全 文 ：植物学通报 2006, 23 (4): 363~367
Chinese Bulletin of Botany
收稿日期: 2006-02-10; 接受日期: 2006-04-20
基金项目: 国家自然科学基金(30370127, 30570138)
† 现为香港城市大学理学院本科生, 进行本文工作时为北京四中高中生
* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: mami@ibcas.ac.cn
.实验简报.
砷超富集植物蜈蚣草原生质体的分离及其抗砷性分析
詹宝† 徐文忠 麻密*
(中国科学院植物研究所光合作用与环境分子生理学重点实验室 北京 100093)
摘要 蜈蚣草(Pteris vittata)是一种砷超富集植物, 能够通过根从土壤中吸收砷, 并将其输送至羽叶中富
集。为了探索蜈蚣草单个细胞在砷积累和砷抗性中的特性, 本文首次通过酶解方法获得了这一砷超富集
蕨类植物的原生质体, 并研究了原生质体在不同浓度砷胁迫下的生活力。结果显示, 蜈蚣草原生质体的
抗砷性远高于烟草原生质体的抗砷性, 与其整体植株的抗性一致。这为探索砷抗性和超富集机理提供了
一个新的研究体系。
关键词 蜈蚣草, 原生质体, 抗砷性
Isolation and Analysis for Arsenic Tolerance of Protoplasts from
an Arsenic Hyperaccumulator Pteris vittata
Bao Zhan†, Wenzhong Xu, Mi Ma*
(Key Laboratory of Photosynthesis and Environmental Molecular Physiology, Institute of Botany,
Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093)
Abstract Pteris vittata was the first identified arsenic (As) hyperaccumulator. Because of this
characteristic, it is a good species for studying the acclimatization of plants to environmental stress,
especially research on the mechanism of hyperaccumulation and resistance to As. Besides being able
to absorb As from soil to root, the species also possesses a highly efficient root-to-shoot transport
system for the metalloid, which results in a large ratio of shoot-to-root As concentration. To under-
standing the resistance of the fern cells to As and comparison to other plants that do not possess the
hyperaccumulator characteristics, we studied the conformation of the protoplast and its resistance to
As. Protoplasts of the fern were extracted with use of enzymes. The resistance of the fern protoplast
surpasses that of tobacco; thus, we have revealed a faster system for identifying resistance to
metalloids.
Key words Pteris vittata, protoplast, arsenic resistance
蜈蚣草(Pteris vittata)是世界上发现的第一
种砷超富集植物(hyperaccumulator)(Ma et al.,
2001), 同时也具有耐受和富集锌的特性(陈同斌
等, 2002; An et al., 2006)。由于其对砷的超富
集特性, 蜈蚣草成为研究植物对砷的吸收、转
运和解毒机理的极好的实验材料(何振艳等,
2005)。
大多数植物在砷的胁迫下不能正常生长。
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然而有些植物在长期的进化过程中形成一些机
制以适应环境。蜈蚣草便是生长在砷污染胁
迫环境中的优势种。在蜈蚣草羽叶中, 砷的浓
度可以达到5 070 mg.kg-1(陈同斌等, 2002)。蜈
蚣草地上部分中的砷含量远远高于大多数普通
植物(<10 mg.kg-1)(Matschullat, 2000)。作为砷
超富集植物, 蜈蚣草对砷也具有很强的抗性, 当
其羽叶中砷浓度达到7 000～10 000 mg.kg-1时
依然能正常生长(Lombi et al., 2002; Tu and Ma,
2002; Wang et al., 2002)。最近的研究表明, 蜈
蚣草的配子体也可以在含8 480 mg.kg-1砷酸盐
的培养液中正常生长, 配子体内砷的积累可占其
干重的2.5%(Gumaelius et al., 2004)。无论在孢
子体时期还是在配子体时期蜈蚣草均表现出对
砷的高抗性和超富集能力。那么, 作为生命活
动基本单位的细胞对砷胁迫反应是否与整体植
株存在一致性, 即蜈蚣草羽叶单个细胞或原生
质体是否具有对重金属砷的高耐受性？本文首
先摸索出解离蜈蚣草原生质体的有效方法, 然后
以烟草原生质体作为对照, 对蜈蚣草原生质体的
抗砷性进行了初步分析。
1 材料与方法
1.1 材料
蜈蚣草(Pteris vittata)采自我国湖北和湖南
砷污染矿区, 移栽于温室中培养。收获成熟的
孢子经表面消毒后在 1/2 MS培养基中直接萌
发, 获得组培原叶体和组培配子体。烟草
(Nicotiana tobacum cv Wisconsin 38), 以组织
培养的烟草叶片作为原生质体分离的材料。
1.2 方法
1.2.1 蜈蚣草原生质体的分离 设计不同的
酶液组合。分别在缓冲液(0.6 mol.L-1甘露醇,
10 mmol.L-1CaCl2, 0.75 mmol.L-1 KH2PO4, 25
mmol.L-1 MES的水溶液, pH=5.6)(孙勇如和安锡
培, 1991)中加入不同组合的酶, 包括纤维素酶
(onozuka R-10)、果胶酶(pectolyase Y-23)、蜗
牛酶(snailase)、崩溃酶(driselase)、离析酶
(macerozyme R-10)等。用刀片将蜈蚣草羽叶或
原叶体材料切成宽度约为1 mm的小片, 加入2
mL酶解液, 放置在30℃的培养箱中静置, 3～4
小时后用光学倒置显微镜观察酶解效果。将
酶解产物用200目的滤网过滤, 然后将滤液倒入
离心管中, 以120 g的转速离心3分钟, 除去上
清液; 再用缓冲液洗涤原生质体2次, 离心后除
去上清液; 最后加入2 mL缓冲液悬浮原生质体。
在光学倒置显微镜下观察统计, 并收集备用。
1.2.2 烟草原生质体的分离 在1.2.1节所述
缓冲液中加入纤维素酶(onozuka R-10)至 2%、
果胶酶(pectolyase Y-23)至 0.5%。将在无菌条
件下撕去下表皮的烟草叶片置于上述酶解液中,
在30℃的培养箱中静置3～4 小时。按1.2.1节
所述方法收集烟草原生质体。
1.2.3 蜈蚣草与烟草原生质体耐砷性的比
较 以NaAsO2作为砷胁迫处理, 将1.2.1和1.
2.2节中获得的蜈蚣草和烟草原生质体溶液各
分为 4组, 分别以不同浓度的NaAsO2进行处
理。其中NaAsO2的浓度分别为: (1) 0 mol.L-1;
(2) 0.67 mmol.L-1 ; (3) 3.33 mmol.L-1; (4) 6.67
mmol.L-1 。室温处理 25 分钟之后, 从每份溶
液中取出9.5 mL, 以FDA(fluorescein diacetate)
荧光染色法鉴定蜈蚣草和烟草原生质体的活力
(Widholm, 1972)。将FDA溶解在DMSO中, 母
液浓度为0.1%, 使用时稀释至0.01%。在9.5 mL
的上述原生质体溶液中加入FDA染料0.5 mL,
置于载玻片上, 使用 Carl Zeiss荧光显微镜
(Axioskop 40)进行观察, 激发波波长为490 nm。
发绿色荧光的为有生活力的细胞, 不发绿色荧
光的为无生活力的细胞。每个处理设置3个重
复, 细胞活力计数取平均值。
2 结果与分析
2.1 原生质体分离
2.1.1 蜈蚣草原生质体的分离 为了获得尽
可能多的原生质体, 我们尝试用不同种类和不同
浓度的酶对不同的蜈蚣草材料进行酶解, 设计出
3652006 詹宝 等: 砷超富集植物蜈蚣草原生质体的分离及其抗砷性分析
了分别针对蜈蚣草野生孢子体、组培孢子体
和组培原叶体的不同酶解组合, 并得出显微镜观
察的分离结果(表 1)。
从表 1中可以看出, 蜈蚣草组培原叶体较
野生孢子体和组培孢子体更易被酶解从而获得
原生质体。对野生孢子体羽叶所采用的 18种
不同组合的酶解液, 最有效的为2%的纤维素酶
加0.5%的果胶酶, 但也只可以获得约10个 /mL
原生质体。而采用组培原叶体经 3%纤维素
酶、2%果胶酶、1%蜗牛酶和 0.5%崩溃酶的
酶解, 可以获得 2× 105个 /mL原生质体。根
据各种酶解组合的实验结果, 确定出Y组为最
佳的分离蜈蚣草原生质体的条件。
2.1.2 烟草原生质体的分离 烟草原生质体
的分离如材料与方法所述, 经用光学倒置显微镜
观察并统计, 得到的原生质体约为2×106个/mL。
2.2 蜈蚣草与烟草原生质体耐砷性比较
将分离得到的蜈蚣草原生质体用不同浓度
的NaAsO2溶液处理, 25 分钟后, 应用 FDA荧
光染色法进行原生质体活力鉴定(图 1)。其中
发绿色荧光的为有生活力的, 不发绿色荧光的为
无活力的。图1显示经0.67 mmol.L-1 NaAsO2
溶液处理后对蜈蚣草原生质体进行的 FDA荧
光染色的活力鉴定。
在荧光显微镜下观察发现, 未加砷处理组
的蜈蚣草原生质体存活率为67%, 相同条件下处
理分离得到的烟草原生质体存活率为81%。蜈
蚣草原生质体的存活率在NaAsO2胁迫下缓慢
表 1 不同酶解组合分离蜈蚣草原生质体
Table 1 Isolation of protoplast from Pteris vittata by the combination of different enzymes
No. Source of Enzyme and concentration (%) Protoplast
leaves Onozuka Pectolyase Macerozyme Snailase Driselase (Number.mL-1)
R-10 Y-23 R-10
A Sporophyte 0.2 0.03 1
B Sporophyte 0.23 0.033 2-3
C Sporophyte 0.33 0.05 2-3
D Sporophyte 0.33 0.083 2-3
E Sporophyte 0.4 0.06 3
F Sporophyte 0.5 0.075 3
G Sporophyte 0.5 0.2 3
H Sporophyte 0.67 0.1 3
I Sporophyte 0.67 0.167 3
J Sporophyte 1 0.3 5-6
K Sporophyte 2 0.3 5-6
L Sporophyte 2 0.4 5-6
M Sporophyte 2 0.5 10
N Sporophyte 2 1 5-6
O Sporophyte 0.67 0.33 5-6
P Sporophyte 1 0.5 5-6
Q Sporophyte 2 1 5-6
R Cultured sporophyte 2 1 7-8
S Cultured sporophyte 4 2 0
T Cultured gametophyte 2 0.5 5
U Cultured gametophyte 1 0
V Cultured gametophyte 1 0
W Cultured gametophyte 2 1 1 0.5 103
X Cultured gametophyte 2 0.5 1 1 1 3× 103
Y Cultured gametophyte 3 2 1 0.5 2× 105
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下降。当NaAsO2浓度为 0.67 mmol.L-1时, 其
存活率为50%; 当NaAsO2浓度达到6.67 mmol.
L-1时, 原生质体存活率为 27%。然而当烟草
原生质体暴露于0.67 mmol.L-1 NaAsO2胁迫
下时, 其生活力快速下降, 存活率降为32%, 随
着NaAsO2浓度的提高, 烟草原生质体不断下
降, 当NaAsO2浓度达到6.67 mmol.L-1时, 存
活率仅为 10%。蜈蚣草和烟草原生质体活力
鉴定存活率统计结果如图 2。这些结果显示,
来自蜈蚣草原叶体的原生质体或单细胞能够耐
受砷胁迫。
3 讨论
蜈蚣草是一种蕨类植物, 其细胞壁成分尚
不清楚, 关于蜈蚣草原生质体的分离目前尚未见
报道。本文尝试分别以蜈蚣草野生孢子体、
组培孢子体和组培原叶体为材料, 设计不同种
类和不同浓度的酶组合, 其中Y组合可得到较
多数量的蜈蚣草原生质体。相对于一种酶单
独使用或纤维素酶和果胶酶的简单组合, 本文采
用的 3%纤维素酶、2%果胶酶、1%蜗牛酶
和0.5%崩溃酶的组合酶液对凤尾蕨属植物蜈
图 2 不同浓度砷胁迫下蜈蚣草与烟草原生质体生活力的比较
Fig. 2 The comparison of As tolerance in protoplasts of Pteris vittata and Nicotiana tabacum
图 1 蜈蚣草原生质体 FDA荧光染色的活力鉴定
A. 可见光成像; B. 荧光(490 nm)成像
Fig. 1 Determination of protoplast viabilities using FDA staining
A. Protoplasts under white light; B. Protoplasts under fluorescent light (490 nm)
3672006 詹宝 等: 砷超富集植物蜈蚣草原生质体的分离及其抗砷性分析
蚣草更为有效。在分离蜈蚣草原生质体的过
程中, 酶解时间以3～4 小时为佳, 时间过短原生
质体不能充分解离, 时间过长则崩溃酶会对已分
离的原生质体产生破坏作用。含有离析酶或高
浓度的崩溃酶的组合会产生很多原生质体碎片,
可能它们会使原生质体降解, 因此不宜采用。
尽管蜈蚣草的酶解效率明显低于烟草, 但
通过统计仍然可以看出, 蜈蚣草原生质体的耐砷
性远强于烟草原生质体。其中烟草原生质体
在0.67 mmol.L-1砷胁迫下其存活率尚不及蜈蚣
草在 3.33 mmol.L-1砷胁迫下的存活率。在研
究者多关注蜈蚣草整体植株的砷超富集和耐砷
特性时, 本文证实蜈蚣草单个细胞的原生质体同
样具备抗砷特性, 这暗示蜈蚣草细胞中存在某种
机制可以使其降低砷的毒害。
目前已知的大多数天然重金属超富集植物
通常生物量不够大、适生性不强且只能富集
某种重金属, 因而难以直接用于环境污染的修复
(Salt et al., 1998)。植物修复技术的长远发展,
有赖于对超富集植物抗性和富集机制的研究,
以及通过分子设计和基因改良研发用于重金属
污染修复的工程植物。目前蜈蚣草的遗传转
化系统尚未建立。蜈蚣草原生质体的获得及
其细胞水平抗砷性的证实, 为研究植物细胞对砷
跨膜运输、胞内转运和解毒机理提供了一个
新的研究系统, 其优点在于可以通过瞬间表达
研究砷积累或解毒相关基因的表达定位, 特别是
在砷的荧光标记技术成熟后, 可利用该系统观察
和追踪砷在细胞内的转运过程及其与相关基因
表达的关系。
致谢 感谢中国科学院地理科学与资源研究所陈
同斌研究员和北京四中李京燕老师对本研究的帮
助。
参考文献
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(责任编辑: 白羽红)