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Studies of Cell Suspension Culture and Induction of Secondary Metabolism Products in Cinnamomum longepaniculatum

油樟悬浮培养及次生代谢产物的诱导



全 文 :植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (5): 591-596, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-12-12; 接受日期: 2008-01-20
基金项目: 四川省教育厅青年基金项目(No.2003B039)和四川省科技厅资助项目(No.04JY029-064)
*通讯作者。E-mail: w eiqin2001-67@163.com
.组织培养简讯.
油樟悬浮培养及次生代谢产物的诱导
魏琴 1*, 王丽 2 , 傅体华2 , 周黎军1
1宜宾学院西南特色经济植物保护与利用重点实验室, 宜宾 644000; 2四川农业大学, 雅安 625014
摘要 以油樟(Cinnam om um longepanicu la tum)叶片为外植体在附加6-BA和NAA不同激素浓度组合的MS培养基上筛选
质地疏松、生长旺盛的愈伤组织, 分别接种在MS、B5、WPM三种液体培养基中进行细胞悬浮培养, 并检测诱导产生的次生
代谢产物。结果表明: 2 m g.L-1 6-BA+ 0.5 m g.L-1 NAA能诱导质地疏松、生长旺盛的愈伤组织, B5基本培养基中细胞长势最
好; 愈伤组织在B5+2 m g.L-1 6-BA+ 0.5 m g.L-1 NAA中悬浮培养, 继代2次后形成均一的单细胞; 从油樟悬浮培养物中检测出
50%以上的成分是苯甲醇。
关键词 愈伤组织, 油樟, 次生代谢, 悬浮培养
魏琴, 王丽, 傅体华, 周黎军 (2008). 油樟悬浮培养及次生代谢产物的诱导. 植物学通报 25, 591-596.
油樟(Cinnamomum longepaniculatum)是樟科
(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)常绿乔木。其根、茎
和叶均可提制樟脑、樟油, 油中含有桉叶素、黄樟
素、芳樟醇、松油醇和柠檬醛等多种重要成分, 是提
炼天然香料的优良树种(赵聆君, 1994)。但由于植物细
胞生长缓慢和次生代谢产物含量很低, 限制了其大规模
发展。近年来利用植物组织培养和悬浮培养来保存资
源和生产植物次生代谢产物的报道较多(赵军等, 2001;
江静和尚富德, 2002), 但作为西南特色经济植物的油樟,
目前在组织培养方面仅在克服丛生芽玻璃化和外植体污
染(魏琴等, 2006; 周锦霞等, 2006)及愈伤组织诱导问题
(王丽和魏琴, 2007)上有所研究, 而有关悬浮培养国内外
均未见报道。因此, 对油樟悬浮培养的研究将对该物种
次生代谢产物的生产具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
以油樟(Cinnamomum longepaniculatum (Gamble) N.
Chao ex H. W. Li)叶片为外植体, 油樟采自宜宾市邱场
乡油樟种植基地。
1.2 方法
1.2.1 愈伤组织诱导的激素配比筛选
以叶片为外植体诱导愈伤组织, 以MS为基本培养基, 附
加 6-BA 和 NAA 的不同浓度组合(表 1)。每种培养基接
种30个外植体, 接种25天后观察愈伤组织生长情况, 以
筛选出适合愈伤组织悬浮培养的激素配比。
1.2.2 愈伤组织诱导的基本培养基筛选
筛选出的质地疏松、生长旺盛的愈伤组织经扩大培养
后, 分别以MS、B5、WPM 为 3种基本液体培养基并
附加 2 mg.L-1 6-BA+ 0.5 mg.L-1NAA 进行试验。每
20 mL培养基(50 mL三角瓶中)接种一定量的愈伤组织,
置于旋转摇床振荡培养, 6天后, 每 3天测定 pH值、细
胞鲜重(g)及 60°C 烘箱烘干后的细胞干重(g)。以培养
时间为横坐标, 分别以细胞鲜重(fresh weight, FW)、细
胞干重(dry weight, DW)和pH值为纵坐标作图, 以研究
细胞悬浮培养过程中细胞生长和培养液 pH 变化的规
律。每个处理重复 3 次。
592 植物学通报 25(5) 2008
1.2.3 单细胞悬浮培养体系的建立
在细胞生长量最高期, 待细胞沉淀后, 倾去上部培养液,
添加新鲜培养液继代, 经2次继代培养后取下三角瓶, 静
置 30分钟, 待较大块愈伤组织沉淀后, 用无菌移液管吸
取5 mL上层液, 移入新鲜培养基中继续在摇床上进行连
续振荡培养, 以获得单细胞或小块愈伤组织悬浮液。通
过显微镜观察检测单细胞及细胞团的存在。
1.2.4 培养条件
固体培养条件: 蔗糖浓度为30 g.L-1, 琼脂浓度为6.0 g.
L-1, 培养基起始pH为5.8, 温度为25±1°C, 周期性人工
光照为 14小时 / 天, 光照强度为 36 mmol.m-2.s-1。
液体培养条件: 蔗糖浓度为30 g.L-1, 黑暗条件, 温
度为 25±2°C, 摇床转速为 110 rpm。
1.2.5 悬浮培养物成分提取
油樟悬浮培养物在60°C烘干后, 取5 g干物质通过水蒸
气蒸馏法制得油樟精油水混合物置于分液漏斗中, 静置,
待分层后, 放出下层液体, 用乙醚萃取3次, 萃取液经旋
转蒸发仪蒸去乙醚, 残留液烘干多余水分后用甲醇定容
至 25 m L容量瓶中待测。
1.2.6 悬浮培养物提取液的 GC/MS分析
采用GCMS-QP2010(日本岛津公司)气相色谱质谱连用
仪。气相色谱: 色谱柱HP -5M S 石英柱(25 m×0. 22
mm, 0.25 mm); 初始温度 65°C, 保持 3分钟, 以 3°C.
min-1升温至 120°C, 再以 5°C.min-1升温至 250°C保
持 10分钟; 载气为氦气; 柱流量为 1 mL.min-1, 分流比
为 30:1; 进样口温度 260°C; 进样量 1 mL。
质谱: EI源, 电子能量 70 eV, 质量扫描范围 35-
450, 倍增管电压 1.2 kV, 溶剂延迟 3.5 分钟。
2 结果与讨论
2.1 激素配比筛选
有研究结果(罗成科和彭正松, 2005; Zhan and Ma,
2006)表明, 不同激素配比下诱导的愈伤组织的颜色、
形态和生长势是不同的。本实验选用不同激素配比进
行叶愈伤组织的固体培养, 目的是筛选出适宜悬浮培养
的质地疏松、生长势旺盛的愈伤组织(Zhai and L iu,
2003; Li and Bao, 2005)。由表 1可见, 愈伤组织颜
色变化与激素浓度和配比无明显的相关性; 从愈伤组织
形态看, 6-BA 浓度超过 4 mg.L-1时, 形态出现异常(水
化或褐化现象); 从生长状况看, 6号培养基(6-BA/NAA=
4:1)和 4号培养基(6-BA/NAA=200:1)时生长状态最好
(+++), 2种愈伤组织的区别在于 6号培养基上产生的愈
伤组织质地更疏松。
根据适合悬浮培养的愈伤组织的选择标准, 我们选
择 6号培养基的激素配比(2 mg.L-1 6-BA+ 0.5 mg.L-1
NAA)作为进一步研究的依据, 6号培养基上产生的愈伤
表 1 不同生长调节剂配比对油樟叶片愈伤组织生长状态的影响
Table 1 Eff ec t of plant grow th regulators on the grow th of callus of Ci nnamomum longepani cul atum leaves
Code Hormones (mg.L-1) Condit ion of the callus
6-BA NA A Grow th condition Colour and texture
1 1 0.01 ++ With buf f, opaque, f riable callus f ormed
2 1 0.2 ++ Green, compact texture
3 1 0.5 ++ Light green, compact texture
4 2 0.01 +++ Buff w ith a little amaranth compact texture
5 2 0.2 ++ Yellow , compact texture
6 2 0.5 +++ White, translucent f riable callus f ormed
7 4 0.01 ++ Brow n callus w ith hydration phenomenon
8 4 0.2 - Serious hydration and stop grow th
9 4 0.5 + With a litt le brow n callus on surface
+++: 长势好; ++: 长势较好; +: 长势一般; -: 没有生长现象
+++: Grow w ell; ++: Grow less w ell; +: Normal; -: Stop grow ing
593魏琴等: 油樟悬浮培养及次生代谢产物的诱导
组织用作进一步研究的材料。
2.2 基本培养基筛选
通过比较 3种不同培养基的培养情况, 如图1所示, 在3
种培养基中细胞生长基本呈“S”曲线(图1A, B), 这可能
与随着培养时间的延长细胞出现褐化并死亡有关。在
MS 培养基中愈伤组织鲜重和干重均在培养 12 天时达
到最大, 而 B5和WPM中愈伤组织生长量均在 15天时
达到最高峰。培养 15 天时测定的重量, W B5 (鲜、干
重分别是 1.99 g和 0.18 g)>WWPM (1.30 g和 0.14 g)
>WMS (1.08 g和0.12 g), 说明油樟愈伤组织生长速度
和生长量的差异与培养基提供的营养成分的差异密切相
关, 这与赖家业和兰健(2004)的报道一致。该结果同时
说明B5培养基最适合油樟叶片愈伤组织的生长。B5培
养基的营养特征是硝酸盐和钾盐含量高(李浚明和朱登
云, 2005)。油樟叶愈伤组织能在 B5 培养基中较快生
长, 可能与B5中较高浓度的硝酸盐和钾盐有关, 但其真
正机理还有待于进一步研究。
培养基的酸碱度与培养基中各种营养成分的活性有
直接的关系, 从而影响细胞对其吸收和利用(江静和尚富
德, 2002)。如图 1C所示, B5培养基的 pH值先降低后
升高, 这可能与生长初期细胞吸收了大量NH4+和K+, 使
液体培养基中 pH降低, 而后又由于生长压力多酚氧化
图 1 油樟悬浮培养过程中细胞的鲜重(A)、干重(B)和培养基
pH(C)的变化
Figur e 1 The change of the fresh w eight (A), dry w eight (B)
of cells and the pH of medium (C) dur ing the process of cell
suspension culture of Ci nnamomum longepaniculatum
图 2 油樟悬浮培养细胞
(A)细胞悬浮培养液; (B)悬浮培养产生的单细胞;
(C)单细胞进行细胞分裂; (D)由单细胞分裂产生的细胞团
Figure 2 The cell suspension culture of Ci nnamomum
longepaniculatum
(A) Cell suspension culture; (B) Single cell from suspens ion
culture; (C) The cell divis ion; (D) Cell c lump f rom the single cell
division
594 植物学通报 25(5) 2008
酶活力增强, 使酚类物质释放到液体培养基中从而导致
pH上升(Moura-Costa et al., 1993)。MS 和WPM 培
养基 pH值变化不大(图 1C), 可能与细胞对其各种营养
成分的吸收量较一致有关。
图 3 油樟悬浮培养提取液的总离子流色谱分析
Figur e 3 Total ion current chromatogram of extract of suspension culture of Ci nnamomum longepaniculatum
表 2 油樟悬浮培养物GC/MS测定
Table 2 A nalysis of constituents of Ci nnamomum longepani cul atum cell suspension culture through GC/MS detection
Code Compounds Remain t ime (min) Relative content(%)
1 1-cyc lohexy lethylamine 3.720 3.48
2 3-hydroxy-benzaldehyde 8.883 4.62
3 3,3-dimethyl-piper idine 11.084 1.59
4 5- (2-propenyl) -1,3-benzodioxole 19.403 8.65
5 Propionic amide 21.174 1.95
6 Diethylenetriamine 27.173 1.95
7 Propionamide 31.612 3.13
8 a-methy l-phenethylamine 32.377 2.64
9 Butyramide 32.976 2.47
10 N-methyl-benzeneethanamine 35.191 2.19
11 a-methy l-benzeneethanamine 35.590 1.16
12 N-methyl-phenethylamine 36.158 3.32
13 Tr icyclo[4.3.1.1(3,8)]undecane-1-carboxy lic ac id 38.301 1.86
14 d-alanine 41.123 1.51
15 2-amino-1-propanol 43.697 1.80
16 dl-pheny lephrine 46.038 1.48
17 (S)-(+)-1-cyclohexy lethylamine 48.323 2.39
18 3-hydroxy -a[(methylamino)methyl]-benzenemethanol 49.576 50.73
19 3-homoadamantane carboxy lic ac id 51.166 2.44
2.3 悬浮培养物光学显微镜观察
通过镜检发现, 悬浮液中既有单个细胞又有细胞团块。
分裂期的单细胞最多, 细胞形态呈椭圆形或球形, 体积较
大(图 2B )。而在此后的观察中则很少见到处于分裂期
595魏琴等: 油樟悬浮培养及次生代谢产物的诱导
的单细胞, 细胞近椭圆形和圆形, 体积较小, 成团出现且
细胞团块的数目迅速增加(图 2B, C, D)。这可能与游离
单细胞的互相黏连有关。过多、过大的细胞团块不利
于次级代谢物的提取(李浚明和朱登云, 2005)。因此,
如何获取更多的单细胞是进一步研究的重要方向。
2.4 悬浮培养物成分提取与分析
通过水蒸气蒸馏、有机溶剂萃取及 GC/MS检测对油樟
悬浮培养愈伤组织所含有效成分进行分析, 得到总离子
流色谱(图 3)。采用计算机对各峰质谱图进行标准谱库
检索, 利用峰面积归一化法计算各组分相对含量(表 2)。
从油樟悬浮培养物中检测出 N- 甲基 - 苯甲醇、哌啶、
正丙醇、三胺、丙酰胺和十一烷烃等化合物及其衍生
物, 其中3-OH-a [(甲氨基)甲基]苯甲醇相对含量最多, 达
到 50.73%。该物质是苯酚的衍生物, 也是油樟芳香性
的主要成分。悬浮培养物成分分析表明, 油樟愈伤组织
中含有大量鲜叶中没有的有效成分, 包括苯甲醇、哌
啶、正丙醇、三胺、丙酰胺和十一烷烃等化合物及其
衍生物, 从而为油樟的更广泛应用提供了依据。
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Ag ricultura l University, Ya ’an 62 501 4, Chi na
Abstr act Well-grow ing and f riable calli from leaves of Ci nnamomum longepaniculatum w ere screened on Murashige and Skoog
(MS) medium w ith different plant grow th regulators inc luding 6-benzy ladenine (6-BA) and 1-naphthaleneacetic acid (NAA ). Calli
w ere cultured on MS medium, Gamborg medium (B5) and w oody plant medium (WPM) through suspens ion culture, and secondary
metabolism products w ere detec ted. Well-grow ing and friable-struc tured calli w ere induced on 2 mg.L-1 6-BA + 0.5 mg.L-1 NA A,
and grow th of calli w as bes t on B5 medium in three liquid media. Single cells w ere formed on B5 medium w ith 0.2 mg.L-1 6-BA +
0.5 mg.L-1 NAA after tw o per iods of subcultivation. More than 50% benzenemethanol w as detected in the secondary metabolism
products.
Ke y w ords call us, Ci nnamomu m l onge pan icu latu m, second ary metabo lism, suspen sion cu ltu re
Wei Q, Wa ng L, Fu TH, Zhou LJ (20 08). Studies of cell suspen sion culture and ind uction of secondary metabol ism products in Cinna momum
lo nge pani cul atu m. Ch in Bull Bo t 25 , 59 1-59 6.
* Author for correspondence. E-mail: w eiqin2001-67@163.com
(责任编辑: 刘慧君)
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