全 文 :植物学通报 2004, 21 (1): 19~25
Chinese Bulletin of Botany
①国家“8 6 3”计划项目(2 0 0 3 A A 6 2 7 0 1 0)。
②通讯作者。Author for correspondence.
作者简介:陈华,男, 1979 年生,中国科学院植物研究所植物学专业硕士研究生。李银心,中国科学院植物
研究所研究员,“8 6 3”课题负责人。
收稿日期:2003-07-22 接受日期:2003-09-22 责任编辑:白羽红
蒲公英研究进展和用生物技术培育
耐盐蒲公英展望①
陈 华 李银心②
(中国科学院植物研究所光合作用与环境分子生理学重点实验室 北京 100093)
摘要 蒲公英属(Taraxacum)植物种类多,分布广,是常见的农业杂草,还是重要的中药材。目前,
蒲公英作为蔬菜食用得到了人们的充分重视,并逐渐成为时尚。近年来,人们深入研究了蒲公英的化学
成分和药理作用,关于蒲公英的组织培养、核型与分子水平的研究也已开展,但蒲公英的生物技术培育
工作鲜有报道。在对蒲公英的开发利用和研究现状作概述的同时,结合我们的工作提出生物技术培育抗
盐、耐海水蒲公英的努力方向,以期为进一步开发利用蒲公英打下基础。
关键词 蒲公英属,组织培养,耐盐突变体,核型,遗传转化
Biotechnological Breeding for Salt Tolerance of Dandelion
CHEN Hua LI Yin-Xin②
(Key Laboratory of Phytosynthesis and Environmental Molecular Physiology, Institute of Botany,
the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093)
Abstract Dandelion is historically recognized as weedy plant and is familiar to us as medicinal herb.
It comes into fashion as a new type of vegetable in recent years. Though many research works on the
chemical constitutes, medical mechanism,caryotype,cell culture and molecular biology of dande-
lion have been carried out,rare biotechnological modification has been done. In this review,
combined with our works,we reviewed the research situation of dandelion and focused on the trend
of the biotechnological breeding for salt tolerance,in order to develop dandelion application further.
Key words Taraxacum,Tissue culture,Salt-tolerant mutant,Caryotype,Genetic transformation
通常,我们将菊科(Compositae)蒲公英属的植物统称为蒲公英,全属约 2 000余种,
主要产于北半球温带至亚热带地区,少数产于热带南美洲。我国有 70种、1变种,广泛分
布于东北、华北、西北、华中及西南各省区。蒲公英分布广泛,有较强的环境适应能力,
而且种子易于随风飘散,以致农民将其视为恶性杂草(Schnick et al,2002)。蒲公英开花
期长,是一种重要的粉源植物。研究蒲公英生态学地位也是一个重要课题。
蒲公英性寒味苦,具有清热解毒等功效,是一种重要的中药材。蒲公英的化学成分复杂
(Williams et al,1996;Budzianowski,1997),其主要活性成分是蒲公英甾醇。最新研究
20 21(1)
表明,蒲公英甾醇具有抗肿瘤的作用(赵守训和杭秉倩,2001),而且在蒲公英中含量较
高,从而使蒲公英成为开发抗癌新药的又一个努力方向。
与一般野生植物相比,蒲公英中富含抗氧化物质(黄酮、异黄酮、Vc 等)和抗氧化
酶(过氧化物酶、过氧化氢酶等)(陆长海等,2001;陈景耀等,2001;Hu et al,2003),
这类物质可有效清除体内自由基,延缓皮肤衰老。因此蒲公英的提取物可用来加工化妆品。
蒲公英不仅可作药用,还是优质的保健蔬菜。近年来,美国、法国和日本已陆续兴起
“蒲公英热”,蒲公英已成为国内外亟待开发的特种蔬菜(郭文场和徐启国,2001)。蒲公英
集食用和药用于一身,人们习惯称之为食疗蔬菜;由于蒲公英是多年生草本植物,人们又称
之为续根蔬菜。
过去,关于蒲公英的研究工作主要集中在研究其主要化学成分和药理作用。近几年,蒲
公英作为一种特优蔬菜而被广泛关注。为了更好的开发和利用蒲公英,还应当开展更加深入
的研究。
本文结合我们的研究工作概述了蒲公英的食用价值和当前的研究进展,并展望了用生物技
术培育抗盐、耐海水蒲公英。
1 优质的保健蔬菜——蒲公英
蒲公英是传统的营养保健蔬菜,可炒食,也可作为蘸酱生菜。在欧洲,蒲公英用来做
可口的三明治和色拉,深受人们的喜爱。
蒲公英作为蔬菜食用,具有丰富的营养价值,其叶片中蛋白质、脂肪、维生素、胡萝
卜素等有机营养成分的含量明显高于其他常见蔬菜,而且还含有丰富的微量元素,其中包括
钙、铁、硒等人体必需的矿质元素。据测定,蒲公英中的钙的含量是番石榴的 2.2倍、刺
梨的 3.2倍,铁的含量是刺梨的 4倍,山楂的 3.5倍,硒含量达到 14.7 mg/100g,是自然界罕
见的富硒植物。人体最容易缺乏的营养元素是钙和铁,而硒具有很强的生理活性,因此蒲公
英是具有较高营养价值的绿色食品。《随息居饮食谱》记载,蒲公英“清肺、利咳化痰、
清热消毒”。蒲公英将食用和药用集于一身,必将成为蔬菜市场的新宠。
“海洋农业”因其巨大的开发前景和生态意义,一直受到人们的关注。本实验室自承担
“国家海洋 863计划”课题以来,先后通过大量的种质资源筛选以及细胞工程的方法,成功
培育出了耐 1/3 海水的蔬菜(杜立群等,1999),如豆瓣菜、叶用甜菜、芹菜等,并已试
点种植,在耐海水蔬菜的开发方面迈出坚实的步伐。与一般蔬菜相比,耐海水蔬菜营养价值
更丰富,口感更好,具有远大的开发前景。蒲公英是一种亟待开发的特优蔬菜,选择蒲公
英作为开发耐海水蔬菜的另一个种质资源,可以集蒲公英的营养保健价值和耐海水蔬菜的食用
价值于一身,必将为蒲公英的开发利用带来更广阔的前景。
2 蒲公英的研究进展
2.1 蒲公英的组织培养
蒲公英的组织培养工作已有报道,但真正系统的研究并不多见。Song等(1991)以
MS+0.2 mg/L IAA+1 mg/L TDZ为培养基,以叶柄为外植体对蒲公英(Taraxacum mongolicum
Hand-Mazz)进行组织培养,建立了快速高效的再生系统。我们将药用蒲公英(Taraxacum
212004 陈 华 等:蒲公英研究进展和用生物技术培育耐盐蒲公英展望
officinale F.H.Wigg)叶片接种于上述培养基上,也取得了十分理想的结果。Hook等(1991)
分别用两种培养基对药用蒲公英进行了悬浮培养,并且比较在两种培养基中蒲公英的生长状
况。结果表明,在改良的 B5培养基中(B5+NAA 1.86 mg.L-1+酪蛋白水解物 2 g.L-1)接种
8 d后细胞便处于对数生长期;而在改良的MS培养基(MS+2,4-D 0.22 mg.L-1+NAA 0.186 mg.
L-1)中,接种后 13 d细胞才处于对数生长期,说明细胞在改良的B5培养基中能更好地生长。
光照对蒲公英愈伤组织的生理活动有较大的影响。Akashi等(1997)研究发现,一定
的光照下,在富含细胞分裂素的培养基上,蒲公英愈伤组织呈现紫红色,表明有花色素的产
生;而在黑暗条件下,愈伤组织呈现灰色。并且,在紫红色愈伤组织提取物中,检测到了
查儿酮合酶活性,后者的提取物中则不具备查儿酮合酶活性。
2.2 关于蒲公英无融合生殖的研究
无融合生殖现象在蒲公英属十分显著,也是一个研究热点。对蒲公英的核型研究表明,
蒲公英的染色体数有 2n=18,24,32的变化,染色体基数为 x=8,而其无融合生殖体通常是
三倍体(2n=3x=24)(Richards et al,1973)。对戟片蒲公英(Taraxacum asiaticum Dahlst)
的核型进行研究表明,戟片蒲公英的体细胞染色体数目为 2n=4x=32(王艳等,1998)。
近年来,关于药用蒲公英无融合生殖的研究取得了新的进展。1999年 7月召开的国际植
物学大会上,Peter van Baarlen等指出,正常的二倍体植株(2n=2x)能与无融合生殖体
(2n=3x)进行杂交,但产生的后代座果率或种子萌发率低下。2002年举行的植物、动物和
微生物基因组学会议上,Peter J.Van Dijk指出,药用蒲公英的无融合生殖有 3个元素构成:
1)大孢子母细胞减数分裂受阻,通过有丝分裂形成胚囊(二倍体孢子生殖);2)孤雌生殖
(parthenogenesis);3)自主胚乳发育,这 3种因素分别由不同的基因控制,而只有二倍体
孢子生殖是显性单基因性状,该基因定位于核仁组织区(NOR)的染色体上。最近,生物
学家深入分析了药用蒲公英胚胎发育过程中激素尤其是细胞分裂素水平的变化(Gussakovskaya
and Blintsov,2003),为探讨药用蒲公英的无融合生殖机理提供了新的依据。
2.3 分子水平的研究
目前,已经从蒲公英中分离纯化了根部过敏原蛋白(root allergen protein)、NADH脱
氢酶、查儿酮合酶、氧化鲨烯环化酶(oxidosqualene cyclase)、羽扇豆醇合成酶,以及
蔗糖 -果糖合成酶。最近,在药用蒲公英根部乳汁中分离了一种新的蛋白酶,命名为 taraxalisin
(Rudenskaya et al,1998)。这种蛋白酶的分子量为 67 kDa,在 pH 8.0时活性最高,是枯
草芽孢杆菌蛋白酶家族的一个成员(Bogacheva et al,1998)。
果聚糖是以果糖为单体形成的寡糖或多糖,其聚合度具有种特异性甚至组织特异性,它
不仅是一种贮藏物质,还是一种重要的渗透调节物质。果糖的合成过程需要两个重要的酶参
与:蔗糖 -果糖基转移酶(1-SST)和果糖 -果糖基转移酶(1-FFT),其中 1-SST是关键
酶。人们已经克隆了菊苣、洋葱等植物中编码果聚糖合成酶的基因的 cDNA,在此基础上,
通过 RT-PCR分离并克隆了药用蒲公英中 1-SST基因的 cDNA(van den Ende et al,2000),
Northern blotting和Western blotting的比较结果表明,1-SST的基因表达调控主要发生在转录
水平。
药用蒲公英根中富含一种 18 kDa蛋白,其含量随季节变化而略有不同(Cyr et al,
1990),因此一直被认为是储藏蛋白(vegetative storage proteins,VSPs)的一个成员。然
22 21(1)
而,最近的研究结果对这一观点提出了质疑(Xu et al,2000)。首先,植物生长旺盛时
会消耗VSPs使其含量维持在较低水平,而这种 18 kDa蛋白在生长旺季的含量较高;其次,
叶片脱落并没有引起这种蛋白质的转移;不利的环境因子如水分胁迫、机械损伤等会诱导
VSPs的合成,但不能使这种 18 kDa蛋白含量增加。因此,此蛋白的生理作用尚有待于进一
步的研究。
蒲公英的遗传转化研究鲜有报道。Song等(1991)利用自己获得的再生系统对蒲公英进行组
织培养,在此基础上,对蒲公英进行了遗传转化——将 35S-GUS基因和 35S-NPTⅡ基因连接
在双元表达载体pROA93上,并将构建好的载体转入根癌农杆菌EHA101菌株,以农杆菌介导
法获得了转基因蒲公英。检测表明,转基因蒲公英获得了GUS活性,并具有了卡那霉素抗性。
3 用生物技术培育抗盐、耐海水蒲公英展望
盐胁迫是影响作物产量的一种主要的非生物胁迫,目前全世界近20%的可耕地受到盐渍化
的影响(Yokoi et al,2002);另一方面,由于工业的发展和人口的不断增长,土壤的盐
渍化仍在加剧。如何开发利用盐碱地以增加有效可耕地面积、提高粮食产量,已成为当前生
物科学的重大课题。实践证明,改良盐碱土投入大、效果不能持久,而且淡水排盐还会带
走土壤中的其他养分(赵可夫,1993),可谓得不偿失;培育耐盐作物品种、提高作物耐盐
性的生物学途径才是最根本和最经济有效的方法。
根据我们多年的相关研究及实践经验,在盐渍化土壤和海水或咸水胁迫下生长的植物能够
更多地积累营养元素和活性物质,因此在盐胁迫条件下种植的作物具有更好的营养、药用和
其他经济品质。这也使得我们有必要通过各种途径筛选和培育多样化的抗盐、耐海水的经济
植物,从而达到充分利用现有盐渍化土地和海水或咸水资源的效果。
作物的耐盐育种可以通过常规杂交育种以及生物技术培育途径来实现,后者主要是指通过
组织培养获得耐盐突变体以及培育抗盐的转基因作物。
蒲公英既是优质的保健野菜,也可以作药。近几年,人们充分认识到蒲公英的营养价
值、医疗价值和经济价值,开始进行蒲公英的大规模栽培。在此基础上,关于蒲公英的化
学成分和药理作用的研究也在深入地进行。然而,关于蒲公英的生物技术应用研究却鲜有报
道。随着蒲公英研究和开发利用的深入,对蒲公英的研究已由整体水平逐渐深入到细胞水平、
分子水平,由纯粹的基础研究转向基础应用研究。蒲公英种类繁多,其中许多种类如荒漠蒲
公英(Taraxacum monochlamydeum Hand-Mazz)生长在盐渍环境中,但生物量小,很难在
生产中获得高产,开发价值不高。而与它们同属的药用蒲公英,生物量大,营养价值、医
疗价值和经济价值都较高,适于作为蔬菜,但耐盐性却较弱。我们对药用蒲公英进行苗期耐
盐性鉴定,结果表明当基质中含 85 mmol.L-1 NaCl时其生长便受到抑制。由于同一属的不同
种之间亲缘关系较近,因此我们在利用组织培养中的体细胞无性系变异现象筛选药用蒲公英突
变体时应当有较高的几率可获得耐盐突变体,使其应用具有更广阔的前景。
3.1 利用组织和细胞培养筛选耐盐性较高的蒲公英
体细胞无性系变异是植物组织培养中的一个普遍现象,其分子机理包括染色体水平及分子
水平的变异。有人在药用蒲公英的无性系中检测到了 rDNA(编码 rRNA)的变异(King and
Schaal,1990),具体表现为上 EcoRⅠ酶切位点的消失,为探讨体细胞无性系变异的分子机理
232004 陈 华 等:蒲公英研究进展和用生物技术培育耐盐蒲公英展望
提供了新的实验依据。
利用组织和细胞培养过程中的体细胞无性系变异筛选耐盐突变体已在40多种植物上进行过
研究 (周荣仁等,1989),但关于蒲公英的耐盐突变体的筛选工作尚未见报道。利用细胞工程
筛选得到蒲公英耐盐突变体,可以扩大蒲公英的应用范围。一旦获得了高耐盐性的蒲公英,
就可以尝试在适当浓度的海水中种植。
一般说来,利用组织和细胞培养筛选耐盐变异体主要通过以下程序:1)建立长期具有高频
分化能力的无性系;2)愈伤组织耐盐变异系的筛选;3)耐盐愈伤组织变异系的耐盐性和耐盐稳
定性分析;4)耐盐愈伤组织的分化和再生植株的耐盐性鉴定。对外植体或愈伤组织进行诱变处
理,可以大大提高诱变频率。常用的化学诱变剂为 EMS,也有用抗菌素;物理诱变多用不
同剂量的 60Co γ射线、快中子等。化学诱变剂一般用于处理愈伤组织,而物理诱变则较多
地直接照射种子或外植体(王仑山等,1996)。在植物组织培养中,由外植体再生植株有
两个途径,即愈伤组织途径和胚状体途径,耐盐突变体的筛选工作大多通过前者完成。然
而,耐盐愈伤组织经反复筛选后往往难以分化成植株,因此在筛选蒲公英耐盐突变体的工作
中,我们通过胚状体途径,使外植体在含盐的胚状体诱导培养基上直接分化出植株,已在含
85 mmol.L-1 NaCl的培养基中获得再生植株40多株,在含160 mmol.L-1 NaCl的培养基中获得
再生植株19株,在含246 mmol.L-1 NaCl培养基中获得再生植株7株,目前正在进行这些变异
体的生理鉴定和分子鉴定。
3.2 基因工程转化药用蒲公英的研究
除通过细胞工程获得突变体外,基因工程也是当前作物育种的有效手段。近几年通过基
因工程获得耐盐的转基因植物取得了许多成果(Zhao et al,2003)。本实验室成功地将来
源于山菠菜的 BADH基因转入豆瓣菜(Nasturtium officinale R.Br)(李银心等,2000)和
番茄(Lycopersicon esculentum Mill cv.Bailichun)(Jia et al,2002),获得的转基因当代
植株分别能够耐受136 mmol.L-1和180 mmol.L-1 NaCl胁迫,并且转基因植物的耐盐性状通过
自交传给了子代(未发表资料)。我们拟将本实验室克隆的盐角草Na+/H+ 逆向转运蛋白基因
(SeNHX1)转入药用蒲公英,以获得具有一定耐盐性的转基因蒲公英,同时为 SeNHX1在
植物抗盐反应中的作用提供实验依据。
3.3 通过随机扩增多态性 DNA(RAPD)技术对蒲公英进行遗传多样性分析
随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphism DNA),即RAPD技术是Williams
等在 1990年推出的,该技术根据 PCR原理,以随机设计的寡核苷酸引物扩增DNA中的一些
片段。短短几年,此方法已成功地应用于遗传多样性检测、基因定位、品系鉴定、遗传图
谱构建和系统学研究等诸多领域(汪小全等,1996)。大量研究证实,RAPD标记完全适用
于种内、种间乃至近缘属间亲缘关系的研究(乔爱民等,1998;孔令让等,1998),RAPD
用于分子图谱的构建也取得了很大进展,已构建的RAPD图谱有拟南芥(Reiter et al,1992)、
水稻(陈洪等,1995)等,然而 RAPD在蒲公英中的应用尚未见报道。我们可以在对蒲公
英核型研究的基础上,通过 RAPD技术对抗性基因进行定位,还可以通过此技术对蒲公英属
植物进行品系鉴定和系统学研究。蒲公英种类繁多,还存在无融合生殖现象,这些都给蒲公
英的分类带来困难。RAPD分析可以在一定程度上解决这一问题,为蒲公英的生物技术研究打
下基础。
24 21(1)
我们相信,随着人们对蒲公英的重视程度不断提高,对蒲公英的研究也一定会越来越深
入。相应地,蒲公英给我们带来的利益也会更多。
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