
虽然这些序列没有注释, 但是由于它们之间的相
似性较高, 对精确的确定保守区域的边界具有很
高的参考价值, 可以获得比较具有代表性的简并
引物, 同时在简并引物设计中, 增加了在近源物
种水平上的分析, 即对与麻疯树同属于Eurosids
I 总目的G. max、M. sieboldii和 P. balsamifer
3个物种的EST序列进行DNA序列比对, 比对
结果发现此三者DNA序列之间的相似性超过
60％(数据未显示), 聚类结果说明三者的亲缘性
较近, 因此我们认为脂酶至少在Eurosids I总目
的水平上相当保守, 通过近源物种的多序列比
对, 针对简并引物中简并度较高的地方进行了调
整, 从而增强简并引物在Eurosids I总目水平上
具有的特异性, 最终获得了比较好的效果。
脂酶具有在油水界面催化的特性, 这得益
于其蛋白质变构时扩大了疏水面积, 研究发现
(Derewenda et al., 1992)毛霉脂酶的“盖子”结
构位于82~96位, 这部分包括2个铰链区(83位
~84位和91位~95位)和一个短α螺旋(85位~91
位)(图5C), 其中铰链区的二级结构是一种介于
α和β构象之间的结构, 这种结构的构象转变可
使整个“盖子”结构产生 12Å的位移, 同时
可使分子暴露的疏水面积增加约800Å2 (约占整
个分子总面积的8％), 因此为油水界面反应提
供了良好的催化构象, 研究发现这种结构普遍存
在于脂酶结构中(Noinville et al., 2002), 而与毛
霉相比, 麻疯树脂酶也具有类似的结构(图5C),
但是其铰链区较毛霉的更长(分别为108位~115
位和121位~126位), 这种长铰链区必定会影响
麻疯树脂酶的功能, 这需要进一步实验来证明。
参考文献
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(责任编辑: 于昕, 白羽红)