全 文 ：植物学通报 2004, 21 (5): 547~555
Chinese Bulletin of Botany
①国家自然科学基金资助项目(批准号 39870073)。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: rlyou@pku.edu.cn
收稿日期：2004-02-25 接受日期：2004-06-16 责任编辑：孙冬花
应用 Steedmans wax 切片法观察植物
细胞微管骨架①
1,2何 群 1尤瑞麟②
1 (北京大学生命科学学院 北京 100871)
2 (哈尔滨大学生命科学与化学学院 哈尔滨 150086)
摘要 微管骨架在植物发育过程中起重要作用。由于植物细胞的特殊性，与动物细胞相比植物微管骨
架的研究遇到更多的困难。简略地介绍了曾被国内外学者应用的植物微管骨架的各种研究方法及其局限
性。Steedmans wax是一种多脂蜡。它熔点低 (35~37℃)，具有与石蜡相同的切片性质,能够切成不同厚
度的连续切片，适合深埋于器官内部的组织或细胞的免疫细胞化学研究。介绍了应用Steedmans wax 切
片法观察植物细胞微管骨架的一般程序和方法以及经过作者检验且切实可行的一些技术改进。
关键词 Steedmans wax, 植物细胞, 微管骨架
Steedmans Wax Sectioning for Observation of the Microtubule
Cytoskeleton in Plant Cells
1,2HE Qun 1YOU Rui-Lin②
1 (College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871)
2 (College of Life and Chemistry Sciences, Harbin University, Harbin 150086)
Abstract As one of the major components of the cytoskeleton, the microtubule cytoskeleton plays
an important role in plant development. The present paper gives a brief introduction on the tech-
niques widely applied in this field and their limitations, and recommends a method, a low melting
polyester wax (steedmans wax) as an embedding medium for the investigation of the microtubule
cytoskeleton with immuno-cytochemistry. Its low melt point (35-37℃) makes it favorable for keeping
the antigenicity. Chlorophyll is extracted in the process of infiltration so that the interference of
intense autofluorescence from chloroplasts decreases. Steedmans wax has similar characters with
paraffin, being able to cut into ribbon-sections of different thickness, which is beneficial both to
antibody penetration because of the breaking of cell wall and to the observation of successive focal
planes (in ribbon-sections) with confocal laser scanning microscopy. General procedures of Steedmans
wax sectioning and some practical improvements were also discussed in the present paper.
Key words Steedmans wax, Plant cells, Microtubule cytoskeleton
技术与方法
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细胞骨架在植物发育过程中起着相当重要的作用, 而微管骨架又是细胞骨架的主要成分之
一。由于植物细胞的特殊性— — 具有细胞壁和可以发出强烈荧光的叶绿素, 与动物细胞比，植
物细胞骨架的研究遇到更多的困难。经过很多研究者的努力，已经取得不少进展。观察植物
细胞微管骨架的结构和功能可以选用几种不同的方法，这主要取决于需要解决的问题而定。
1 植物细胞微管骨架研究方法
1.1 概述
早期对微管骨架的研究主要采用透射电镜技术(Pickett-Heaps and Northcote, 1966a; 1966b;
Gunning et al., 1978)。尽管他们观察到了很多新结构(如早前期微管带)，也描述了很多新现象
(如染色体的着丝粒结构域等)，但由于电镜样品制备困难，所观察样品的大小和数量受到限
制，因此难于对细胞中微管骨架的空间分布进行观察。同时，应用电子显微镜对完整组织和
器官中微管骨架进行观察几乎是不可能的。Franke等(1977)首先将动物细胞中广泛应用的间接
免疫荧光标记技术引入植物细胞研究，观察微管骨架，证明了在缺少壁的胚乳细胞中,有丝分
裂器能够被抗微管蛋白的抗体标记。随后，这项技术在具壁的植物细胞(Lloyd et al., 1979; 1980)
和化学固定的植物细胞(Wick et al., 1981)中得到广泛的应用，所获得的大量研究成果使我们对
植物细胞中微管骨架的结构和功能有了更全面和深入的认识(Lloyd, 1987; 1991; Cyr, 1994; Cyr and
Palevitz, 1995; 澂徐是雄和朱 ,1996; Vaughn and Harper, 1998; Kumagai and Hasezawa, 2001)。
与电子显微镜仅从二维结构水平展示细胞中微管骨架的分布相比，荧光显微镜能够在三维
结构水平上展现整个细胞中微管骨架组织的分布(Lloyd, 1987; Hepler and Gunning, 1998)。然而,
无论是电子显微镜还是荧光显微镜都需要对植物细胞进行固定(化学固定或物理固定)，这样就
阻断了微管骨架从一种列阵向另一种列阵转变的动态过程。因此，人们对活细胞微管列阵怎
样从一种组织状态转变为另一种组织状态知之甚少(Marc et al., 1998; Granger and Cyr, 2000; 2001)。
为了了解生活细胞中微管骨架的组织和变化情况，近年来有的学者通过向生活的植物细胞中显
微注射荧光标记的微管蛋白(Yuan et al., 1994; Hepler and Gunning, 1998)的方法,来观察细胞中微
管骨架的分布及动态变化过程。荧光标记的微管蛋白(tubulin)进入植物细胞后，与细胞内源微
管蛋白共同参与微管列阵的构成和变化(Hepler et al., 1993; Lloyd, 1994; Hepler and Hush, 1996)，
由此标记到了植物细胞中所有已知的微管列阵，如早前期微管带、纺锤体、成膜体(Zhang et
al., 1990; 1993; Cleary et al.,1992)和周质微管(Wasteneys et al., 1993; Yuan et al., 1994; 1995; Hush
and Overall, 1996; Lloyd et al., 1996; Wymer and Lloyd, 1996)。近年来，由于分子生物学技术的
广泛使用，通过转基因植物表达GFP融合蛋白的方法能够对活细胞中微管骨架的构成和动态变
化进行直接观察(Marc et al., 1998; Ueda et al., 1999; Hasezawa et al., 2000; Mathur and Chua, 2000;
Granger and Cyr, 2000; 2001)，实践证明此方法极具发展前途。
尽管GFP技术和显微注射技术有了很大的进展，但这些方法也仅限于在悬浮培养细胞和植
物体表面的细胞中使用(Marc et al., 1998; Ueda et al., 1999; Mathur and Chua, 2000; Granger
and Cyr, 2000; 2001)。在组织水平，尤其是对深埋在大器官中的组织或细胞进行细胞骨架
研究，仍然要使用固定的植物组织材料，所以标准的固定和切片技术仍然是研究植物细胞
骨架的重要工具(Brown and Lemmon, 1995; Blancaflor and Hasenstein, 2000; Sugimoto et al., 2000;
Vitha et al., 2000)。
5492004 何 群等：应用 Steedmans wax 切片法观察植物细胞微管骨架
1.2 固定和包埋方法
1.2.1 固定剂 甲醛是光镜水平下间接免疫荧光标记所使用的最好的固定剂，它能快速渗透
进组织，但交联能力有限。戊二醛是较强的交联剂，但穿透较慢，还能诱发组织的自发荧
光, 因而影响戊二醛在免疫荧光标记中的应用(Vitha et al., 2000)。快速冷冻和随后的冷冻替代
(freeze-substitution, further referred to as cryofixation)是一个代替化学固定的好方法(Baskin et al.,
1996; Roy et al., 1997)。冷冻固定(cryofixation)是一个快速的过程，可以防止化学固定中可能
产生的假象，同时，也能很好地保存抗原决定基(epitope)。然而，对于大的植物组织和器官
这种固定方法不太适用，原因是可能引起组织内的冰晶损伤(Vitha et al., 2000)。
1.2.2 包埋剂 包埋介质的选择对于免疫染色的成功与否至关重要。石蜡(paraffin wax)不适合
微管的免疫荧光检测，因为它相对较高的熔点破坏了微管骨架的结构，并使很多非免疫反应
的蛋白染色(Vitha et al., 2000)。异丁烯酸树脂(methacrylate-based resins)是一种在免疫细胞化学
中广泛使用的包埋介质(Baskin et al., 1992; Hoffman and Vaughn, 1995; Bulbert et al., 1998; Zee and
Ye, 2000)，尽管它能很好地保存植物组织的结构，但微管蛋白抗原性的保存不很理想，因为
在随后去除树脂时使用的有机溶剂破坏了部分蛋白的抗原性，此外，只有几微米的切片厚度
也限制了对微管整体空间结构的观察。其他包埋介质，如聚乙二醇(polyethylene glycol)和丁
基异丁烯酸甲脂(butyl-methykmethacrylate)等都存在切片厚度太薄的问题。最近应用的冷冻切片
法(cryosectioning)能够很好的保存微管的抗原性，但对设备水平要求较高，应用受到限制。
Steedman (1957)在《Nature》上介绍了一种切片时能形成连续带的新型包埋剂——低熔点
多脂蜡(现称Steedmans wax)，其熔点为35~37℃,能溶于乙醇中，具有与石蜡相同的切片性质。
尽管Steedmans wax绝不会代替石蜡作常规组织学切片，但它在免疫细胞化学上的优越性很早
就被发现了(Vitha et al., 2000)。在植物组织中,Steedmans wax非常适合细胞骨架的免疫荧光检
测(Brown et al., 1989; Baluska et al., 1992; Brown and Lemmon, 1995; Vitha et al., 2000)。因此，
Steedmans wax是免疫染色前需要切片的植物材料的一种很好的包埋介质(Brown et al., 1989)。
由于大多数植物配子发生和分化都是深埋在大的器官或组织中进行的，要研究它们发育过
程中细胞骨架的变化，用分离细胞法、活体切片法以及活体观察法都很难实现。这也是为什
么大孢子发生和胚囊发育过程中的细胞骨架只在少数几种植物——脂麻掌(Gasteria verrucosa)，
柳兰(Chamaenerion angustifolium)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中有系统研究的原因(胡适宜,
1996)。为解决这一难题，本实验选用了粗茎鳞毛蕨的配子体作实验材料，因为它的结构比种
子植物的相对简单，并且其精子器、颈卵器及其雌、雄配子的发生和分化过程是在其他营养
细胞的包围中实现的。鉴于上述原因，选择固定后切片法是一个最佳方案。以下我们将结合
自己的经验介绍应用Steedmans wax切片法观察植物细胞微管骨架的实验程序。
2 Steedmans wax法实验程序
2.1 实验材料
本文以带有不同发育阶段颈卵器和精子器的粗茎鳞毛蕨(Dryopteris crassirhizoma Nakai)的
成熟配子体为例说明实验程序和操作流程。
2.2 试剂的配制
0.1 mol.L-1微管稳定磷酸钠缓冲液(pH 7.0)配制方法: 先配制 0.2 mol.L-1的两种母液。溶
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液A含 27.6 g NaH2PO4.H2O.L-1，溶液 B含 53.65 g Na2HPO4.7H2O.L-1，存贮于冰箱中。然
后将溶液A 39.0 mL，溶液B 61.0 mL, DMSO 2 mL, EGTA 0.38 g (5 mmol.L-1), PMSF 0.017 g (0.5
mmol.L-1)混合成使用液, 用水(dd H2O)定容到200 mL。
8%多聚甲醛: 免疫细胞化学上常用的浓度多在4%以下，经过试验发现固定粗茎鳞毛蕨配
子体以8%, 再加入0.2%苦味酸为好。固定液现用现配,用0.1 mol.L-1微管稳定磷酸钠缓冲液(pH
7.0)加热(60℃)配制。
用NaCl 7.9 g, KCl 1.8 g, Na2HPO4 1.4 g, KH2PO4, 0.2 g配制PBS缓冲液(pH 7.2)，加ddH2O定
容到 1 000 mL。
Steedmans wax的配制(Brown and Lemmon, 1995): 按9:1称取180 g的Polyethylene glycol (PEG)
400 distearate(Aldrich，cat.#30541-3)和 20 g的 1-hexadecanol (Aldrich，cat.#25874-1 )颗粒，放
入一个500 mL的塑料广口瓶中，在40℃的温箱或水浴锅中熔化，充分混匀后放入温箱中备用，
在室温下保存。
蛋白胶(mayers albumen adhesive)粘贴剂：取一只 100 mL的量筒，注入 50 mL新鲜的鸡
蛋清，加入 50 mL甘油(防干燥剂)，再加入 0.1 g麝香草酚(防腐剂)后用力摇荡，放置片刻使
泡沫浮到表面，双层纱布过滤除去泡沫后装瓶备用。这种粘贴剂可用1~2个月(李正理, 1978)，
放入冰箱在4℃下可延长使用期。根据作者的经验，这种蛋白胶粘贴效果与国内外推荐的多聚
赖氨酸粘贴剂相比毫不逊色。
1% BSA/PBS：1%(W/V)PBS缓冲液(pH 7.2)配制的牛血清蛋白(bovine serum albumin)。
一抗(primary antibody)和二抗(secondary antibody): PBS缓冲液1:500稀释的抗a-微管蛋白
的鼠 IgG单克隆抗体(一抗)和PBS缓冲液1:80稀释的FITC结合的羊抗鼠 IgG(二抗)。
抗荧光衰退封片剂(anti-fade mounting medium): 取50 mL PBS缓冲液(按上述PBS缓冲液配
方, 但不加KH2PO4, pH 8.5), 加50 mL甘油和3 g 正 -丙基 -没食子酸 (n-propyl gallate)。
2.3 配子体组织切片的免疫荧光标记
材料的固定：先将配子体放在 0.1% Tween 20(0.1 mol.L-1磷酸钠缓冲液配制，pH 7.0)中
湿润5~10 min，然后取出用8%多聚甲醛+0.2%苦味酸(0.1 mol.L-1微管稳定磷酸钠缓冲液配制，
pH 7.0)室温下固定 30 min~1 h。配子体放入固定液后立即抽气，使固定液迅速进入细胞，防
止微管蛋白在短时间内解聚。
洗涤、浮染和脱水：用含 1 mmol.L-1二硫苏糖醇的缓冲液洗固定后的配子体 3次，每次
10 min。接着在 1%酸性品红浮染配子体 15~45 min，沿上升梯度在酒精中脱水(15%、30%、
50%、70%和 90%，每级各 20 min; 100%中 3次, 1 h/次)。
渗蜡：将Steedmans wax倒入相同体积的纯酒精(含有材料)中(蜡占50%), 在37℃条件下渗
透1 h后吸掉一半体积的混合物，再加入相同体积的纯蜡(蜡占75%)继续渗透1 h,然后将材料转
入纯蜡中继续渗透，中间换两次纯蜡，每次间隔时间为 1 h。
包埋：渗透完成后，将材料转入装有纯蜡的电镜包埋模具中，用一盏台灯保持模具内的
蜡刚刚处于融化状态，在解剖镜下按所需要的切面确定材料的方向，然后放在室温下冷却。
与石蜡一样，Steedmans wax可以回收再利用，不仅纯蜡可以回收利用，混有酒精的蜡也
可以回收；放在温箱中酒精逐渐挥发最后可以得到纯蜡。作者用回收的低熔点石蜡渗透和包
埋未见不良影响。
5512004 何 群等：应用 Steedmans wax 切片法观察植物细胞微管骨架
切片：切片方法与石蜡切片相同。切片厚度根据细胞的大小和样品自发荧光的强弱来确
定。带有颈卵器的配子体一般切 15~20 mm厚。
粘片：将新盖玻片放到洗液中浸泡 24 h。洗净后放到 70%酒精中，使用前将擦净的盖玻
片经过纯酒精去除表面的脂类物质，晾干后放入盒中备用。切片前，用配制好的蛋白胶在盖
玻片表面涂一薄层，晾干后使用(注意防尘)。将蜡带平滑发光的一面朝下放到在涂有蛋白胶的
盖玻片上，按顺序排好，小心地加一至数滴水，待切片自然展开后将多余的水吸去。放入
30℃温箱中烤片 24 h。
脱蜡: 将粘有蜡带的盖玻片放入装有纯酒精的培养皿中1~4 h(中间换两次)可将蜡片上的蜡全
部脱掉。注意保证乙醇中绝对无水，任何一点水都可能使切片上留有蜡的残迹。
抽提、封闭和洗涤：室温下在 1% Triton X-100抽提 5~15 min，然后转入 1%BSA中室温
下封闭 20 min；最后在 PBS中洗 3次，各 5 min。
37℃下在一抗中孵育 4 h或室温下过夜；然后在 PBS中洗 3次，各 5 min。
37℃下在二抗孵育 1.5 h；然后在 PBS中洗 3次，各 5 min。
碘化丙锭 (propidium iodide, PI)染细胞核，蒸馏水洗 5 min。
封片：取干净的载玻片，在其上加一滴封片剂，然后将带有切片的盖玻片翻转过来，盖
到液滴上，吸去多余的封片剂后用指甲油将盖玻片的四周封固，尽快镜检。在 4℃可保存数
日，在-20℃下可保存 3~4星期；逾期荧光将大为减退。
对照组的实验流程与上述实验相同，只是①省去一抗；②省去二抗；③省去一抗和二抗。
2.4 图像的观察及处理
2.4.1 共聚焦激光扫描显微镜观察 免疫标记的装片先在落射式荧光显微镜，蓝光激发下快
速镜检，微管标记者呈绿色荧光。标记理想且典型的装片用Bio-Rad 公司MRC1024型共聚焦
激光扫描显微镜采集图像，以氩 -氪激光(krypton-argonm)为激光光源，激发光为 488 nm
(FITC)。所用的共聚焦激光扫描显微镜上的荧光显微镜的型号为Olympus BH-2，物镜镜头为
Planapo 40倍油浸镜头，数值孔径为 1.0。光学切片时，Olympus荧光显微镜的微调由 CLSM
软件所控制，光切片步距为 0.3~0.8 mm，图像采集为 512×512像素。
2.4.2 图像的后期处理及打印 图像后期处理时采用 photoshop 6.0软件进行编辑排版；高分
辨率打印机(如Canon BJC-8200)打印。
3 总结和展望
植物细胞骨架的研究，虽然起步较晚，但由于植物细胞骨架的结构和成分与动物细胞基
本上是一致的，因此研究进展也很迅速。由于花粉管便于培养和操作，成为研究植物细胞骨
架的模式材料，对植物细胞骨架的研究起了重要的推动作用，自 20世纪 80年代至 90年代中
期，形成了花粉及花粉管细胞骨架的研究高潮(Pierson and Cresti, 1992; Palevitz and Teizzi, 1992;
Li et al.,1997; 澂朱 和徐是雄, 2002)。但由于植物细胞的多样性和特殊性，其细胞骨架的研究
还不够广泛，而且其进展一直不顺利。植物细胞壁的障碍使标记的抗体难于渗入; 大液泡的存
在也给固定增添了麻烦；叶绿体的自发荧光更干扰了对标记的微管荧光的观察。因此长期以
来植物细胞骨架的研究成果一直不稳定，常因植物种类而异。尤其在大孢子发生和胚囊发育
过程中细胞骨架的研究上，都远比小孢子在这方面的研究少(胡适宜, 1996)。大孢子发生和胚
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囊的发育过程是在雌蕊和胚珠包被的组织中进行，研究这一过程的微管骨架较雄性细胞的难度
大得多，因此，只有少数的研究把微管的分布和细胞形态变化，特别是核的移动和定位与微
管联系在一起(Cass et al., 1985; Huang and Sheridan, 1994; Webb and Gunning, 1994; 胡适宜, 1996;
黄炳权, 2002 )。目前，细胞骨架在植物受精过程中的研究很少，还不能总结出一般性规律，
根本原因在于未获得研究大孢子发生和胚囊发育过程中细胞骨架的便利、可靠和稳定的方法。
图 1 用 Steedmans wax切片法结合间接免疫荧光标记的粗茎鳞毛蕨(Dryopteris crassirhizoma Nakai)配子体细胞
在共聚焦激光扫描显微镜下的图像 A, B. 显示配子体大型液泡化细胞中不同排列方向的周质微管列阵, B左下角
细胞中的黑洞为细胞核所在的位置，Bar=20 mm; C, D. 为共聚焦激光扫描显微镜下精母细胞不同光切面的相片。
每个精母细胞中已经存在两个生毛体(图中明亮的荧光球状结构,箭头所示)，并开始组织包围细胞核的微管，
Bar=10 mm。
Fig. 1 Photographs of gametophytic cels of Dryopteris crassirhizoma based on Steedmans wax sectioning coupled
with indirect immunofluorescence labeling and confocal laser scanning microscopy, showing the microtubule cytosk-
eleton A, B. The cortical microtubule array of large vacuolated cells in different arrangement. The black cavity at
the lower-left corner in B was the position of the nucleus. Bar=20 mm; C, D. Presented photographs of spermatocytes
at different optical sections. Note that in each spermatocyte two blepharoplasts (bright fluorescent globule-like
structures, indicated with arrowheads) occurred which started the organization of the microtubule array encircling the
nucleus. Bar = 10 mm
5532004 何 群等：应用 Steedmans wax 切片法观察植物细胞微管骨架
作者利用Steedmans wax包埋法结合间接免疫荧光标记技术和共聚焦激光扫描显微技术对
粗茎鳞毛蕨雌、雄配子发生和发育过程中微管骨架的组织和功能进行研究，取得了很好的结
果(图 1, A~D)。这种优化方法可能有助于我们进一步研究大孢子发生、胚囊发育以及受精过
程中细胞骨架动态。将这一方便、可靠且稳定的方法再加以检验和改进并应用于被子植物的
研究中将加速我们对植物受精作用这一十分复杂的生物学现象的认识。
参 考 文 献
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徐是雄，朱徵主编, 1996. 植物细胞骨架. 北京: 科学出版社
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