全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (5): 574-578, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2008-04-15; 接受日期: 2008-09-12
基金项目: 林业公益性行业科研专项(No. 200704001)和国家林业局 948项目(No. 2004-4-60)
* 通讯作者。E-mail: lilubin@126.com
.实验简报.
毛竹基因组大小测定
李潞滨 1 , 武静宇1, 2 , 胡陶 1 , 杨学文3, 彭镇华 1 *
1中国林业科学研究院林业研究所, 国家林业局林木培育重点实验室, 北京 100091
2河北大学生命科学学院, 保定 071002; 3国际竹藤网络中心, 国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室, 北京 100102
摘要 毛竹(Phyllostachys edulis)属禾本科(Poaceae)竹亚科(Bambusoideae)刚竹属(Phyllostachys), 是我国分布和栽培
面积最大的经济竹种, 有着广泛的开发前景。本实验以水稻(Oryza sativa)为内标, 用流式细胞仪对水稻和竹子样品的PI发射
荧光强度进行测定, 通过比较水稻与毛竹样品峰值的倍数关系, 计算出毛竹的基因组大小。对24组样品进行重复测试, 测得
毛竹基因组大小为2 075.025±13.08 Mb, 即2 C DNA含量为4.24 pg(以1 pg DNA = 0.978×109 bp计算)。毛竹基因组大小测
定为毛竹基因组文库的建立及其基因组学研究奠定了重要基础。
关键词 流式细胞仪, 基因组大小, 水稻, 毛竹
李潞滨 , 武静宇 , 胡陶 , 杨学文 , 彭镇华 (2008). 毛竹基因组大小测定. 植物学通报 25, 574-578.
毛竹(Phyllostachys edulis) 隶属禾本科(Poaceae)
竹亚科(Bambusoideae)刚竹属(Phyllos tachys), 是我国
分布最广、面积最大和经济价值最高的竹种之一, 具有
生长快、周期短、产量高、用途广和效益大等诸多优
点, 有着广泛的开发前景(江泽慧, 2002 ; 李潞滨等,
2008)。以往对毛竹的研究主要集中于其生长特性、群
落结构和竹林经营技术等方面, 对于毛竹的细胞及分子
生物学研究较少(高志民等, 2006)。基因组大小(又称 C
值), 是指一个物种单倍体核的 DNA 含量。基因组反映
了生物物种全部和特定的遗传信息, 与核DNA含量相比
较, 基因组大小更适合作为生物研究的特征参数(杜波等,
2006)。越来越多的研究发现基因组大小和多项生物参
数如细胞周期和细胞大小存在关系, 并对植物的进化和
适应起着重要作用。
因此, 测定毛竹的基因组大小, 不仅对于该物种本身
的细胞遗传学等研究具有重要意义, 而且也为植物的基
因组学及其进化研究提供了不可或缺的基础资料。
20 世纪 70 年代开始出现利用流式细胞仪( f l ow
cytometry, FCM)测定植物细胞DNA 含量的报道。流
式细胞仪是一种能够准确、快速测定和分析流体中细
胞或颗粒物各种参数的大型实验仪器(Arumuganathan
and Earle, 1991; 耿慧霞等, 2005)。用流式细胞仪检
测细胞DNA含量, 通常采用特异的荧光染料对其进行染
色, 荧光分子结合DNA的量与细胞内DNA含量呈正比,
通过检测被激发的染色细胞发射的荧光强度可得到被测
细胞的DNA 含量(宋平根和李素文, 1992)。本实验以
水稻(Oryza sativa)为内标, 用流式细胞仪对 24组样品
进行重复实验, 测定了毛竹的基因组大小; 为毛竹及刚竹
属植物的基因组学研究、毛竹基因组文库的建立及基
因组全序列测定等工作的进一步开展提供了基础数据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
水稻(Oryza sativa L.)(品种为日本晴)取自中国科学院植
物研究所,选取2个月左右的幼嫩叶片。 毛竹(Phyllosta-
chys edulis (Carr.) Lehaie), 种子采自广西桂林, 实验
材料为苗龄 1个月左右的幼嫩叶片。
575李潞滨等: 毛竹基因组大小测定
1.2 方法
1.2.1 细胞核悬液制备
选取毛竹未展开的嫩叶2-3片, 在滴有750 mL choping
buffer (Galbraith et al., 1983)(含44.8 mmol.L-1 MgCl2,
46 mmol.L-1柠檬酸, 20 mmol.L-1(pH7.2)3-(N-吗啉代)
丙磺酸, 0.1%Triton X-100, 50 µg.mL-1 RNaseA)的培
养皿中, 用锋利刀片将其切碎, 用300目的尼龙网过滤,
滤液再以 600目尼龙网过滤获得细胞核悬液, 置于冰
上备用。采用同样方法获得水稻的细胞核悬液, 置于
冰上备用。
将 250 mL毛竹细胞核悬液和 250 mL水稻细胞核
悬液混匀, 获得混合细胞核悬液, 置于冰上备用。
1.2.2 DNA特异性染色
向制备的细胞核悬液中滴加碘化丙啶(propidium iodide,
PI)至终浓度为 50 µg.mL-1, 置于冰上, 避光染色 1-2
小 时 。
1.2.3 流式细胞仪检测
流式细胞仪系统为 FACSAria(美国BD公司)。采用 488
nm 和 5×108 J.s-1的蓝光激发, 检测 PI的发射荧光强
度。以水稻为内标, 共测试 24 组样品, 每组样品至少
收集 10 00 0 个细胞, 变异系数( c oe f f i c i en t o f
variat ion, CV)控制在 5% 以内。使用 BDFACSDiva
软件分析数据。
2 结果
PI是一种荧光染料, 能够均匀地嵌入双链核酸的碱基对
中, 可对 DNA 进行特异性染色。PI在 488 nm 激发光
下, 发出的荧光可被流式细胞仪检测到。由于 PI 在着
色过程中的嵌入量与DNA的量呈正比, 因而用荧光强度
可以表示 DNA 的相对含量。对比水稻和毛竹基因组单
独测定的结果可见, 水稻基因组的测定峰(图1)与毛竹基
因组测定峰(图2)无重叠, 保证了用已知大小的水稻基因
组作内标计算毛竹基因组大小结果的准确性。对水稻
和毛竹混合样品的PI 发射荧光强度的测定结果分析表
明(图 3), P1为水稻 2 C DNA含量峰, 峰值为 16 378,
P2为毛竹 2 C DNA 含量峰, 峰值为 79 892。
图 4和图 5为选定实验条件下样品制备质量及染色
效果的散点图, P1为毛竹样品, P2为水稻样品。从图
中可见, 粒子团明确、清晰且集中, 表明该实验条件下
混合样品可良好区分。
本研究利用流式细胞仪对毛竹细胞DNA 含量进行
测定, 共获得 24组数据(表1)。比较水稻样品与毛竹样
图 1 水稻样品流式细胞仪测试结果
Figur e 1 Tes t result of Oryza sati va sample using f low
cy tometry
图 2 毛竹样品流式细胞仪测试结果
Figure 2 Test result of Phyll os tachys edul is sample us ing
flow cytometry
576 植物学通报 25(5) 2008
图 3 水稻与毛竹混合样品流式细胞仪测试结果
P1: 水稻 2 C DNA含量峰, 峰值为 16 378; P2: 毛竹 2 C DNA含量
峰, 峰值为79 892
Figur e 3 Tes t result of Oryza sati va and Phyl los tachys
eduli s mixed samples using f low cytometry
P1: Peak of 2 C DNA of Oryza sativa, peak value is 16 378; P2:
Peak of 2 C DNA of Phyllostachys eduli s, peak value is 79 892
图 4 混合样品细胞核制备质量散点图
SSC: 侧向光散射; FSC: 前向散射光; P1: 与毛竹样品对应的粒子
团; P2: 与水稻样品对应的粒子团
Figur e 4 Scatter diagram of nuc leus preparation of mixed
samples
SSC: Side light scatter; FSC: Forw ard scatter ; P1: Particles of
phyllostachys edulis ; P2: Par tic les of Oryza sati va
图 5 混合样品PI染色效果散点图
PI: 碘化丙啶; FSC、P1和P2: 同图 4
Figur e 5 Scatter diagram of PI dyeing of mixed samples
PI: Propidium iodide; FSC, P1 and P2: See Figure 4
表 1 所有样品流式细胞仪测试结果
Table 1 Test results of all samples using f low cytometry
Sample Peak value Peak value of Ratio:
No. of Oryza Phyll ostachys B/A
sativa (A ) edulis (B)
1 15 995 74 514 4.658 581
2 15 898 74 265 4.671 342
3 15 925 74 294 4.665 243
4 14 203 66 219 4.662 325
5 14 185 66 000 4.652 802
6 13 917 65 499 4.706 402
7 16 378 79 892 4.878 007
8 16 171 79 197 4.897 471
9 16 215 79 326 4.892 137
10 15 814 77 961 4.929 872
11 14 920 74 792 5.012 869
12 14 911 74 206 4.976 594
13 15 748 76 892 4.882 652
14 15 646 76 628 4.897 61
15 14 834 73 106 4.928 273
16 14 467 71 348 4.931 776
17 14 334 70 563 4.922 771
18 13 945 70 130 5.029 043
19 11 233 57 468 5.115 998
20 11 208 54 506 4.863 133
21 10 334 48 173 4.661 602
22 10 170 47 996 4.719 371
23 9 878 45 653 4.621 685
24 9 881 45 826 4.637 79
Average 14 008.75 74 514 4.825 64±0.030 428
577李潞滨等: 毛竹基因组大小测定
品峰值的倍数关系, 可计算出毛竹的基因组大小。毛
竹基因组大小是水稻基因组大小平均值的 4.825 64±
0.030 428倍, 从而计算出毛竹基因组大小为2 075.025±
13.08 Mb, 即 2 C DNA含量为 4.24 pg(以1 pg DNA =
0.978×109 bp计算)。
3 讨论
Gielis等(1996, 1997)使用流式细胞仪和激光共聚焦显
微镜测定竹子基因组大小的研究结果表明, 热带竹种的
2 C DNA含量为 2.45-3.23 pg, 温带竹种 2 C DNA含
量为4.17-5.3 pg, 其中刚竹属的5个代表性竹种的2 C
DNA 平均含量约为 4.17 pg。桂毅杰等(2007)以玉米
(Zea mays)基因组为内标, 测得毛竹基因组的2 C DNA
含量为 4.22 pg, 基因组大小为 2 034 Mb。本研究以水
稻为内标, 测得毛竹 2 C DNA含量为 4.24 pg, 基因组大
小为2 075.025± 13.08 Mb(1 pg DNA = 0.978×109 bp
计算 )。
用流式细胞仪测定基因组大小, 当测定方法和试材
差异未被充分考虑时, 经常会出现同一物种测定的结果
不同, 甚至同一实验室使用同一台仪器对不同批次试材
的测定结果也会有所不同(Dolezel et al. , 1998)。我们
在前人工作的基础上, 更加注重材料的内标和选择及染
色时间和系统稳定性等影响流式细胞仪测定结果精确性
等因素的确定(Dolezel and Bartos, 2005)。取用相同
苗龄和相同部位的新鲜幼嫩叶片, 不经过冷冻和贮藏等
环节, 取材后立即制样, 保证了样品活性, 获得较完美的
峰形图。染色时间上, 我们测试了 0 .5、1、1 . 5、2
和2.5小时5个梯度, 结果表明染色2小时更容易使细胞
核充分染色。此外, 进行了多次重复实验, 共获得 24组
数据(表 1), 始终把变异系数控制在 3%-3.5% 之间, 最
大限度地避免了误差。
使用流式细胞仪测定基因组大小的过程中, 内标选
用也是影响结果准确性的另一个重要因素。在早期的
研究中, 内标通常选用鸡血红细胞(CBRC, 2.33 pg DNA/
2 C)作为参照标准。但由于鸡血红细胞的 2 C DNA 含
量本身有一定变化幅度(2.33-2.5 pg)等原因, 本研究未
采用鸡血红细胞作内标。我们曾尝试使用模式植物拟
南芥(Arab idops is thaliana)作为内标, 但由于其基因组
远远小于毛竹而易产生较大误差; 加之尽管拟南芥全基
因组测序已经完成, 但其基因组大小仍然有争议, 如
Bennet t等(2003)以新杆状线虫和果蝇为内标通过流式
细胞仪测得拟南芥的基因组大小为157 Mb, 而不是最初
测得的 125 Mb。根据 Dolezel 和 Bartos (2005)的研
究, 为避免非线性误差, 理想的内标应该选用与待测物种
基因组大小相近, 但又能够相互区分、遗传稳定、基
因组大小数据可靠且容易获得足够样品的物种。选用
玉米基因组作内标, 由于客观上其基因组大小与毛竹太
过接近, 测定混合样品时, 玉米峰和毛竹峰常会部分重叠
(桂毅杰等, 2007), 对实验结果准确性的影响难以避免。
另外, 从本研究中混合样品的散点图(图 4 和图 5)可以
看出, 粒子团区分明确清晰, 表明采用混合样品测定效
果良好。因此, 本研究以水稻作为内标来测定毛竹基
因组大小, 结果更为准确可靠。
致谢 感谢中国科学院国家基因研究中心韩斌先生
等在文献收集方面提供的帮助。
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(责任编辑: 孙冬花)
Estimation of Genome Size of Moso Bamboo (Phyllostachys edulis)
Lubin Li1, Jingyu Wu1, 2, Tao Hu1, Xuewen Yang3, Zhenhua Peng1*
1Ke y L abo rato ry of Tre e B ree din g an d Cult iva tio n, Sta te Fore stry Admi nistra tion , Rese arch Inst itu te o f Fore stry, Chi nese Acade my of
Fo restry, Be iji ng 1 000 91, Chi na; 2Co lle ge of L ife Scien ces, He bei Un ive rsi ty, Bao din g 0 710 02, Chi na; 3Ba mbo o an d Rattan
Scien ce and Techno log y L aborato ry, State Fo rest ry Admini strati on, Intern ati ona l Ce nte r for Bamboo and Ra tta n,
Be ijin g 1 001 02, Chi na
Abstr act Moso bamboo (Phyllostachys eduli s), a member of Bambusoideae (Bambusoideae), Gramineae (Poaceae), is one of
the mos t important economic bamboo species in China and in the w or ld. We aimed to estimate the genome size of moso bamboo
by f low cy tometry, using r ice (Oryza sati va) as an internal reference. A fter compar ing the peak values of the f luorescence
intens ity of 24 bamboo and rice samples, w e calculated the genome size of moso bamboo to be about 2 075.025±13.08 Mb, or 2 C
DNA about 4.24 pg (1 pg DNA = 0.978×109 bp). The results of this study w ill help in future research of the moso bamboo genome.
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* Author for correspondence. E-mail: lilubin@126.com