全 文 ：植物细胞悬浮培养影响因子研究
方文娟 韩烈保 曾会明
(北京林业大学草坪研究所 北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部重点实验室,北京 100083)
摘 要: 植物细胞悬浮培养已广泛应用于育种和生产次生代谢产物,在生物工程中发挥着重要作用。本文
综述了愈伤组织继代改良的措施,影响胚性悬浮细胞系建立的几个因素,存在问题及前景展望。
关键词: 悬浮细胞系 愈伤 改良 因子 问题
Research Advances in Factors Affecting Establishment of
Plant Cell Suspension Culture
Fang Wenjue H an Liebao Zeng Huiming
( T ur f g rass I nsti tu te of Be ij ing F or estr y Univ er sit y , The K ey L abor atory f or Si l v ic ul tur e and
Conser vation of M ini st ry of E du cation, Bei j ing Forest ry Univ e rsi ty , Bei j ing 100083)
Abstract: Plant cell suspension cultur e has been widely applied in breeding and producting of secondar y metab
o lit es. Playing impor tant part in pr oject o f biolog y. I n the paper, some methods o f tissue improvement, factor s affect
embryogenic cell suspension cultures are put forw ard. Problems existed and v iew o f for eg round.
Key words: Cell suspension system T issue Improvement Factor Problem
植物细胞悬浮培养( Cell suspension culture)是
植物细胞生长的微生物化。由于其分散性好, 细胞
形状及细胞团大小大致相同, 而且生长迅速, 重复性
好,易于控制等有利因素[ 1] ,被广泛用于生理学、细
胞学、生物化学、发育生物学及遗传学、分子生物学
的研究。它不仅可直接用于原生质体分离、培养与
杂交、基因转移和生产次生代谢物等,还可在短期内
在细胞水平筛选出预期突变体,因此,悬浮细胞培养
已成为植物生物技术中最有用的手段之一[ 2]。
胚性悬浮细胞不仅是禾谷类作物原生质体的主
要来源,也是体细胞胚大量同步发生的良好材料, 而
且利用部分酶解的悬浮细胞可以作为外源基因导入
的直接受体 [ 3]。悬浮细胞系是基因枪技术的理想受
体之一,在取材、操作和筛选等方面具有诸多优点。
在植物中,主要用于单子叶植物和农杆菌不能浸染
的双子叶植物的遗传转化。该技术在小麦研究上也
已获得了成功。另外植物中含有大量有用的次生代
谢物质,可以为人类提供药品、色素、调味品、香料、
兴奋剂、杀虫剂等。使用细胞大规模培养技术可以
在可控的和可重复的条件下生产天然产物,而不会
受到病虫害、地理、气候、季节等因素的影响,并且产
物分离、提取操作相对简单。同时也将对保护人类
的生存环境起到很好的作用。
由于悬浮体系的优点,在植物次生代谢物大规
模培养中得到了广泛的应用。国外在此方面已经取
得了很大进展。悬浮体系作为育种途径之一,也越
来越受到国内外育种专家的重视。人工种子的生产
也对悬浮培养的质量提出了更高的要求。因此, 了
解影响悬浮培养的因素,快速、准确的建立高质量的
悬浮体系具有重要意义。
1 愈伤组织改良的影响因素
由外植体直接诱导的愈伤一般是不适合悬浮培
收稿日期: 20050530
基金项目:国家植物基因专项( J2002B006)和国家 863计划( 2001AA244082、2004AA244080)
作者简介:方文娟,女,山东潍坊人,在读硕士研究生,研究方向:草坪草育种, f angw enjuan0224@ 163. com
通讯作者:韩烈保教授,博士生导师, hanlb@ pub lic. bta. net . cn , 01062337982
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 5期
养的, 植物细胞在愈伤诱导的过程中有脱分化的过
程,需要通过一定的途径进行筛选、改良, 获得适合
悬浮培养的愈伤,其影响因素有:
1. 1 外植体
对于不同植物, 外植体的选择差异较大。禾本
科的幼穗、成熟胚、成熟种子、花药、胚轴、胚根、芽尖
等都可作为外植体诱导愈伤, 草坪草用幼穗往往可
获得较成熟种子更高的愈伤诱导率, 但由于材料受
季节限制不易获得, 往往用成熟种子来诱导愈伤。
而树木和花卉则往往用叶片、茎尖、芽尖、花药等。
选择合适的外植体, 才能得到胚性愈伤率和再生率
较高的再生体系, 在胚性愈伤率较高的基础上更容
易快速建立起高频再生的悬浮细胞系。
1. 2 基因型
基因型的差异是决定建立良好悬浮细胞系的关
键因素之一[ 4]。袁力勇、李绍清( 2003)在水稻悬浮
细胞系的建立中提出: 适合悬浮培养的基因型在连
续的继代培养过程中表现出好的适应性, 震荡培养
两个月后,细胞团逐渐变小, 均匀,生长旺盛, 呈淡黄
色,分散度高,无褐变现象。约三个月悬浮培养细胞
达到了最佳状态, 细胞倍增时间短, 培养液澄清透
明, 显微镜下可看到细胞团由几个至十几个细胞组
成,细胞碎片少,细胞质浓厚。
不适合悬浮培养的基因型在连续的继代培养过
程中:细胞团大而致密,呈黄褐色,细胞块不分散;生
长速度慢,生长状态不均匀, 有严重的褐变现象, 甚
至细胞变黑,死亡。培养液浑浊,粘稠, 黄褐色,细胞
碎片多,中空细胞团多, 贴壁现象严重, 很难建立起
一个生长迅速、分散性与均一性好的悬浮细胞系。
1. 3 愈伤质量与改良
坚硬致密的胚性愈伤组织难以建立起真正的细
胞悬浮系, 需要通过调整继代培养基来对愈伤组织
进行改良,以获得易于悬浮的松脆愈伤组织。在培
养基中添加 NH 4NO 3 , 使高水平的氮素营养有利于
形成生长迅速, 松脆的 型愈伤组织 [ 5]。而高盐离
子浓度对膜的功能和胞质合成能力又给予了很好的
选择和配合, 从而在这种培养基上得到的细胞一般
也具备了膜功能强和胞质合成能力强的特点,这就
有利于获得生长迅速, 胞质浓厚的愈伤组织。此外
在培养基中加入一定浓度的 NaCl筛选出生活力强、
分裂旺盛的愈伤组织 [ 6] .
董云洲( 1999)在丰抗 8号小麦悬浮细胞系的建
立及遗传转化的初步研究中报道接种用 M9( M S+
2g/ LKCl+ 0. 5g/ LNaCl+ 100mg/ LLGlutamine+
450mg/ LLA sparag ine) , 同时, 将 MS 中 NH4NO3
和 KNO3的浓度均调到 2g/ L ,提高了氮素营养和盐
离子浓度,起到了很好的筛选作用, 可快速获得适合
悬浮培养的细胞。
余瞬武、朱永生( 2001)在快速建立胚性细胞悬
浮系的培养程序初探中提出: 为了缩短建立胚性悬
浮细胞系的过程,快速获得松脆型愈伤组织, 以普通
小麦、黑麦和多花黑麦草为材料, 采用能促进植株再
生的高浓度铜离子为毒害筛选因子, 不同梯度浓度
的铜离子处理愈伤组织。结果表明, 0. 1mol/ L 的
Cu
2+ 对愈伤组织具有较好的筛选作用,能使松脆胚
性愈伤组织保存下来, 而其它类型愈伤组织褐化死
亡,产生的松脆型愈伤组织能很快适应悬浮培养,从
而快速建立胚性细胞悬浮系。
胡张华、陈火庆等( 2003)在高羊茅悬浮细胞系
的建立及绿色植株的高频再生中报道: 当 CuSO4 .
5H 2O的浓度为 2. 5mg / L 时, 对五个高羊茅品种均
有一定的筛选作用, 接种后 10天大部分愈伤组织开
始褐化,部分停止生长。连续继代两次后, 在一些褐
化愈伤组织的表面出现结构疏松, 鲜黄色呈颗粒状
的胚性愈伤组织 [ 7, 8~ 14]。
1. 4 继代周期
适宜的继代周期是愈伤组织改造所必须的, 不
同植物的继代周期是差别很大。禾本科植物适宜的
继代周期为 20~ 30 天, 对于那些生长缓慢, 颜色黯
淡, 大块状的愈伤组织有时有意识地延长继代周期
至 60甚至 80天, 虽然绝大部分愈伤组织因为环境
恶化而死亡, 但偶尔也有极少数愈伤组织在褐化的
愈伤组织边缘出现鲜黄色小颗粒的愈伤组织。合适
的继代周期应随植物的愈伤生长情况确定,时间过
久,愈伤容易分化或褐化,其诱导率及分化率均会降
低。一般条件下,缩短继代周期, 继代时尽量将愈伤
摊平,有利于获得松脆型愈伤组织。
1. 5 继代挑选,培养技术
在继代过程中, 继代人的经验非常重要, 对于愈
伤的挑选,是建立良好悬浮体系的关键。诱导出的
12 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 5期
初代愈伤组织一般可分为三种: 为质地坚硬、块
状、颜色鲜黄的胚性愈伤组织,即通常所说的胚性愈
伤组织。 为质地疏松、易分散、不分泌黏液的颗粒
状胚性愈伤组织。 为柔软、水渍、形状不规则、颜
色淡白的非胚性愈伤组织。其中 是适合悬浮培养
的愈伤。此外, 每次继代操作时注意保持愈伤组织
的极性,即愈伤组织原有的上下面。这样有利于于
愈伤组织继代后尽快适应新环境和恢复生长。在进
行最初悬浮培养时, 挑选那些生长力强表面有颗粒
突起、疏松易碎的胚性愈伤组织进行液体培养,并用
镊子尽量夹碎[ 4] 。
1. 6 植物激素
植物激素的调整对于愈伤组织的改良具有重要
意义, 适当的提高激素浓度有利于松脆型愈伤组织
的获得。
1. 6. 1 2, 4D 尹庆良、刘世强 ( 1994)在水稻悬浮
细胞系及其单细胞培养的研究中提出: 品种的遗传
特性和 2, 4D浓度是诱导愈伤组织的关键因素[ 15]。
对于大多数草坪草来说, 2, 4D 对于愈伤组织的诱
导与改良起着非常大的作用。悬浮培养往往以较高
浓度的 2, 4D 起始, 在准备再生的过程中逐渐降低
其浓度,让其再生。调节 2, 4D浓度的原则是,当愈
伤组织颜色变暗、生长缓慢或颜色鲜艳但出现明显
的分化现象时, 增加 2, 4D的浓度; 当愈伤组织生长
过快、颜色变淡或出现软化现象时, 减少 2, 4D的浓
度。
1. 6. 2 生长素与细胞分裂素的关系 离体培养时,
在生长素存在的条件下细胞分裂素的作用有加强的
趋势, 不过两者有一定的顺序关系, 若处理顺序不
当,则会影响培养物器官发生的方向。规律如下:
先用生长素处理,再用细胞分裂素处理, 有利于
细胞分裂, 但细胞不分化, 容易产生多倍体细胞(核
分裂和细胞壁形成不同步所致) ,细胞分裂素有利于
细胞壁形成。
先用细胞分裂素处理,再用生长素处理, 则细胞
分裂也分化(可能是内源生长素起了作用)。
生长素与细胞分裂素同时处理,分化频率较高,
但是两者同时存在的用量比值可以改变形态建成的
方向。生长素与细胞分裂素比值高时, 有利于根分
化,抑制芽形成;比值低时,有利于芽分化, 抑制根形
成,比值适中时,促进愈伤组织生长 [ 16]。
1. 6. 3 其它 赤霉素可以用于分裂组织和发育迟
缓的小苗的培养基中。ABA 偶尔被使用,它的作用
模式不是很清楚,在某些情况下 ABA 被使用是因为
它对被培养细胞的伸长和发育有抑制作用,但在另
外一些情况下却因为其对被培养细胞的伸长和发育
有促进作用。在高羊茅再生培养中发现, 诱导培养
基中添加不同浓度的 ABA 对高羊茅成熟胚愈伤组
织诱导率有显著的影响。培养基中添加一定浓度的
ABA,可有效地抑制胚芽和根的生长,显著提高其成
熟胚愈伤组织的诱导率, 以 ABA 为 2mg/ L 时诱导
率最高。当 ABA 浓度大于 5mg/ L 后, 其愈伤组织
诱导率反而下降 [ 9~ 14]。
2 悬浮体系的建立过程中的影响因素
2. 1 悬浮培养的条件
要快速、有效的建立一个悬浮体系, 合适的转
速、培养温度、适宜的光照、摇床的型号与质量都是
不可或缺的因素。由于植物细胞体积较大, 其中液
泡占 95%以上的体积, 植物细胞的细胞壁主要由纤
维素组成, 这些使得植物细胞对剪切力的敏感性要
高于微生物。一般转速控制在 90~ 120r/ min[ 17] ,但
也有特殊情况, 涂艺声、江洪如、王碧琴在 1994年发
表的草珊瑚细胞悬浮培养之研究中提出: 草珊瑚的
悬浮培养物在 100 r/ min 速度下振荡培养几乎难以
存活,最佳的摇床转速为 40 r/ min [ 18]。光照强弱根
据培养材料而确定。好的摇床可以让悬浮培养物在
相对稳定的环境中生长, 受力均匀。
2. 2 继代培养的次数
尹庆良、刘世强在 1994年发表的水稻悬浮细胞
系及其单细胞培养的研究中指出: 固体继代次数是
一个关键的因素,随着继代次数的增加,愈伤组织转
入液体培养后形成的悬浮系的质量越来越高, 其鲜
重增长率、分散程度、圆细胞率都明显增高[ 3] 。随着
悬浮继代次数的增加, 胚性愈伤率和愈伤的分化再
生率都会提高。不同的植物其最适合的继代次数不
同。早熟禾愈伤一般培养 3~ 4个月后其胚性愈伤
率和再生率均比较高,结缕草一般要培养 4~ 5个月
后其愈伤率才能达到较高水平。继代时间过久, 愈
伤变化出现水化、褐化、再生率下降, 应不断调整激
素浓度,使其处于良好状态。
132005年第 5期 方文娟等:植物细胞悬浮培养影响因子研究
2. 3 条件培养基与新鲜培养基的比例
在悬浮培养过程中, 保持条件培养基与新鲜培
养基适当的比例是重要因素之一。经过短时间细胞
培养的条件培养基具有促进细胞分裂的功效。在悬
浮培养的过程中, 尤其是初期愈伤组织在适应从固
体培养适应液体培养的过程中, 易出现褐化现象。
将培养基中 2, 4D浓度提高, 同时增加水解酪蛋白
和谷氨酰氨,在一定程度上起到抑制褐化的作用[ 3]。
酵母抽提物对水稻细胞悬浮系无促进作用,相反加
人少量会使褐化率大大提高; 酵母抽提物对细胞悬
浮培养的效应是有异议的, 叶和春, C. E. Green 的
实验结果表明醉母抽提物对细胞悬浮系具有促进作
用[ 15]。
2. 4 悬浮培养物的分散程度
悬浮培养物在适宜的浓度和合适的培养液下,
能保持较好的分散状态。当浓度过大时易出现聚
堆、结块现象。
尹庆良、刘世强指出:在水稻悬浮体系建立的过
程中,在液体培养基中附加 600mg/ L 的肌醇能够大
大提高愈伤组织的分散程度。分离单细胞的最佳时
间应为继代后 2~ 3天。细胞悬浮系继代 3~ 4 d时,
细胞数量的活细胞率都达最大值, 此时是进行单细
胞分离或原生质体游离的最佳时期 [ 15]。
贾景明、刘永昌等( 1999)在玉米单细胞培养的
研究中指出: 大量元素减半和 0. 5~ 1. 0mg/ L 的 2,
4D浓度用于玉米单细胞培养, 能获得良好的细胞
分裂和生长,细胞悬浮培养获得了愈伤组织。
2. 5 细胞培养的起始浓度
植物细胞间的联系通常比微生物细胞的联系密
切得多。在细胞生长之前, 在细胞内部必须建立起
标准的内源水平。在有高密度细胞群和培养基营养
丰富的情况下, 易于达到标准水平。而在低密度下,
由于细胞少,其向外渗透的代谢物总量少, 很难提高
培养基中的代谢物浓度, 因而也就很难使细胞本身
存留的代谢物达到标准的内源水平, 使细胞开始分
裂[ 19]。
在悬浮培养中, 接种量的多少对细胞生长往往
有较大的影响[ 8]。涂艺声、江洪如等在草珊瑚细胞
悬浮培养之研究中报道: 在黄花蒿细胞悬浮培养过
程中, 起始培养的细胞浓度亦是影响细胞生长的一
个关键因素,细胞浓度必须高于一个临界密度,细胞
才能分裂生长. 。只有接种量超过最低的临界密度
时,悬浮细胞才能促进分裂和发育。低于此临界密
度,培养细胞就不能生长。在范代娣( 2000)编写的
细胞培养与蛋白质工程中指出, 在悬浮培养开始时,
需测定培养种子液浊度, 以确定接种量,培养开始时
OD 600应以 0. 1左右为适宜。
李弘健,张毅,郭勇在生物量对黄花蒿悬浮培养
细胞生长的影响中提出: 起始培养的细胞浓度直接
影响细胞的生长周期增殖倍数。起始浓度越高, 细
胞生长周期越短, 但细胞的增殖倍数越小。起始细
胞浓度对黄花蒿悬浮培养细胞对数生长期的比生长
速率影响不大。在黄花蒿细胞培养过程中也看到,
接种量对细胞生长周期中的迟滞期影响较大, 接种
量少,细胞建立内源水平的时间就长,带来了迟滞期
的延长;反之,迟滞期则缩短。一旦细胞开始分裂,
细胞密度对细胞分裂的影响消失, 表现出接种量对
细胞对数生长期的比生长速率几乎没有影响 [ 20]。
2. 6 提高再生固体培养基的渗透压来提高植株再
生率
禾本科植物悬浮细胞的植株再生比较困
难[ 9, 10] , 近期有许多报道认为,保持温和的渗透胁迫
对植株再生有很大的影响[ 11] ,推测是因为高浓度的
琼脂对愈伤组织产生了一种水分或营养胁迫, 或者
引起愈伤组织透气性的增加, 从而促进愈伤组织的
再生植株[ 10] 。如 Lu 等报道, 高浓度蔗糖可以提高
玉米植株的再生频率; T rukahara等证明,部分干燥
处理可以促进粳稻愈伤组织的植株再生[ 14] ,颜秋生
等在培养基中增加蔗糖浓度至 60g/ L 或提高琼脂浓
度, 均可提高水稻原生质体来源的愈伤组织的再生
频率。本研究结果表明, 蔗糖高渗与高浓度琼脂固
化培养均可大幅度提高高羊茅悬浮细胞的绿苗再生
频率[ 7] 。
3 存在问题与前景展望
3. 1 植物细胞与动物细胞、微生物比较存在的优势
植物细胞培养与动物细胞相比有以下优越性:
动物细胞大都分为贴壁生长,需要黏附在支持物上,
这样使大规模培养受到限制, 而植物细胞大部分为
悬浮培养。无需支持物,因此可以大规模培养。此
外,植物细胞由于具有细胞壁,对剪切力的敏感性要
14 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 5期
小于动物细胞。动物细胞培养一般需要血清, 培养
成本较贵。
与微生物相比, 植物细胞体积较大、聚积成团,
比微生物生长慢, 特别是其对剪切力的敏感性要大
于微生物,只能在相对低的剪切力下操作, 这样势必
因为混合不充分而影响营养物质的传递; 其次,植物
细胞的生理和代谢活动较低, 仅要求较低的氧传递
速率, 过高的通气速率反而抑制细胞生长和产物合
成;此外, 植物细胞生长缓慢, 发酵时间长, 维持无菌
操作更为困难。
3. 2 植物细胞大规模培养过程中存在的困难
植物细胞的长度多为 10~ 100 微米, 形状多为
球形或圆柱形, 因细胞分化后不易分离,而且在间歇
培养的后期分泌胞外多糖, 所以常易聚积成团。聚
积体常包括上百个细胞, 直径能达几个微米。用图
像分析和筛析技术发现不同细胞系、不同细胞年龄、
不同培养条件下细胞团的形式也不同。
Wagner 和 V ogelmann[ 21] 发现长春花悬浮物由
摇瓶向气升式反应器放大的过程中, 从聚集体颗粒
到单个细胞形态学均发生了改变。另外颗粒的分布
也受环境的影响。细胞颗粒过大一方面会影响发应
器的混合和操作, 另一方面导致大细胞团的营养欠
缺。
在反应器中进行培养植物细胞的过程中, 有两
个限制条件需要考虑: 一是在培养后期细胞大量生
长,细胞聚积在有限的空间内,使碳和氮传递不均一
从而造成细胞的死亡; 另外一个限制条件是植物细
胞对剪切力敏感是植物死亡的另一主要原因。
3. 3 前景展望
对于药用植物来说, 细胞悬浮培养的最终目的
是利用高产株系进行大规模培养, 通过生物和工程
技术方法的结合以实现高效生产次生代谢产物。对
于研究比较透彻的模式植物,则多在细胞学, 生理生
化上取得了突破的进展。为细胞学和生理生化作出
了突出的贡献。近年来, 图像分析技术已被用于植
物细胞培养过程中细胞颜色、生长速率、形态、聚集
体尺寸分布以及结构的分析与研究 [ 22] , 它的优点是
操作简单、非侵入性和有针对性的对细胞进行监测。
这样使维持高质量细胞生长态势的控制成为可能。
这些技术为人们带来了希望, 同时要注意的是在实
现大规模工业生产之前必须解决的问题是经济与技
术的可行性。由于植物细胞培养可以实现人工调
控, 成为生产植物次生代谢物的最有潜力和吸引力
的研究领域。同时, 为快速、有效的诱导抗性植株,
进行高产细胞株的筛选和稳定性研究(就是利用转
基因和重组 DNA 技术创造生长快,代谢产物产量高
的植物细胞株, 并对这些高产细胞株的稳定性进行
研究)实现大规模扩繁和人工种子的生产提供了更
为有效的途径。
总之,植物细胞悬浮培养有着广阔的发展前景。
在人类面临能源危机、资源短缺、环境污染日益严重
的情况下, 研究与利用植物细胞培养工程其意义尤
为深远。
参 考 文 献
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