全 文 ：蛋白质糖基化修饰的研究方法及其应用*
张倩
杨振
张艳贞
王爱丽
安学丽
晏月明
(首都师范大学生命科学学院, 北京
100037)
摘
要:
蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰, 它参与和调控生物体的许多生命活动。随着蛋白质组技
术的不断发展,蛋白质糖基化研究越来越受到广泛的重视。本文介绍了蛋白质糖基化修饰的研究内容与方法, 并
综述了最近的研究进展。
关键词:
糖基化
糖蛋白
糖链
质谱
糖基化工程
Detection of Protein Glycosylation Modifications
and Its Applications
Zhang Q ian
Yang Zhen
Zhang Yanzhen
Wang A ili
An Xueli
Yan Yueming
( Col le ge of L i f e S ci ence , Cap ital N ormal Univ ersi t y , B eij in g
100037)
Abstract:
Glycosy lation is one of the most impor tant post
translat ional modifications o f the protein, w hich is
relat ed to many act ivit ies of life. W ith the development o f the pr oteom ics, the studies of the glycosy lation are atta

ched mo re and mo re import ance. This a rticle has intr oduced the approaches fo r determinat ion o f the specific
g ly co sy

lation
site, the assay of sugar chains of the g ly coprotein, the glycosy lation engineer ing, and rev iew ed the pro gr esses
in their applications.
Key words:
Glycosy lation
Glycopro tein
Sugar chain
MS
Glycosy lation eng ineer ing


糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰 [ 1]。
所有生物的细胞表面都由许多不同类型的糖链所包
被,而且在细胞内也存在各种类型的糖基化。在真
核生物细胞中, 寡糖链与蛋白质多肽链中的氨基酸
以多种形式共价连接,构成糖蛋白的糖肽连接链, 简
称糖肽链。根据糖肽链类型, 蛋白质糖基化可以分
为四类,即以丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸
的羟基为连接点,形成
O
糖苷键型; 以天冬酰胺的
酰胺基、N
末端氨基酸的
–氨基以及赖氨酸或精
氨酸的

氨基为连接点, 形成
N
糖苷键型; 以天冬
氨酸或谷氨酸的游离羧基为连接点,形成酯糖苷键
型以及以半胱氨酸为连接点的糖肽键。糖蛋白是许
多生物过程的基本物质, 这些过程包括细胞生长、
细胞与细胞的粘着、免疫应答、受精、凝血块的降解、
病毒增殖、寄生虫感染和炎症反应等。随着人类基
因组计划的完成以及蛋白质组技术的不断发展, 糖
基化蛋白质组的研究将越来越受到广泛的重视 [ 2]。
1
糖基化蛋白质的研究方案
有关蛋白质糖基化修饰现象的研究, 其研究过
程与内容大致如下:首先是鉴定糖蛋白,即确定糖蛋
白的存在; 其次是富集糖蛋白, 即糖蛋白的分离纯
化。另外,对糖蛋白进行表征的基础研究,要考虑两
方面:一是糖蛋白中蛋白的表征,即糖基化氨基酸位
点的鉴定;二是糖蛋白中糖链的表征,即糖组成的确
定和糖含量的测定。然后, 对糖蛋白进行功能研究,
即弄清糖蛋白的作用机制, 以及对生物体影响。在
此基础上进一步开展糖蛋白的应用研究, 根据糖蛋
白的功能进行人工改性,以满足人类的需要。
2
糖基化蛋白的鉴定
糖蛋白的检测方法大致有以下几种:
收稿日期: 2005
10
24

* 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30571154)
作者简介:张倩( 1982
) ,女,硕士研究生,研究方向:分子遗传学
通讯作者:晏月明( 1960
) ,男,教授,博士生导师,研究方向:分子遗传学与蛋白质组学, Tel : 010
68902777; E
mail: yanym2004@163. com

生物技术通报

技术与方法
         BIOTECHNOLOGY
BULLETIN







2006年第 1期
2. 1
放射性标记法
放射性标记法将3 H 或14 C 标记的糖加入培养
的细胞或组织中, 通过放射性自显影检测糖蛋白。
也可以通过对糖蛋白的受体进行放射性标记, 检测
蛋白质糖基化水平, 如放射受体分析法 [ 3]。在许多
细胞(如单核
巨噬细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等)
表面都存在能与糖蛋白特异结合的膜蛋白, 故可通
过放射性标记膜蛋白来检测糖蛋白水平。此法多用
于病毒诱导的肿瘤细胞的研究,检测灵敏度高,但放
射性标记的过程缓慢、具危险性,花费大。
2. 2
分子荧光标记法
分子荧光标记法 [ 4]是检测糖基化蛋白质较经典
的方法。由于某些糖基化蛋白质具有自发荧光的特
性,因而可用荧光分光光度计测定荧光值来反应蛋
白质糖基化水平。目前广为采用的是激发波长
370nm/发射波长 440nm。该法灵敏度和重复性都
较好,但只能检测部分糖基化蛋白质且特异性欠佳,
易受环境因素影响。
2. 3
电泳法
电泳法是传统的糖蛋白检测方法。单、双向电
泳均可检测糖蛋白的存在。糖基化血红蛋白的分离
与糖基化水平的测定多采用 SDS
PAGE 法和亲和
电泳
比色法。采用 Acid/ SDS
PAGE 和 NR/ R

SDS
PA GE 两种双向凝胶电泳, Lauriere 等[ 5] 对小
麦贮藏蛋白的糖基化进行了鉴定。现在大多数双向
电泳都采用等电聚焦( IEF) / SDS
PAGE, 它几乎成
为直接高通量获得全蛋白表达图谱的惟一有效手
段。
2. 4
凝集素标记法
凝集素标记法是最常用的糖蛋白检测法。凝集
素可特异性吸附糖蛋白, 因而被广泛应用于糖蛋白
的鉴定。Tilley 等[ 6] 运用凝集素对小麦高分子量谷
蛋白亚基的糖基化进行了鉴定, 在中国春和
TAM105品种的高分子量谷蛋白亚基 2, 7, 8, 12 中
均发现有糖基化现象的存在。Kaji 等[ 7] 采用凝集
素亲和捕获柱, 成功鉴定出 250个线虫 N
糖蛋白。
2. 5
抗体标记法
抗体标记法是针对糖蛋白所带糖链的类型制备
各种抗体,对糖蛋白进行检测。Laur iere 等 [ 5] 采用
免疫印迹的方法对小麦贮藏蛋白的糖基化进行了鉴
定,结果显示小麦蛋白 N
糖基化为木糖型。Cien

iew ski
Bernard等[ 8] 利用抗 O
GlcNAc抗体检测出
小鼠骨骼肌中糖蛋白的存在。
2. 6
化学酵素法
化学酵素法是一种较新的标记糖基化蛋白质的
技术。Khidekel 等[ 9] 率先利用此方法构建了一种
半乳糖基转移酶, 可选择性地给糖基化蛋白标记上
含酮基的蛋白毒素抗体, 成功地在老鼠的前脑中鉴
定出 25种与基因表达、神经信号转导、突触可塑性
等功能相关的 O
糖基化蛋白, 并且肯定了此方法可
推广至各种组织中的糖蛋白的标记及功能鉴定。
3
糖基化蛋白的分离纯化
获得糖基化蛋白的方法主要是电泳法和层析
法。电泳法即通过电泳的方法先得到糖蛋白条带或
蛋白点,再通过电洗脱或透析的方法得到糖蛋白。
此方法较为费时,且在操作中易使蛋白变性。而层
析法则具有快速、准确、分辨率高、稳定性好等特点,
是分析糖蛋白的理想手段。目前,利用抗体、凝集素
进行亲和层析已成为分离纯化糖蛋白的最主要的方
法。除此之外,已有人开始利用多维高效液相色谱
对蛋白质进行液相图谱分析,并全新研制并测试了
一种新的蛋白质组二维分离和差异表达鉴定方法,
称为 2
D ProteoSepTM [ 10]。这种方法可以基于蛋
白质的等电点( pI)和疏水性, 获得完整蛋白质组的
2
DE 图谱。其中, 第一维是高效聚焦色谱 ( HPCF
) , 分离得到不同 pI 值的蛋白质组分, 再将每个 pI
组分进行第二维的高分辨反相高效液相色谱 ( RP

HPLC)分离。这种方法有望用于糖蛋白和非糖蛋
白的分离纯化。层析与凝胶电泳联用也可用来分析
蛋白质翻译后修饰。Claverold 等[ 11] 利用 SDS

PAGE 和微小亲水柱层析从同工型 K
酪蛋白激酶
的混合物中鉴定出两种主要的类型及各自的糖基化
位点。Larsen 等[ 12]不仅将液相色谱技术与凝胶电
泳技术联用分析糖蛋白, 还在一步酶解法的基础上
建立了两步酶解法(特异性和非特异性酶解) ,并且
建立了连续微柱层析(先用 Poros R2柱分离非糖基
化的小肽段, 再用 Graphite pow der 柱分离糖基化
肽段)的分离方法,从而在卵囊粘蛋白中成功分离出
糖肽段。
472006年第 1期








张倩等:蛋白质糖基化修饰的研究方法及其应用
4
糖基化蛋白的表征
4. 1
糖基化氨基酸位点的鉴定
Edman降解法作为传统的氨基酸测序法, 一次
反应切下 N 末端的一个残基, 一次可测出 80 个左
右的残基。但此方法冗长, 需要高超的实验技巧和
较多的蛋白质, 且无法处理 N
端封闭的蛋白质。因
此,随着质谱技术的发展,此法已不再被广泛使用。
1976年,通过质谱技术首次鉴定出糖蛋白的一
级结构。最近, 有关蛋白质糖基化修饰的通量化研
究也有报道[ 13] 。生物质谱结合蛋白酶以及专一性
糖苷酶的酶解, 可用来分析糖基化氨基酸位点。直
接通过比较糖苷酶处理前后的糖蛋白解肽谱, 就可
确定糖肽的位置和糖基化位点。Suzuki等 [ 14] 用木
瓜蛋白酶酶解小鸡血浆中的 IgG, 通过 HPLC 纯
化,采用 MA LDI
TOF 技术分析了小鸡血浆 IgG 的
两种糖苷类型及其特异性 N
糖基化位点。Cien

iew ski
Ber nard等 [ 8]利用 MALDI
TOF 鉴定出老鼠
骨骼肌中的 14种 O
糖基化蛋白,它们按功能大致
可分为三类,分别参与信号转导、能量代谢和肌肉收
缩的生理过程。Macek等 [ 15]应用 nano
ESI
Q
T OF
分析了血栓收缩蛋白的 O
糖苷键的位点。傅立叶
变换
离子回旋共振质谱的 ECD(电子捕获解离)技
术是基于多肽的多质子化和热电子( < Q 2 eV)的
部分重组, 是一种很温和的片段化技术。由于释放
到片段里的内能很少, 更适合于研究翻译后修饰的
多肽。M irgor odskaya等[ 16] 在 1999 年首次将 ECD
技术用于鉴定糖肽的 O
糖基化位置, 克服了源后裂
解( Post
source decay, PSD)和 CAD技术中糖苷键
比多肽键更不稳定且更易片段化的缺点, 为蛋白质
O
糖基化的分析提供了很多方便。最近, J iang
等[ 17]将三肽片段 Lys
Lys
Lys 作为离子阱试剂选
择性地复杂化含硫的肽段, 从而选择性地提高了硫
糖基化位点的检测水平, 并且在鸡卵清黄体激素中
检测到一个以前未检测到的未经富集的低丰度的糖
肽段,为含硫糖肽段的检测提供了新的技术支持。
同位素编码特定糖基化位点标签 [ 7] ( IGOT )是通过
N
糖苷酶水解天冬氨酸连接的糖链, 18O 标记 N
糖
基化位点,最后用 LC
MS 检测同位素标记的糖基
化肽段。IGOT 技术不仅适用于可溶性蛋白, 也适
用于膜蛋白,如细胞表面受体和粘着因子。
核磁共振技术也可用于糖基化氨基酸位点的鉴
定。这种方法可在液态溶液中直接进行蛋白质结构
测定。紫外、红外光谱利用的是电子的能级变化,而
核磁共振利用的是原子核的能级变化。因此,要在
分析样品的溶液中加入重水或氘代试剂。在糖蛋白
的结构研究中一般采用13C谱 [ 18]。
4. 2
糖链结构的鉴定及含糖量的测定
糖链结构的鉴定多采用质谱技术、毛细管电泳
技术、气相色谱技术及凝集素亲和技术。目前最直
接的分析糖链结构的方法是串联质谱的母离子扫描
技术和 MALDI
TOF
MS 的中性丢失方法。毛细
管电泳可分析单糖 AMAC 衍生物和寡糖 ANT S衍
生物,此方法具高分辨力、高灵敏度、分离快速等特
点。在某些糖基化蛋白质的研究中也采用选择性离
子监测气相色谱。它具有敏感、特异、重复性好等特
点。T illey 等[ 6] 和 Rosel 等[ 19]在研究小麦高分子量
糖基化谷蛋白亚基的糖链结构时都使用了气相色谱
技术。凝集素是一类糖结合蛋白, 能专一地识别某
一特定结构的单糖或寡糖中特定的糖基序列而与之
结合。凝集素
糖缀合物的微矩阵[ 20] 是检测糖基
化谱的一种新手段。通过光敏表面的葡聚糖涂层可
共价偶联固定糖苷、糖缀合物或凝集素的微矩阵,从
而检测各种类型的糖苷,建立糖基化谱。
目前测定糖含量的方法多为比色法[ 21]。较常
用的有 Fo lin
Wu 法, Folin 试剂热滴定法, 蒽酮
硫
酸法, 3, 5
二硝基水杨酸法, 邻甲苯胺法和苯酚
硫
酸法等。后三种操作较为简便, 在测定糖含量时,溶
液中蛋白质浓度为 75mg / ml 时, 对测定结果无干
扰。还原剂( NaBH4)对上述各种方法影响均较大,
样品中若有还原剂要事先除去。
5
糖基化蛋白质的功能研究
有关生物体内源性糖蛋白功能的研究很多。
如: PHA 是大豆中的一种液泡贮藏糖蛋白, 它可以
被作为一种报告糖蛋白用于研究植物中 N
糖基化
蛋白质的定位 [ 22]。利用重组技术在转基因植物中
表达PHA结合可分析低丰度的 N
糖苷结构的高灵
敏度的 HPA EC
PAD检测方法,可以对大豆贮藏蛋
白 N
糖基化的器官特异性进行检测。Rossato L
等[ 2 3]在云苔属植物种子中发现了一种糖基化的主
根植物性贮藏蛋白( VSP)。它可以在植物的开花期
48







生物技术通报 Biotechnology
Bullet in







2006年第 1期
大量积累,具有特异的流动性。研究表明,它可以作
为一种氮元素缓冲剂在种子的灌浆期大量释放。
6
蛋白质人工糖基化改性的研究
对蛋白质进行人工糖基化改性属于蛋白质糖基
化工程的研究内容。所谓蛋白质糖基化工程 [ 24] , 就
是通过对蛋白质表面的糖链进行改造, 从而改良蛋
白质性质的一种技术。
蛋白质糖基化工程的研究内容多集中于药物方
面和食品方面, 如:增加重组蛋白药物的半衰期及靶
向性;对鱼肉蛋白质、卵清蛋白、

乳球蛋白、牛血清
蛋白、谷蛋白等蛋白质进行糖基化, 结果表明, 新合
成的糖蛋白在乳化性、溶解性、热稳定性、抗菌性、抗
氧化性等功能特性方面都有不同程度的提高; 对改
性后糖蛋白的营养学和毒理学进行的研究结果表
明,糖基化反应在一定程度上能抑制

乳球蛋白的
过敏反应特性, 蛋白质中的必需氨基酸除赖氨酸有
少量损失外,对其他氨基酸基本没有影响。
随着蛋白质组学技术的不断发展, 糖基化蛋白
质组已成为蛋白质组学研究中的一个重要课题。由
于糖蛋白糖链结构的可变性、复杂性和多样性,其可
能包含比核酸和蛋白质更多的信息量。因此, 糖基
化蛋白质组今后的研究热点将是对糖基化蛋白质功
能的解读。与此同时,高效、高通量的糖蛋白分离分
析技术也有待进一步开发与提高。
参 考 文 献
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国外动态

日美联手利用基因工程培育对疯牛病具有免疫力的牛
Ag Biotech Reporter 2004年 21 卷 7期 7 页报道: 日本排名第二的啤酒公司


Kirin啤酒公司, 将与
美国的一家公司合作,利用基因工程培育出不携带可引起脑消耗病的普里昂蛋白或传染性蛋白, 对疯牛病
(牛海绵状脑病, BSE)具有免疫力的牛,进而利用这些牛来生产用于治疗丙型肝炎、肺炎和风湿病的药物。
但 Kir in 公司不想把这项医药技术透露给任何第三方,包括畜牧业生产者。Kirin 公司的官员说:
鉴于
这方面存在涉及基因重组的伦理学问题,所以我们不想公开这项技术。总之,我们是决不会利用基因重组技
术来生产任何食品的。
汪开治
492006年第 1期








张倩等:蛋白质糖基化修饰的研究方法及其应用