全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (5): 636-641, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-09-27; 接受日期: 2007-02-13
基金项目:国家自然科学基金(No. 30671709)和北京林业大学林木、花卉遗传育种教育部重点实验室课题(No. 05-05)
* 通讯作者。E-mail: gsm689@sohu.com
.组织培养简讯.
芨芨草愈伤组织器官发生及植株再生
王瑛 1, 周燕 1, 高述民 1*, 梁蕊 1, 刘艳 1, 李莉 1, 陈新德 2
1北京林业大学生命科学与技术学院, 北京 100083; 2新疆石河子农八师农业局, 石河子 832000
摘要 芨芨草(Achnatherum splendens (Trin.) Nevski)种子消毒并在MS培养基上萌发获得无菌苗, 以幼苗的叶鞘和胚轴为
外植体诱导愈伤组织, 经继代后进一步诱导不定芽及生根。研究结果表明, 诱导愈伤组织最适合的培养基为B5+1.5 mg.L-1
2,4-D+0.5 mg.L-1 NAA; 诱导芽分化较适合的培养基为B5+0.5 mg.L-1 6-BA +0.2 mg.L-1 NAA; 1/4 B5+1.0 mg.L-1 NAA+
0.2 mg.L-1 IBA +1.0 g.L-1活性炭培养基则有利于芨芨草试管苗的生根。本实验建立了完整的芨芨草植株再生体系, 移栽成
活率高。
关键词 芨芨草, 愈伤组织, 器官发生, 再生植株
王瑛, 周燕, 高述民, 梁蕊, 刘艳, 李莉, 陈新德 (2007). 芨芨草愈伤组织器官发生及植株再生. 植物学通报 24, 636-641.
芨芨草(Achnatherum splendens (Trin.) Nevski) 是
禾本科(Gramineae)芨芨草属(Achnatherum)多年生草本
植物。芨芨草耐盐碱、 抗干旱、耐寒, 适应性广, 主
要分布于亚欧大陆干旱与半干旱地区的草原带、荒漠
草原带和沙漠盐生草甸内。芨芨草具有较强的防风固
沙能力, 能够涵养水分、改良土壤、降低土壤盐碱化
程度, 是良好的水土保持植物; 同时, 又是用途广泛的经
济作物, 可作为牧草和用于制浆造纸。目前芨芨草的繁
殖主要是靠种子和分蘖繁殖, 远远满足不了我国西北部
生态环境建设和优质牧草及纸浆原料等的需求。采用
组织培养技术不但可为选育优质芨芨草种质提供有效方
法, 而且还可为人工快繁芨芨草种质(包括生产人工种
子、实现飞播造林等)提供理论依据。迄今, 有关芨芨
草组织培养中由愈伤组织诱导器官发生以及芨芨草体
细胞胚悬浮培养方面的研究尚未见报道。本研究以芨
芨草无菌苗叶鞘及胚轴为外植体诱导愈伤组织, 再经过
愈伤组织诱导芽和根, 首次获得大量芨芨草离体再生苗;
同时, 经过愈伤组织悬浮培养首次获得芨芨草体细胞胚
(研究成果将后续报道), 深入探讨了芨芨草离体快速繁
殖技术。
1 材料与方法
1.1 植物材料
芨芨草(Achnatherum splendens (Trin.) Nevski) 种子,
采自新疆准噶尔盆地。
1.2 愈伤组织的诱导
将芨芨草种子用自来水冲洗浸泡, 在超净台上用70%乙
醇处理30秒, 再以5% NaClO溶液消毒, 无菌水冲洗3
次, 乙醇及次氯酸钠溶液中均加入 1-2滴吐温 80。将
灭菌后的种子接种到MS培养基上, 于(25±1)°C暗培养
10天左右, 将萌发无菌苗的叶鞘和胚轴剪成5-10 mm
的小段, 诱导愈伤组织。试验选用MS、B5和 1/2 B5
(1/2 B5表示大量元素减至 1/2, 其它元素保持不变, 下
同)为基本培养基, 生长调节物 2,4-D、NAA和 6-BA进
行 L9(34)正交试验(表 1)。在(25±1)°C下暗培养, 获得
质地疏松、白色的愈伤组织, 愈伤组织经2次继代增殖
637王瑛等: 芨芨草愈伤组织器官发生及植株再生
后进行芽和根的诱导。培养 3 0 天时统计愈伤组
织诱导率。
1.3 不定芽与不定根的诱导
选取生长旺盛的愈伤组织, 诱导不定芽。以MS、B5
和1/2 B5为基本培养基, 选用生长调节物6-BA和NAA
进行L9(33)正交试验(表2)。培养45天时统计芽诱导率,
平均芽数。选取约3 cm且生长健壮的不定芽簇接种于
生根培养基上诱导生根。以 B5、1/2 B5和 1/4 B5
(1/4 B5表示大量元素减至 1/4, 其它元素保持不变, 下
同)为基本培养基, 选用 NAA、IBA和活性炭(active
carbon, AC)进行 L9(34)正交试验(表 3)。培养 30天时
统计生根率、平均根数和平均根长。在光照强度 1
500-2 000 mol.m-2.s-1, 光周期 12小时 /天的条件下
进行不定芽与不定根的诱导。
1.4 移栽
当试管苗形成健壮根系后, 打开封口膜锻炼3-6天, 幼
苗在流水中洗净根部附着的培养基, 用0.1‰高锰酸钾浸
泡 10分钟后, 栽于经高温灭菌的珍珠岩∶蛭石∶田园
土 = 3∶1∶6的基质中, 用稀释 20倍的 B5基本培养
基进行营养液施肥, 每 2周浇 1次, 在室温条件下培养,
30天后统计移栽成活情况。
2 结果与分析
2.1 种子消毒
实验中发现, 由于芨芨草种子外稃被毛, 消毒液较难与种
子充分接触, 导致污染率很高, 达 50%以上。吐温 80
作为表面活性剂, 可以有效提高消毒液的活性。在消毒
液中加入吐温 80后污染率降低到 20%左右。
2.2 愈伤组织诱导
芨芨草叶鞘及胚轴接种于按正交表设计的9种培养基上
(表1), 2天后大多数外植体出现脱分化, 培养10-15天
后, 1、5和 9号培养基中获得大量质地疏松、白色的
愈伤组织(图1A), 其余培养基中产生的愈伤组织有不同
程度的褐化或外植体未脱分化。培养30天时统计愈伤
组织诱导率, 并进行极差数据分析。由极差分析可知,
对于愈伤组织诱导率, 各因素的最佳组合为A2B3C2D1,
表 1 不同培养基对愈伤组织诱导的影响
Table 1 Effect of different media on callus induction
Test No.
A(Medium Phytohormones (mg.L-1) Explants Induction Induction frequency
type) B(2,4-D) C(NAA) D(6-BA) number number of callus(%)
1 1 (MS) 1 (0.5) 1 (0.0) 1 (0.0) 60 34 56.7
2 1 (MS) 2 (1.0) 2 (0.5) 2 (0.2) 62 21 33.9
3 1 (MS) 3 (1.5) 3 (1.0) 3 (0.5) 61 13 21.3
4 2 (B5) 1 (0.5) 2 (0.5) 3 (0.5) 53 9 17.0
5 2 (B5) 2 (1.0) 3 (1.0) 1 (0.0) 62 50 80.6
6 2 (B5) 3 (1.5) 1 (0.0) 2 (0.2) 69 16 23.2
7 3(1/2 B5) 1 (0.5) 3 (1.0) 2 (0.2) 36 3 8.3
8 3(1/2 B5) 2 (1.0) 1 (0.0) 3 (0.5) 60 3 5.0
9 3(1/2 B5) 3 (1.5) 2 (0.5) 1 (0.0) 77 67 87.0
K1 37.3 27.3 28.3 74.8
K2 40.3 39.8 46.0 21.8
K3 33.4 43.8 36.7 14.4
R 6.9 16.5 17.7 60.4
Excellent levels A2 B3 C2 D1
Sequence of factors D,C,B,A
Excellent combination A2B3C2D1
638 植物学通报 24(5) 2007
表 2 不同培养基诱导芽的效应
Table 2 Effect of different media on shoot induction
A(Medium type)
Phytohormones (mg.L-1) Induction frequency No. of shoots
Test No. B(6-BA) C(NAA) of shoots(%) /callus
1 1 (MS) 1 (0.5) 1 (0.0) 13.8 9.0
2 1 (MS) 2 (1.0) 2 (0.2) 24.1 10.4
3 1 (MS) 3 (1.5) 3 (0.5) 30.4 8.5
4 2 (B5) 1 (0.5) 3 (0.5) 38.5 6.3
5 2 (B5) 2 (1.0) 1 (0.0) 16.7 5.3
6 2 (B5) 3 (1.5) 2 (0.2) 17.9 4.7
7 3(1/2 B5) 1 (0.5) 2 (0.2) 41.9 3.8
8 3(1/2 B5) 2 (1.0) 3 (0.5) 26.7 2.4
9 3(1/2 B5) 3 (1.5) 1 (0.0) 10.7 5.0
Induction K1 22.8 31.4 13.7
frequency K2 30.3 22.5 33.9
of shoots K3 26.4 25.6 31.9
R 7.5 8.9 20.2
Excellent levels A2 B1 C2
Sequence of factors C,B,A
Excellent combination A2B1C2
图 1 芨芨草愈伤组织器官发生过程
(A) 叶鞘及胚轴诱导愈伤组织形成;
(B) 愈伤组织继代及开始出芽;
(C) 愈伤组织诱导芽的分化;
(D) 诱导生根及壮苗;
(E) 试管苗移栽
Figure 1 The organogenesis of Achnatherum splendens (Trin.) Nevski from callus
(A) callus induced by leaf sheath and hypocotyls;
(B) callus’ subculture and germination;
(C) shoot induction from callus;
(D) root induction and proliferation;
(E) tube plants’ transplanting
即B5+1.5 mg.L-1 2,4-D+0.5 mg.L-1 NAA; 实验所得最
佳组合为1/2 B5+1.5 mg.L-1 2,4-D+0.5 mg.L-1 NAA
(9号培养基), 与理论结果比较相近。各因素中以是否
添加6-BA对结果影响最大, 其极差值为60.4, 说明添加
6-BA对芨芨草愈伤组织的诱导反而不利。其它因素的
作用由大到小依次为 N A A、2 , 4 - D 和基本培养基。
639王瑛等: 芨芨草愈伤组织器官发生及植株再生
表 4 组培苗移栽成活情况
Table 4 Effect of transplanting on tube plant’s surviving rate
No. of No. of Surviving
transplant survival rate(%)
Plant height＞5 cm 67 67 100
Plant height＜5 cm 19 10 52.6
Total 86 77 89.5
表 3 不同培养基诱导生根的效应
Table 3 Effect of different media on root induction
Test No.
A(Medium
Phytohormones and accretion Induction Induction No. of Length of
type)
B(NAA C(IBA D(AC frequency of roots in roots in of plant
(mg.L-1)) (mg.L-1)) (g.L-1)) roots(%) average average(cm) (cm)
1 1(B5) 1(0.0) 1(0.0) 1(0.0) 38.5 3.5 0.7 6.1
2 1(B5) 2(0.5) 2(0.2) 2(0.5) 100 9.3 3.5 16.6
3 1(B5) 3(1.0) 3(0.5) 3(1.0) 86.7 8.7 4.0 10.4
4 2 (1/2 B5) 1(0.0) 2(0.2) 3(1.0) 81.3 9.2 3.8 16.1
5 2 (1/2 B5) 2(0.5) 3(0.5) 1(0.0) 37.5 6.3 0.9 7.9
6 2 (1/2 B5) 3(1.0) 1(0.0) 2(0.5) 62.5 7.0 3.2 14.4
7 3 (1/4 B5) 1(0.0) 3(0.5) 2(0.5) 85.7 7.0 9.5 19.1
8 3 (1/4 B5) 2(0.5) 1(0.0) 3(1.0) 100 4.7 10.0 16.1
9 3 (1/4 B5) 3(1.0) 2(0.2) 1(0.0) 100 16.5 1.6 15.6
K1 75.1 68.5 67.0 58.7
K2 60.4 79.2 93.8 82.7
K3 95.2 83.1 70.0 89.3
R 20.1 14.6 26.8 30.6
Excellent levels A3 B3 C2 D3
Sequence of factors D,C,A,B
Excellent combination A3 B3 C2 D3
6-BA的添加主要影响愈伤组织的褐化, 和部分植物一样,
愈伤组织的褐化是影响芨芨草成苗的一个难题。培养
基中的细胞分裂素BA或KT不仅能促进酚类化合物的
合成, 还能提高多酚氧化酶的活性; 较高浓度的 BA或
KT会加重培养材料的褐变 (高国训, 1999)。要解决这
一问题, 既要考虑培养基的激素配比, 又要兼顾激素的浓
度。2,4-D对于愈伤组织的诱导和生长非常有效, 特别
是对单子叶植物, 单独使用1-2 mg.L-1的2,4-D通常会
起到很好的效果, 不需要再加细胞分裂素。本实验结果
也表明, 添加高浓度的2,4-D(1.5 mg.L-1)有利于芨芨草
愈伤组织的诱导, 添加6-BA反而不利于芨芨草愈伤组织
的诱导; 但2,4-D对器官发生有强烈的抑制作用, 不利于
根和芽的启动和分化 (沈海龙, 2005)。因此在继代愈伤
组织时要降低 2,4-D的浓度, 避免过量 2,4-D积累产生
毒害效应, 抑制愈伤组织的器官发生。
2.3 不定芽的诱导
将获得的愈伤组织继代于 B5+0.5 mg.L-1 2,4-D+0.5
mg.L-1 NAA培养基上进行增殖, 每20天继代1次。继
代2次后将愈伤组织转入表2所示培养基上, 可诱导出
绿色的不定芽, 如图 1B。经数周培养产生的不定芽增
殖壮大, 如图1C。通过极差数据分析可知, 在不定芽诱
导率方面, 各因素的最佳组合为A2B1C2, 即B5+0.5 mg.
L-1 6-BA +0.2 mg.L-1 NAA, 实验所得最佳组合为 1/2
B5+0.5 mg.L-1 6-BA +0.2 mg.L-1 NAA(7号培养基),
与理论结果比较相近。根据 R值可知各因素对不定芽
诱导率的作用依次为 NAA、6-BA和基本培养基。在
不定芽分化数方面, 各因素最佳组合为A1B1C1(1号培养
基), 实际所得最佳组合为A1B2C2(2号培养基), 上述两
种培养基的芽分化数接近, 所以两种培养基都较适合促
进芽分化。
在植物形态建成过程中, 起主要作用的是培养基中
生长调节剂组合的配比; 细胞分裂素和生长素在外植体
640 植物学通报 24(5) 2007
离体培养中的作用是影响植物特定基因的激活与表达,
从而调节特定蛋白质的合成, 使整个细胞的分裂及分化
过程受到影响(赵术珍等, 2006)。图2显示了不同6-BA/
NAA值在不同基本培养基上对不定芽诱导率的影响。
比值为∝的3组数据是未添加NAA的培养基(1、5和9
号)的结果, 不定芽诱导率都较低, 可见在不同基本培养
基上仅添加 6-BA不利于不定芽的诱导。如图 2所示,
在MS和B5基本培养基上, 6-BA/NAA的值越低, 不定
芽诱导率反而越高; 而在1/2B5培养基上, 6-BA/NAA值
为2.5时(7号)不定芽的诱导率比其比值为2.0时高, 说
明在1/2B5培养基上6-BA/NAA的值在不低于2.0时有
利于芨芨草不定芽的诱导。Azad等 (2005)研究认为高
浓度的细胞分裂素和生长素会抑制芽的形成。本实验发
现在B5和1/2B5培养基上, 有NAA(0.2-0.5 mg.L-1)的
情况下较高的6-BA浓度均不利于不定芽的诱导(6和8
号), 与其结论一致; 而MS培养基上的结果却与之相
反。说明不同浓度的6-BA因基本培养基的种类不同而
产生不同的诱导效果, 因此需进一步的实验证实; 可在同
一种基本培养基上将两类激素浓度范围增大, 设计多个
配比组合以寻找出最佳配比。
2.4 生根及壮苗
当不定芽生长到3 cm以上时, 转入生根培养基(表3)进
行壮苗和生根, 2-3周就形成根系, 且生长健壮, 如图1D
所示。统计生根率, 并进行极差数据分析, 所得结果显
示对于生根诱导率, 各因素的最佳组合为A3B3C2D3, 即
1/4B5+1.0 mg.L-1 NAA+0.2 mg.L-1 IBA +1.0 g.L-1
AC, 实验中 2、8和 9号培养基生根率都达到 100%。
各因素中活性炭对生根率影响最大, 其R值为60.4, 其
它因素的作用依次为 IBA、基本培养基和 NAA。在平
均生根数方面的最佳组合为A3B3C2D1, 在平均根长方面
最佳组合为 A3B2C3D3, 在平均株高方面最佳组合为
A3B1C2D2。综合考虑, 仍以A3B3C2D3组合为最佳。活
性炭有很强的吸附作用, 可以吸附培养基中的杂质, 同时
也会吸附一些营养物质, 因此活性炭对生根的作用一直
存在争议。多数情况下, 一定浓度的AC能促进生根以
及根的伸长生长。徐春明等(2006)对新疆雪莲组培苗生
根的研究认为添加活性炭可以提高生根质量。本实验
也观察到添加活性炭的培养基中生根率较高, 且生根较
长。也有实验证明活性炭对邓恩桉的生根没有作用, 甚
至会抑制生根(欧阳磊, 2006)。不同材料, 不同培养条
件下活性炭的作用差异很大, 其在芨芨草组培中的作用
有待于进一步研究。
2.5 植株移栽
当培养植株发育出健壮根系后可进行移栽。将健壮试
管苗锻炼 3-6天后, 移栽至花盆内。移栽 30天后, 试
管苗大部分成活且生长状况良好, 见图 1E。从表 4中
可以看出移栽植株大小对成活率有一定影响, 株高大于
5 cm的植株成活率达到 100%, 株高小于 5 cm的植株
成活率只有52.6%, 说明如果植株较矮小不利于移栽成
活。因此在移栽组培苗时, 株高小于 5 cm的幼苗需进
图 2 6-BA/NAA对不定芽诱导率的影响
Figure 2 Shoots induction by different ratios of 6-BA/NAA
641王瑛等: 芨芨草愈伤组织器官发生及植株再生
In vitro Regeneration of Achnatherum splendens (Trin.) Nevski
Ying Wang1, Yan Zhou1, Shumin Gao1*, Rui Liang1, Yan Liu1, Li Li1, Xinde Chen2
1College of Biological Science and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China
2Agriculture Bureau of Xinjiang Shihezi Eighth Agriculture Division, Shihezi 832000, China
Abstract We studied the regeneration of Achnatherum splendens (Trin.) Nevski in vitro and selected several favorable media.
Germ-free plants were produced with germination on MS medium. Callus was induced with B5+1.5 mg.L-1 2,4-D+0.5 mg.L-1 NAA,
with leaf sheath and hypocotyls as explants. After two subcultures, shoots and roots were induced. The medium containing B5+
0.5 mg.L-1 6-BA + 0.2 mg.L-1 NAA was suitable for shoot induction. For root induction, the medium containing 1/4 B5+1.0 mg.L-1
NAA+ 0.2 mg.L-1 IBA +1.0 g.L-1 active carbon was favorable. With this regeneration system for A. splendens (Trin.) Nevski, we
achieved the highest survival rate of transplants.
Key words Achnatherum splendens (Trin.) Nevski, callus, organogenesis, plant regeneration
Wang Y, Zhou Y, Gao SM, Liang R, Liu Y, Li L, Chen XD (2007). In vitro regeneration of Achnatherum splendens (Trin.) Nevski. Chin
Bull Bot 24, 636-641.
行复壮, 不宜直接移栽。
参考文献
高国训 (1999). 植物组织培养中的褐变问题. 植物生理学通讯 35,
501-506.
欧阳磊 (2006). 邓恩桉组培生根影响因子的研究. 福建林学院学报
26, 78-82.
沈海龙 (2005). 植物组织培养. 北京: 中国林业出版社. pp. 41, 79-
(责任编辑: 孙冬花)
* Author for correspondence. E-mail: gsm689@sohu.com
82.
徐春明, 赵兵, 耿楠, 王晓东, 王玉春 (2006). 植物激素和活性
炭对新疆雪莲组培苗生根的影响. 中国农学通报 22(2), 41-
43.
赵术珍, 阮圆, 王宝山 (2006). 盐地碱蓬幼嫩花序的组织培养及植
株再生. 植物学通报 23, 52-55.
Azad M, Yokota S, Ohkubo T, Andoh Y, Yahara S, Yoshizawa
N (2005). In vitro regeneration of the medicinal woody plant
Phellodendron amurense Rupr. through excised leaves. Plant
Cell Tiss Organ Cult 80, 43-50.