全 文 ：第26卷 第11期
2014年11月
Vol. 26, No. 11
Nov., 2014
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
网络出版时间：2014-10-20 16:55
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/31.1600.Q.20141020.1655.002.html
文章编号：1004-0374(2014)11-1229-07
DOI: 10.13376/j.cbls/2014174
收稿日期：2014-07-15； 修回日期：2014-09-23
基金项目：国家自然科学基金项目(31272685)；福建
省自然科学基金项目(2012J01140)
*通信作者：E-mail: linpeng@jmu.edu.cn
时间分辨荧光免疫分析在兽药残留检测中的应用
顾宏杰，郭松林，王艺磊，冯建军，林　鹏*
(集美大学水产学院，农业部东海海水健康养殖重点实验室，厦门 361021)
摘　要：近年来，兽药残留引起食物中毒的报道日益增多，兽药残留检测的意义重大。传统的气相色谱法、
液相色谱法存在前处理复杂、仪器成本昂贵等缺陷，酶联免疫吸附分析 (enzyme-linked immunosorbent assay,
ELISA)灵敏度也不高，而时间分辨荧光免疫分析 (time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)操作简便、灵敏
度高，已在兽药残留检测领域引起重视。介绍了 TRFIA的原理和优势，综述了其在促生长繁殖类、瘦肉增
产类和杀菌驱虫类兽药残留检测中的应用，并与传统方法进行了对比，TRFIA有望取代传统的检测方法成
为兽药残留检测的常规方法。
关键词：时间分辨荧光免疫分析；兽药残留；检测
中图分类号：S859.84 文献标志码：A
Application of time-resolved fluoroimmunoassay
in detection of veterinary drug residues
GU Hong-Jie, GUO Song-Lin, WANG Yi-Lei, FENG Jian-Jun, LIN Peng*
(The Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea, Ministry of Agriculture,
Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China)
Abstract: In recent years, more and more cases of food poisoning caused by veterinary drug residues are reported.
The detection of veterinary drug residues is significant. In traditional detections such as gas chromatography and
liquid chromatography, the pretreatment is fussy and the instrument is expensive. The sensitivity of enzyme-linked
immunosorbent assay is low. The time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA) is easy to operate with high
sensitivity. The detection for veterinary drug residues by TRFIA has attracted much attention. The principle and
advantages of TRFIA are described in the paper, the application of TRFIA in veterinary drug residues detection is
also summarized. Compared with other traditional detections, TRFIA is likely to become a conventional method for
veterinary drug residues detection.
Key words: time-resolved fluoroimmunoassay; veterinary drug residues; detection
时间分辨荧光免疫分析技术 (time-resolved fluo-
roimmunoassay, TRFIA)[1-2]是 20世纪 80年代发展
起来的一种标记免疫分析技术，该技术采用荧光寿
命长、Stock位移大的稀土离子螯合物作为标记物，
通过时间分辨和波长分辨，能够有效降低背景荧光
的干扰，因此，具有灵敏度高、操作简便、检测材
料易于储备、无放射性污染等优点。目前，TRFIA
在兽药残留检测领域已逐渐引起重视。
1　TRFIA技术原理和优势
TRFIA采用长寿命荧光的稀土离子螯合物对抗
原或抗体进行标记，通过抗原与抗体发生免疫反应
后记录并分析螯合物的荧光信号，对被测物质进行
定性、定量分析。稀土离子螯合物的荧光寿命通常
在 100~1 000 μs之间，而背景荧光寿命在 1~10 ns，
相差 5~6个数量级 [3]。因此，在实际测量中，通过
∙ 技术与应用 ∙
生命科学 第26卷1230
延迟测量时间可有效消除短寿命背景荧光和散射光
对测定的干扰，使非特异性的本底信号降低到可以
忽略的程度，达到极高的信噪比。此外，稀土金属
离子的 Stock位移能够达到 200 nm以上，很容易区
分激发光和发射光，排除激发光的干扰。稀土离子
螯合物的激发光谱范围比较宽，通常在 300~500
nm，可通过增加激发光能量来提高标记物的比活
性，而且发射光谱窄，甚至不到 10 nm，可采用只
允许发射荧光通过的滤光片，进一步降低背景荧光，
大大提高检测灵敏度 [4-5]。与酶联免疫吸附分析法
(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)[6]、放射
性免疫分析法 (radioimmunoassay, RIA)[7]等传统免
疫分析技术相比，TRFIA具有诸多优势：灵敏度高、
稳定性好、克服了酶和放射性物质的不稳定性、动
态范围宽、试剂保存时间长、无放射性危害，等等。
TRFIA是目前公认的灵敏度较高的分析方法。
2　TRFIA在兽药残留检测中的应用
兽药主要指用于家畜、家禽、宠物、野生动物、
水产动物和蚕、蜂等饲养动物的各种药物，对畜牧
业发展有着重要作用，同时与生态环境和人民健康
也密切相关。随着集约化畜牧业的发展，兽药的作
用范围也在不断扩大，用于促进肉用畜禽生长、减
少畜禽发病率和提高饲料利用率的各类兽药层出不
穷。大量滥用的后果是兽药在动物性食品中的残留，
摄入人体后，影响人类健康；另一方面动物粪便、
尿液等排泄物向周围环境排放，兽药又成为环境污
染物，破坏生态环境 [8]。
目前在养殖业中被广泛使用的兽药按其性质作
用可大致分为促生长繁殖类药物、瘦肉增产类药物、
杀菌驱虫类药物 [9-10]，这些药物一旦经人体摄入后
轻则引起过敏反应、干扰人体功能代谢，重则引起
急慢性中毒、致癌、致畸、致突变，危害极大。加
强对兽药残留检测方法的研究意义重大，传统方法
诸如气相色谱法 (gas chromatography, GC)[11]、液相
色谱法 (liquid chromatography, LC)[12] 、ELISA[13]，已
在兽药残留检测领域有所应用。气相色谱法 [14]采
用气体作为流动相携带样品经过色谱柱，在色谱柱
作用下样品各组分发生分离，依次进入检测器，用
数据处理系统收集并处理色谱信号对样品进行定性
定量分析。气相色谱法具有分离效率高、分离速度
快、选择性好、灵敏度较高等优点，但存在气相色
谱仪价格昂贵、样品前处理过程较为复杂、不能用
于分析不挥发物质和热不稳定物质、在定量分析时
常需要用标准样品对信号进行校正等缺点。液相色
谱法 [15]采用单一溶剂或不同比例的混合溶剂作为
流动相，样品由流动相带入色谱柱，在柱内各组分
被分离后，收集并处理色谱信号以对样品进行定性
定量分析。液相色谱法不受试样的挥发性和热稳定
性的限制，应用范围更广，但该法仪器造价及日常
护理费用较高、分析时间较长。ELISA[16]通过酶标
记抗体或抗原，抗体与抗原发生特异性免疫反应后
加入底物，在酶的催化作用下，底物转变为有色产
物，产物的量与样品中被测物质的量直接相关，以
此进行定性定量分析。ELISA操作简便、成本较低、
应用范围较广，但酶为生物活性大分子容易失活不
易保存，还会对免疫反应造成空间位阻效应，灵敏
度也不能满足实际需要。TRFIA不仅具有 ELISA
简便、成本低、应用范围广的优点，而且稀土离子
螯合物较稳定，可以直接测量荧光，且灵敏度高于
ELISA法。因此，TRFIA已在兽药残留检测领域引
起越来越多的关注。
2.1　促生长繁殖类药物的检测
己烯雌酚、甲羟孕酮、折仑诺、黄体酮等激素
类药物作为动物养殖过程中常见的促生长繁殖类药
物，有助于动物卵巢发育，能有效提高动物生产率，
但长期摄入会导致机体代谢紊乱、发育异常 [17]。
Huo等 [18]将羊抗兔二抗包被微孔板，以此间接固
定抗己烯雌醇抗体，采用 Eu3+标记的己烯雌醇与未
标记的己烯雌醇竞争结合一抗，建立竞争体系的
TRFIA对鸡肝样品中的己烯雌醇进行定量分析，灵
敏度达到 0.05 ng/g，样品回收率为 84.2%~109.6%，
相对标准偏差为 8.3%~12.4%。另有报道在 TRFIA
基础上引入生物素 -链霉亲和素系统来对己烯雌醇
进行定量分析，灵敏度为 8.1 × 10-4 ng/mL，样品回
收率为 97.4%~107.8%，相对标准偏差达到 1.32%~4.04%，
灵敏度进一步得到提高 [19]。利用传统方法检测己烯
雌醇的研究也有报道：ELISA[20]灵敏度为 0.0125
ng/mL，相对标准偏差为 1.76%~3.08%；GC[21]灵
敏度为 0.5 ng/g，相对标准偏差为 3.88%~10.36%；
LC[22]灵敏度为 0.1 ng/g，相对标准偏差为 3.7%~6.4%。
TRFIA的研究在新型螯合剂合成方面也有较大进
展，Secundo等 [23]利用自制高荧光产率的铽复合物
标记羊抗兔抗体作为示踪物，抗己烯雌醇多克隆抗
体作为反应抗体，检测牛奶样品中的己烯雌醇，灵
敏度达到 0.5 ng/mL，经进一步验证该复合物稳定
性良好。此外，Hou等 [24]首次报道了 TRFIA检测
猪肉样品中的甲羟孕酮，灵敏度为 0.06 ng/g；利用
顾宏杰，等：时间分辨荧光免疫分析在兽药残留检测中的应用第11期 1231
传统方法检测甲羟孕酮的实验也被研究，ELISA
灵敏度 [25]为 0.08 ng/mL、GC灵敏度 [26]为 1 ng/g、
LC灵敏度 [27]为 0.08 ng/g。TRFIA法检测黄体酮 [28]、
折仑诺 [29]的研究也均有报道。
2.2　瘦肉增产类药物的检测
瘦肉增产类药物主要有莱克多巴胺、盐酸克伦
特罗、沙丁胺醇等药物，能诱导脂肪分解，提高瘦
肉产率，大量进入人体会导致染色体畸变，诱发恶
性肿瘤 [30]。TRFIA检测该类兽药已取得较大进展，
Shi等 [31]将抗盐酸克伦特罗兔抗与卵清蛋白偶联后
作为固定相，Eu3+标记羊抗兔二抗作为示踪物，建
立竞争 TRFIA检测盐酸克伦特罗，该方法灵敏度
为 0.01 ng/mL，检测范围 0.01~25 ng/mL，与其他
同类药物交叉反应率低 (传统方法检测盐酸克伦特
罗结果：ELISA灵敏度为 0.1 ng/g[32]、GC灵敏度为
0.2 ng/mL[33]、LC灵敏度为 0.11 ng/mL[34])；在此基
础上，盐酸克伦特罗的 TRFIA全自动检测方法 [35]
已被成功研制。Bacigalupo等 [36]利用自制 Eu3+、
Tb3+螯合物分别标记羊抗兔抗体和兔抗鼠抗体作为
示踪物，抗氢化可的松多克隆抗体、抗盐酸克伦特
罗单克隆抗体作为反应抗体，分别检测马尿中的氢
化可的松和盐酸克伦特罗，成功采用双标记 TRFIA
同时检测两种药物，经验证该方法同样适用于食品
中盐酸克伦特罗残留检测；另有报道在 TRFIA基
础上采用新型稀土螯合物和生物素 -链霉亲和素系
统来测定盐酸克伦特罗 [37]，检测过程只需 75 min，
且无需加入增强液，步骤简便，是未来兽药临床检
测的发展方向。
TRFIA检测莱克多巴胺也被重点研究，最早的
研究 [38]要追溯到 1996年，但特异性和灵敏度有待
提高，Shen等 [39]首次采用单克隆抗体对莱克多巴
胺进行 TRFIA检测，灵敏度提高到 0.1 ng/g，极大
地改善了 TRFIA对莱克多巴胺的检测。与此同时，
双标记 TRFIA能同时检测两种物质且无互相干扰
的优点受到研究者的青睐，利用该方法同时检测猪
肉组织中的氯霉素和莱克多巴胺 [40]，莱克多巴胺的
检测灵敏度为 0.06 ng/g，优于 ELISA[41] (灵敏度
0.1ng/g)、GC[42] (灵敏度 0.5 ng/g)、LC[43] (灵敏度 0.1
ng/g)等方法的检测结果。国内期刊也对 TRFIA检
测盐酸克伦特罗 [44]、莱克多巴胺 [45]和沙丁胺醇 [46]
进行了较为深入的报道。
2.3　杀菌驱虫类药物的检测
养殖业常用杀菌驱虫类药物主要包括抗生素
类药物、磺胺类药物、喹诺酮类药物，TRFIA、
ELISA、GC、LC检测杀菌驱虫类药物的灵敏度对
比如表 1所示。
常用抗生素类兽药主要有氯霉素、氨苄青霉素、
莫能菌素、甲基盐霉素、土霉素等，均有广谱杀菌
作用，摄入过量会危害人体健康。氯霉素是一种常
用于治疗各种动物传染性疾病的广谱抗生素，同时
它也能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性
贫血症和粒状白细胞缺乏症等疾病，因此，动物
食品中的氯霉素残留对人类的健康构成了潜在的危
害 [78]。国内外学者对 TRFIA检测氯霉素残留开展
了较为深入的研究，王雪 [47]利用间接竞争 TRFIA
检测氯霉素，特异性好，灵敏度远超 ELISA检测，
表1 TRFIA与3种传统方法检测灵敏度对比
名称 TRFIA灵敏度 ELISA灵敏度 GC灵敏度 LC灵敏度
氯霉素 0.008 ng/mL[47] 0.1 ng/mL[48] 0.03 ng/g[49] 1.1 ng/g[50]
0.018 ng/mL[51]
0.05 ng/g[52]
0.04 ng/g[53]
氨苄青霉素 1 ng/mL[54] 4.17 ng/mL[55] -- 0.6 ng/g[56]
莫能菌素 ＜2 ng/g[57] 5 ng/mL[58] -- 1.6 ng/g[59]
甲基盐霉素 0.28 ng/g[60] -- -- 1.6 ng/g[59]
土霉素 0.08 ng/g[61] 16 ng/g[61] -- 13 ng/g[61]
泰乐菌素 0.03 ng/mL[62] 50 ng/mL[63] -- 50 ng/mL[64]
替米考星 0.05 ng/mL[62] 0.09 ng/mL[65] -- 30 ng/g[66]
磺胺嘧啶 0.0054 ng/mL[67] 5 ng/mL[68] 10 ng/mL[69] 10~50 ng/mL[70]
0.02 ng/mL[71]
恩诺沙星 0.01 ng/mL[72] 0.423 ng/mL[73] -- 10 ng/mL[74]
环丙沙星 0.5 ng/mL[75] 2.77 ng/mL[76] -- 10 ng/g[77]
注： --表示尚未有文献具体报道
生命科学 第26卷1232
具有很好的应用前景；张艺等 [51]采用基于生物素 -
链霉亲和素的 TRFIA对氯霉素进行检测，以链霉
亲和素包被 96孔板，生物素标记的氯霉素与游离
氯霉素竞争限量的抗氯霉素多克隆抗体，铕标记的
羊抗兔抗体作为示踪物，该方法特异性好、操作简
便、适于大样本筛查，虽然灵敏度略低于前者，但
首次在 TRFIA基础上引入生物素 -链霉亲和素系统
检测氯霉素，为临床检测微量氯霉素残留提供了新
方法、新思路。此外，Shen等 [52]、Li等 [53]分别采
用直接竞争 TRFIA对鸡肉样品、水产动物样品中
残留氯霉素进行检测。前者采用固相抗原与游离抗
原竞争结合标记抗体，后者采用游离抗原与标记抗
原竞争结合固相抗体，均取得较好的实验结果，特
异性好、步骤简便，灵敏度均优于 LC检测结果 [50]，
但略低于 GC检测结果 [49]。氨苄青霉素对革兰氏
阳性菌和革兰氏阴性菌均有较强的抗菌作用，但不
合理使用能够诱导耐药菌株产生，引起人体过敏反
应 [79]；Bacigalupo等 [54]通过建立间接竞争 TRFIA
对牛奶样品中的氨苄青霉素进行定量分析，灵敏度
明显高于 ELISA，大大超出欧盟标准，为 TRFIA
检测氨苄青霉素提供了理论依据。莫能菌素常用作
饲料添加剂来预防家禽球虫病，过量使用会对人体
产生毒害作用 [80]；利用 TRFIA检测鸡蛋中残留的
莫能菌素 [57]，灵敏度与液相色谱法 [59]接近。甲基
盐霉素是抗球虫的聚醚类离子载体抗生素，当在人
体积累到一定浓度时，会导致肠道出血，破坏肝、
肾功能 [81]；Peippo等 [60]利用间接 TRFIA检测蛋类
食品中甲基盐霉素残留，灵敏度远超 LC，特异性
良好，操作简便，有很好的应用前景，为甲基盐霉
素残留检测提供了理论依据。土霉素对多数革兰氏
阳性菌、革兰氏阴性菌、放线菌等都有抗菌作用，
过量时会损害人体胃肠道、肝脏、肾脏 [82]；国外
研究人员利用 TRFIA 检测鱼体内残留土霉素 [61]，
并在灵敏度上与 ELISA、高效液相色谱检测结果进
行重点比较，TRFIA灵敏度高于 ELISA、LC，优
势明显。泰乐菌素是一种禽、畜专用的大环内酯类
抗生素，不仅可以预防疾病，还可作为饲料添加剂
使用，摄入人体后也会产生毒害作用 [83]；利用
TRFIA检测泰乐菌素 [62]，灵敏度远超 ELISA[63]、
LC[64]，TRFIA有望取代传统方法成为泰乐菌素残
留检测的新方法。替米考星是由泰乐菌素的一种水
解产物半合成的畜禽专用抗生素，对胸膜肺炎放线
菌、巴氏杆菌具有比泰乐菌素更强的抗菌活性，使
用不当会毒害心脏，引起负性心力效应 [84]；相关文
献报导了 TRFIA检测替米考星 [62]，灵敏度略高于
ELISA[65]，特异性良好，定量标准曲线的相关系数
在 99%以上，适于大样本筛查。
磺胺类药物是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的
药物，可用于预防和治疗畜禽细菌感染性疾病，但
这种药物的代谢时间长，容易在体内蓄积，到达一
定浓度就会对人体造成危害 [85]。相关研究采用
TRFIA，以 Eu3+抗体作为示踪物直接对水样中的磺
胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲嘧啶进行测定，结果
表明该法对磺胺嘧啶的检测灵敏度远远高于 3种传
统方法，反应特异性高，结果稳定，在酸碱环境中
稳定性依然很好；经验证该法同样适用于食品检
测 [67]。Le等 [71]首次采用双标记 TRFIA，Eu3+示踪
磺胺嘧啶、Sm3+示踪磺胺喹喔啉，同时对这两种物
质进行检测，磺胺嘧啶灵敏度虽低于前者但仍高于
传统方法，特异性好，在同一 TRFIA体系中不存
在相互干扰现象，为双标记 TRFIA检测兽药残留
提供了理论依据。
喹诺酮类药物过量使用会诱发癫痫，影响人体
软骨发育 [86]。恩诺沙星是化学合成的喹诺酮类抑菌
剂，能够与细菌 DNA回旋酶亚基 A结合，从而抑
制酶的切割与连接功能，阻止了细菌 DNA的复制，
从而呈现抗菌作用，大量滥用亦会对人体健康构成
威胁 [87]。Zhou等 [72]采用间接 TRFIA法，定量检
测恩诺沙星，灵敏度明显高于 ELISA、LC，检测
鳗鲡、猪肉、鸡肉和蜂蜜中的恩诺沙星，未与其他
喹诺酮类药物发生交叉反应。环丙沙星是第三代喹
诺酮类抗菌药物，具有广谱抗菌活性，杀菌效果好，
抗菌活性比诺氟沙星及依诺沙星强 2~4倍，对肠杆
菌、绿脓杆菌、流感嗜血杆菌、淋球菌、链球菌、
军团菌、金黄色葡萄球菌均具有抗菌作用，不合理
使用同样危害人体健康 [88]。李丽华等 [75]将环丙沙星 -
卵清蛋白包被微孔板作为固相抗原，环丙沙星样品
与包被抗原竞争限量一抗，用 Eu3+标记二抗作为示
踪物，灵敏度高于 ELISA，适于高通量检测环丙
沙星。
3　展望
在科学知识匮乏和经济利益驱使的背景下，养
殖业中滥用兽药的现象普遍存在。残留药物经人体
摄入后，对人体的危害极为严重 [89-90]，但由于样品
来源复杂，残留药物含量极低，对检测技术有着巨
大的挑战。 TRFIA以其灵敏度高、特性好、安全
性强等特点在兽药检测领域开始引起重视。以下 3
顾宏杰，等：时间分辨荧光免疫分析在兽药残留检测中的应用第11期 1233
个方面将是其发展的方向。
3.1　提高检测灵敏度
制备高效价的抗体、在 TRFIA基础上引入生
物素 -链霉亲和素放大系统、制备高荧光产率的稀
土离子螯合物等 [91]均可使 TRFIA的检测灵敏度得
到提高，而新型稀土离子螯合物的合成是研究的热
点。
3.2　多种抗原同时检测
稀土离子的发射谱带狭窄，且发射波长各不相
同，理论上可使用不同稀土螯合物探针检测多种被
测物，同时得到不同兽药残留的结果，简化了操作
步骤，起到事半功倍的效果，是发展的主要方向。
3.3　缩短检测时间
TRFIA试剂盒 [92]省去了试剂配制等繁琐的前
期处理工作；基于荧光共振能量转移的 TRFIA[93]
无需解离增强，省去了大量的洗涤步骤；自动化仪
器的研制 [94]亦可大大缩短检测时间。
尽管目前兽药残留检测标准仍以色谱法、
ELISA等传统方法为主，但相信随着TRFIA的发展，
广大学者的认可以及标准的完善，必将促进 TRFIA
在兽药残留检测中的作用。
[参　考　文　献]
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