全 文 ：木聚糖酶分离纯化技术
孙雷 朱孝霖 李环 韦萍
(南京工业大学制药与生命科学学院,南京 210009)
摘 要: 木聚糖酶应用广泛, 其分离纯化是进行酶学性质研究、分子研究的前提条件, 是成功确定氨基酸序
列和三维结构的基础。综述微生物木聚糖酶分离纯化的方法, 分析了常用方法在其分离纯化中的优缺点; 强调了
特异性分离纯化技术是高效的分离纯化方法;并对其它方法进行了概括。
关键词: 木聚糖酶 分离纯化 特异性分离纯化
Isolation and Purification Technique of Xylanase
Sun Lei Zhu Xiaolin Li Huan Wei Ping
( Coll eg e of L i f e S ci ence and P harmac eut ical Eng ine ering , Nanj ing Univ er sit y of T echnolog y , N anj ing 210009 )
Abstract: Xy lanases ar e applied in many ar eas because of their bio technolog y potential. Isolation and pur ifica
tion of x ylanases t o homogeneit y is necessar y for detailed bio chemical and mo lecular studies, and for determining
their pr imary aminoacid sequences and their threedimensiona l str uctur es. This art icle review s the isolation and pur
ification methods used f or the recovery of microbial x ylanases. Sever al purificat ion methods ar e analyzed, indicating
some details should be noticed. Special affinity methods are developed by the inter action betw een substr ates and xy
lanases, and by the gene techno lo gy o f fusing a tag , such as 6H is to x ylanase . Ot her purification methods are also
described, such as electro elution , the use of aqueous tw ophase systems, and thr eephase par tition.
Key words: Xy lanase Iso lation Purif ication Biospecific affinity pur ification
木聚糖是植物半纤维素的主要组分, 主链由
1, 4糖苷键连接吡喃型木糖残基构成[ 1]。木聚糖酶
一般指内切1, 4木聚糖酶 ( 1, 4D木聚糖水解
酶, EC3. 2. 1. 8) , 它作用于 1, 4木聚糖主链的内
部,使木聚糖降解为木寡糖。
木聚糖酶可广泛应用于生物转化、食品、饲料、
造纸等行业[ 1~ 3]。分离纯化木聚糖酶是进行酶学性
质研究、分子研究的前提条件,是成功确定氨基酸序
列和三维结构的基础 [ 3]。
微生物产生的木聚糖降解酶系比较复杂, 且大
多还同时生产纤维素酶, 这些酶性质相近,使分离纯
化木聚糖酶比较困难。分离纯化木聚糖酶方法很
多,多数采用非特异性方法,如硫酸铵沉淀后, 经过
离子交换,凝胶层析分离纯化的方法;也有根据特异
性分离的,如根据木聚糖酶能与底物特异性结合而
发展的亲和层析方法。
1 木聚糖酶的非特异性分离纯化
大多数木聚糖酶的分离纯化采用多步非特异性
方法,如粗沉淀之后,采用离子交换, 凝胶层析, 疏水
层析等。Paula S. P. 等人统计了 65 篇发表的关于
木聚糖酶纯化的方法, 发现使用硫酸铵沉淀的占
35. 8% ,而有 47%采用这一步作为纯化方法的第一
步;离子交换层析是使用最多的方法, 达 94% ,而其
中 64%用这种方法作为层析分离的第一步; 凝胶过
滤方法的使用仅次于离子交换, 占了 66%; 疏水层
析占 22% [ 3]。纯化的步骤多少影响酶最终的回收
率,随步骤的增加,回收率下降, 超过 3 步的分离纯
化平均回收率不到 20%, 而 3 步纯化平均回收率
35% [ 3]。
1. 1 硫酸铵沉淀
硫酸铵沉淀是酶分离纯化中常用的方法,可以
收稿日期: 20050609
作者简介:孙雷( 1980 ) ,男,硕士研究生,从事蛋白质的分离纯化, TEL : 02583587341 Email: su nlei1123@ 126. com
生物技术通报
技术与方法 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 5期
同时达到浓缩与粗分离的目的。但对于低分子量木
聚糖酶的纯化来说, 可能是限制其回收率的主要因
素。Paula S. P. 在纯化 Baci l lus subti l is 的 Xy l
时,发现硫酸铵沉淀这一步使酶的回收率降低了
62% ,并且其它的浓缩方法回收率也不高 [ 4] , 这可能
是分子量小造成的。有报道在硫酸铵分级沉淀时,
沉淀悬浮在上层, 并且有活力 [ 5]。这可能是由于液
体密度太大, 或者是加入的硫酸铵改变蛋白质表面
的电荷性质, 产生絮凝作用, 所得的沉淀疏松, 不易
下沉,可以通过倾析漏斗回收,再继续分离纯化。
此外,高浓度的硫酸铵对测定木聚糖酶酶活存
在干扰。测定酶活时可以通过透析, 或稀释的方法
降低盐浓度,排除干扰。
1. 2 超滤浓缩
超滤浓缩分离也是一种应用于木聚糖酶分离纯
化中的方法。Christoph. W. 在分离纯化 Thermo
toga mar i tina MSB8的 XynA 木聚糖酶时, 对粗提
液首先采用膜浓缩分离, 纯化倍数 4. 9[ 6]。分离纯化
中选择膜的截留分子量应该大于目的酶的分子量的
30% ~ 50%,以保证截留的成功。采用超滤方法,有
时会造成目的酶的大量损失, 可能与酶的结构或者
膜孔的分布不均有关。同时, 目的木聚糖酶结构中
如果含有纤维素结合区时,膜材料最好不要选择纤
维素膜,因为由于木聚糖酶与膜的吸附作用可能造
成大量损失。Christakopoulos 在分离纯化 Fusar i
um oxy sp orum F3的木聚糖酶时采用了纤维素膜分
离,结果损失了约 70%的目的酶 [ 7]。
1. 3 离子交换层析
离子交换层析技术是木聚糖酶分离纯化中常采
用的方法。根据目的酶的等电点选择合适的分离树
脂, 对于弱酸性及中性的木聚糖酶多采用阴离子交
换树脂,如 DEAE Sephadex A50 [ 8] ,对中性及弱碱
性的木聚糖酶可采用阳离子交换树脂分离, 如 CM
Sephadex C50[ 9] , 对于强离子交换树脂, 可以选用
QSepharose[ 4~ 6, 10, 11] 以及 Mono Q [ 11] 等。Eleonora
C. C等人在分离纯化 A sp er gi l lus ver sicolor 的木聚
糖酶时,粗酶提取液经过 DEA E Sephadex A50离
子交换,比活由 19. 5U/ mg 提高到 210. 6U/ mg, 纯
化倍数 19. 5 [ 8]。丁长河等人在纯化卷须链霉菌木聚
糖酶 B时,硫酸铵沉淀后, 采用 QSepharo se 离子交
换纯化,得到了电泳纯的木聚糖酶, 其中离子交换纯
化倍数 10. 0 [ 10]。
离子交换技术在分离纯化分辨率通常较高; 流
速较快(合适填料) ; 容量很大, 样品体积不受限, 适
于早期纯化。
1. 4 凝胶过滤层析
凝胶过滤是一种根据分子大小不同分离纯化木
聚糖酶的常用分离方法之一, 但是由于酶与凝胶介
质(琼脂糖或葡聚糖)的相互作用会影响酶的分离纯
化。Javier D. B. 分离纯化 Baci llus amy lol iquef a
ciens 的木聚糖酶[ 12] 和 M . Bataillon 分离纯化 Ba
cil lus sp . st rain SPS0[ 13] 木聚糖酶时都发现了这一
现象,类似的报道有很多。这可能由于木聚糖酶结
构中含有纤维素结合区去 ( CelluloseBinding Do
main, CBD) , 而葡聚糖是由 葡萄糖残基构成的,
两者可以相互结合。这种结合作用使的用凝胶过滤
层析测定分子量出现异常[ 13] ,并且酶在 SDSPAGE
上泳动变慢。
这种结合作用限制了凝胶过滤层析在分离纯化
中的应用,但是可以考虑能否利用这种作用, 采用亲
和层析进行特异性分离, 这一点在后文中介绍。
采用多步非特异性纯化步骤, 往往可以达到较
高的纯度,但随着纯化步骤的增多, 收率下降, 而且
纯化过程烦琐, 不易于工业上应用。
2 木聚糖酶的特异性分离纯化
酶是具有催化功能的蛋白质。因此, 根据酶与
底物,底物结构类似物, 辅助因子, 抑制剂等的特异
亲和力,可发展特异性纯化技术。应用特异性步骤
分离纯化木聚糖酶, 一是利用木聚糖酶自身结构上
可以与多糖结合的能力。另外, 是利用基因技术使
木聚糖酶结构中带有亲和标记。
2. 1 与多糖特异性结合亲和层析分离纯化
木聚糖酶分子结构区域研究发现不同微生物产
生的木聚糖酶在结构与性质上有很大的区别[ 14] , 而
一些微生物产生的木聚糖酶同时含有纤维素结合区
和木聚糖结合区( Xy lanBinding Domain, XBD) ,如
Thermomonosp ora f usca, Cel lulomonas f imi , 和
Str ep tomyces thermoviolaceus
[ 15] 。利用这些木聚糖
酶可以与纤维素以及木聚糖结合的能力, 可以发展
特异的亲和层析纯化方法。
52 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 5期
LopezFernandez . C. L .等人研究了来自S tr ep t
omyces chattanoog ensi s CECT 3336 的木聚糖酶对
微晶纤维素和燕麦木聚糖的结合能力, 发现对这两
种多糖都有结合能力, 但相同浓度燕麦木聚糖的结
合量是微晶纤维素的 3倍,而且燕麦木聚糖的终浓
度在 25~ 100mg/ ml的范围时, 对木聚糖酶的结合
量没有明显变化,而对微晶纤维素, 结合量随浓度升
高而升高。利用木聚糖酶对燕麦木聚糖的结合能
力,对木聚糖酶进行分离纯化, 比活由 2. 5U / mg ,升
高到 729. 5U / mg , 纯化了约 300 倍, 并且发现比其
它方法纯化的比活高, 其中利用结合能力进行特异
性纯化这一步, 比活增加了 555U / mg[ 16]。
Khanok R. 等也利用木聚糖酶对不溶性木聚糖
的特异结合能力, 一步纯化 Bacil lus sp. St rain K1
的木聚糖酶,酶的回收率达到 60%,纯度达到电泳级
别[ 15]。
一些木聚糖酶结构中含 CBD,可以用纤维素亲
和层析分离纯化; 但是当杂质, 如纤维素酶, 也能与
纤维素结合时, 纯化木聚糖酶的同时纤维素酶等也
被共纯化。相反,当杂质酶能与纤维素结合, 而目的
木聚糖酶不具有与纤维素的结合能力, 可以反向将
杂质除去,从而得到木聚糖酶。刘超纲等人利用这
种方法,探讨了利用纤维素性材料选择性吸附除区
纤维素酶从而纯化木聚糖酶的方法, 得到的酶活力
回收率达 85. 5% [ 17] 。
木聚糖酶结构中多糖结合区, 可以特异性吸附
多糖介质,采用这种特异性吸附纯化方法, 可以到达
高纯度,同时步骤少,回收率较高。
2. 2 基因技术强化亲和层析分离纯化
近年来,随着基因工程技术的发展,以及对蛋白
质生产研究的需要, 出现了很多基因重组蛋白。木
聚糖酶基因克隆和表达的研究也越来越多,人们将
基因重组技术与层析结合起来, 在基因水平上为重
组木聚糖酶的分离纯化提供方便。例如对木聚糖酶
克隆表达时使目的基因的 N 端或 C 端加上 6 个
His,这样表达出的木聚糖酶含有亲和表记, 就可以
直接用于金属螯合层析分离纯化。
Jiang . Z. Q. 等将 Thermotoga mari time MSB8
的 xy lanase B基因在 E. coli BL21 表达, 采用的载
体 pET 28a( + )可以使表达的木聚糖酶 C端融合 6
个 His,采用一步 NiNT A 亲和层析分离纯化,所得
到的木聚糖酶达到电泳纯级 [ 18]。选择合适的载体,
使表达的目的木聚糖酶一端含有亲和标记,而后应
用亲和层析分离纯化, 在木聚糖酶基因克隆中是常
用的策略。在对木聚糖酶的人工改造中也常应用带
亲和标记的载体, S. L. Magamala 在改造 Baci l lus
halod ur ans 的木聚糖酶时, 基因克隆的载体选择
pET 28b( + ) ,同样可以使表达的木聚糖酶含有 6个
His,通过亲和层析后得到高比活的木聚糖酶[ 19]。
基因工程技术的发展, 可以实现对目的酶定点
诱变。在对木聚糖酶结构区域详尽了解的前提下,
通过基因技术改变结合位点氨基酸, 强化与特定介
质结合能力,发展高效快速的亲和层析技术。
I. Shigeyasu 等人用基因工程手段对 S tr ep to
myces 的木聚糖酶结构进行改造,增强特异性结合能
力,分离纯化木聚糖酶[ 20]。来自 S tr ep tomyce oliva
ceovi ridi s E86的木聚糖酶结构中含有属于第 13族
的碳水化合物区( SoCBM 13) , 而 SoCBM 13 结构中
有t refoil结构,由三个亚区域组成,在每一个亚区
域中都有结合位点, 其中的区能够与乳糖结合,但
结合能力不强。基因技术手段改变结合区域的氨基
酸,结果大大提高了结合能力,通过采用的是乳糖
琼脂糖凝胶体系一步纯化, 收率 77. 4% , 纯化倍数
15. 7, 而对未经改造的木聚糖酶一步纯化收率
34. 4%,纯化倍数 5. 4[ 20] 。
应用特异性分离纯化方法, 往往可以达到高的
纯度,但在木聚糖酶分离纯化中使用的少,占 8% [ 3]。
然而,由于纯化倍数高, 步骤少的优点, 应用将会越
来越广泛,尤其是基因技术的发展, 从基因水平考虑
木聚糖酶的纯化为今后木聚糖酶的分离纯化途径提
供了新的思路和方向。
3 木聚糖酶分离纯化中其它方法的应用
其它分离纯化木聚糖酶的方法, 例如双水相萃
取,电洗脱( Elect roelut ion) ,三相分配( T hreePhase
Part ition)技术等尽管应用的很少[ 3] ,但因其技术自
身的优点,也有报道。
3. 1 双水相萃取
双水相萃取技术可以达到目的酶的分离与浓缩
同步进行的效果, 而且具有高容量性、易于操作、产
物高回收率、工业上易于放大等优点 [ 21]。但是常用
532005年第 5期 孙雷等:木聚糖酶分离纯化技术
的体系主要有两类: 高聚物/高聚物和高聚物/盐,前
者价格昂贵,后者因盐浓度过高蛋白活性损失较大,
且界面吸附蛋白多。
Monica 等人利用双水相萃取技术分离 Baci l lus
pumilus 的耐碱木聚糖酶, 采用的体系为: PEG6000
22% , K 2HPO4 10% , NaCl 12% , 纯化倍数 33, 回收
率达 98% [ 22]。
3. 2 电洗脱( E lectr oelut ion)
电洗脱方法对于表达量高的蛋白质, 是一种简
便、快速、经济的方法, 而且纯化前不了解蛋白质的
特性也能进行。Paula SPereira 等人利用电洗脱
方法, 作为一种简单而快速的纯化手段, 分离纯化
Bacil lus sp. CCM I 966的木聚糖酶,得到的酶比活
137U / mg [ 23]。
但是,这种方法需要特定的仪器设备, 而且对于
低表达量的蛋白质, 难于分离。
3. 3 三相分配( T hr eePhase Part it io n)
R. Ipsita 等用硫酸铵与 t丁醇构成上层有机
相,下层水相以及中间沉淀相层。目的物位于中间
相中,利用这个系统分离 A sp erg il lus niger 的木聚
糖酶,最后纯化 21倍,收率 93% [ 24]。
三相分配的机理还不清楚, 但是这种方法可以
达到复性与纯化同时进行的效果, 对于形成包含体
的酶的分离纯化有很大的应用价值, 同时研究发现
有增强酶活力的功能 [ 24]。
4 展望
目前,木聚糖酶的分离纯化大多数采用传统的
液相层析方法, 层析条件的选择对于分离纯化至关
重要。木聚糖酶与多糖结合具有特异性, 亲和层析
分离纯化木聚糖酶是一种高效的方法。此外, 纯化
系统性能的改进和载体介质性能的提高将会极大的
提高分离纯化的效率。
基因技术的发展, 对木聚糖酶结构的认识越来
越深入,通过基因手段提高分离纯化效率将会成为
以后大规模分离纯化木聚糖酶的发展方向。
参 考 文 献
1 Neeta Kulkarni, Abh ay S hendye, Mala Rao. FEMS Microb iology
Review s, 1999, 23: 411~ 456.
2 QK Beg , M Kapoor , L M ahajan , et al . Appl M icrobiol Bio
t echnol , 2001, 56: 326~ 338.
3 Paula S Perei ra, H elena Paveia, M aria CostaFer reira, et al .
Molecular Biotechn ology, 2003, 24: 257~ 281.
4 Paula SaPereira, M aria CostaFerreira, M aria Raquel Air esBar
ros . J ou rnal of Biotechnology , 2002, 94: 265~ 275.
5 Jacqu es Georis , Fabrizio Giannot ta, Eric De Bu yl , et al. E nzyme
and Micr obial T ech nology , 2000, 26: 178~ 186.
6 C hristoph win terhalter, w olfgang l iebl . Applied and En vi ronmen
t al M icrobiology, 1995, 61: 1810~ 1815.
7 C hristakopoulos P, Nerinck x W, Kekos D, et al. J Biotechn ol ,
1996, 51: 181~ 189.
8 Eleon ora Cano Carmona, Mau ricio Bat is ta Fialho, Erik a Bicalho
Bu chgnani. Proces s Biochemist ry , 2005, 40: 359~ 364.
9 杨瑞金, 许时婴, 王璋. 无锡轻工大学学报, 2001, 20: 35~ 39.
10 丁长河, 江正强, 李里特, 等. 中国农业大学学报, 2003, 8( 6 ) :
1~ 4.
11 江正强, 李里特, 林清, 等. 中国农业大学学报, 2001, 6( 6) : 32
~ 37.
12 Javier K. Breccia, Faust ino S ineri z, Mario D, Baigori, et al. En
z yme and Microbial Technology, 1998, 22: 42~ 49.
13 M . Bataill on, AP Nunes Cardin ali, N Cast ill on, et al. E nzyme
and Microbial T ech nology , 2000, 26 : 187~ 192.
14 刘瑞田, 曲音波. 生物工程进展, 1998, 18( 6) : 26~ 28.
15 Khanok Ratanakhanokch ai, Khin Lay Kyu, M orakot T ant icha
roen. Applied and Environm ental M icr ob iology, 1999, 65: 694
~ 697.
16 CL LopezFernandez, J Rod riguez, AS Bal l, et al. Appl M icrobi
ol Biotech nol, 1998, 50: 284~ 287.
17 刘超纲, 勇强, 余世袁. 中南林学院学报, 2000, 20: 11~ 14.
18 ZQ Jiang , W Deng, YP Zhu, et al. Jou rnal of Molecular Catal
ysi s B: Enzym at ic, 2004, 27: 207~ 213.
19 SL M angala, FS Kit tur a, M Nishimoto, et al . Journal of M olec
ular Catalys is B: Enzym at ic, 2003, 21: 221~ 230.
20 Shigeyasu Ito, Atsushi Kuno, Ryu ichiro Suzuki, et al. 2004,
110: 137~ 142.
21 R. M.坎普, 蛋白质结构分析:制备、鉴定与微量测序. 北京: 科
学出版社, 2000, 3: 21~ 38.
22 M on ica Andr ea Bim, T elma Teixei ra . Journal of Chr om atogra
ph y B, 2000, 743: 349~ 356.
23 Paula S Pereira, Jos e Duarte, Maria Costa C ferreira. E nzyme
and Microb ial T echnology, 2000, 27: 95~ 99.
24 Ips ita Roy, Aparna S harma, Munishw ar Nath Gupta. Biochimi
ca et Biophysica Acta , 2004, 1698: 107~ 110.
54 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 5期