全 文 ：苏云金芽孢杆菌转座因子研究进展*
黄天培1, 2 刘晶晶1 关雄2 张杰1, **
( 1中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100094;
2福建农林大学教育部生物农药与化学生物学重点实验室, 福州 350002)
摘 要: 近年来的研究发现苏云金芽孢杆菌转座因子和许多毒力因子可能是紧密联系的。由于转座因子的
特殊性质,使它们在现代农业生物技术中有着广泛的应用前景,科学家对苏云金芽孢杆菌转座因子的研究也在不
断深入。本文主要针对苏云金芽孢杆菌转座因子的研究进展进行综述, 并对发展前景进行展望。
关键词: 苏云金芽孢杆菌 转座因子 转座子 插入序列
Progres on Study of the Transposable Elements
of Bacillus thuringiensis
H uang Tianpei1, 2 Liu Jingjing 1 Guan Xiong2 Zhang Jie1
( 1S tate K ey L aboratory f or B iolog y of Plant Di seases and In se ct P ests , Inst itut e of P lant P rot ect ion,
Chine se Academy of A g ri cul tu ral S ci ence s, Bei j ing 100094;
2K ey Laboratory of Biope st i cide and Chemical Biology , Fuj ian A g ri cul ture and F ore str y Univ er si t y ,
M inist ry of E du cation, Fuz h ou 350002)
Abstract: Recent y ears, the findings of association between inser tion sequences ( I Ss) and many pathogenic
and virulence funct ional facto rs have been increasing ly f requent because o f the w ide application pr ospect on modern
agr icultural biotechno lo gy . In order to better understand the fundamenta l biolo gy and pathogenesis o f B acillus
thur ingiensis , the pro gr ess in the tr ansposable elements of Bacill us thur ing iensis was r eview ed and discussed.
Key words: Bacillus thur ingiens is T ransposable elements T ranspo son Insert ion sequences
杀虫微生物中研究最多、用量最大的是苏云金
芽孢杆菌( Bacil lus thur ingiensi s, 简称 B t)。随着
人们对生物防治的广泛重视以及分子生物学和分子
遗传学的迅速发展, 自上个世纪 80年代以来, Bt 的
研究十分活跃, 科学家们在 Bt 资源的发掘、杀虫晶
体蛋白基因( cry 基因)的定位、分离和克隆、结构功
能及其生产应用等方面进行了深入的研究, 从而使
Bt成为继枯草芽孢杆菌( B. subt i li s)后在芽孢杆菌
属中研究最详尽的第二大研究对象。多年的研究发
现, Bt的 cry 基因主要定位于质粒上, 并且在结构
上经常和转座因子(包括插入序列和转座子)联系在
一起[ 1] ,这有可能与 Bt 的杀虫活性密切相关, 因此
近年来引起了国际上对 Bt 转座因子研究的关注。
本文主要就 B t转座因子的研究进展进行介绍,以期
对国内 Bt 分子生物学和分子遗传学的研究有所
借鉴。
1 命名法则
Bt的转座因子目前只发现插入序列( Insert ion
sequences,简称 ISs )和转座子 ( T ranspo son, 简称
T n)两大类。插入序列最早的命名法由斯坦福大学
的 Esther M Lederberg 于 1978年提出,即在/ IS0后
面加上斜体的阿拉伯数字, 如/ I S231 0。第二种命
名法则是 在上 述两者 间加 入学 名简 称, 如
/ I SRm1 0。人们在文献中都能找到根据其中一种
收稿日期: 2005-11-28
* 基金项目:国家 973计划项目( 2001CB109005和 2003CB114201)资助
作者简介:黄天培( 1979- ) ,男,博士研究生,主要从事生防菌分子生物学及发酵工程研究
** 通讯作者: T el : 010-62896634, E- mai l: jzhang@ ippcaas. cn
生物技术通报
# 综述与专论# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 1期
命法命名的插入序列。当然, 个别的插入序列没有
按照上述原则进行命名。1998年 Jacques M ahillon
根据遗传结构、转座酶基因、两端反向重复序列以及
插入位点核苷酸序列的相似性将插入序列分类为不
同家族,并根据上述两种命名法重新命名了部分插
入序列[ 1]。目前, ISs的命名由国际数据库 ISFinder
( http: / / www- is. biotoul. f r/ ) 进行统一命名。研
究者可以在线提交序列或者发电子邮件给数据库管
理员。所提交的插入序列转座酶基因推导的氨基酸
序列与该数据库里任何一个插入序列转座酶氨基酸
序列同源性高于 98%或者上述两个转座酶核苷酸
序列同源性超过 95% ,则认为提交的插入序列是一
个已知插入序列的异构体( iso form)而不被命名, 反
之将给予一个新的命名。除了极个别传统命名外,
新的插入序列按/ IS+ 属名第一字母+ 种名前两个
字母+ 阿拉伯数字0进行命名, 如 ISBth1。转座子
( T r ansposon,简称 T n)的命名还没有统一的国际机
构,一般在 / T n0后面加上斜体的阿拉伯数字, 如
/ Tn54010 [ 1]。
2 特性与分布情况
有些转座因子被证明是有活性的。结构分析表
明它们都含有一个保守的转座酶-整合酶结构域
( DDE mot if )。本文以目前研究得较为深入的属于
IS4 家族的 IS231A 和属于T n3 家族的 T n4430 为
例分别简述 Bt插入序列和转座子的特性。
IS231A两个末端存在反向重复序列( Inv erted
repeats,简称 IRs) , 编码一个转座酶基因, IS231A
在大肠杆菌、蜡质芽孢杆菌和 B t里均为非复制型转
座, 在大肠杆菌和 Bt 里均偏爱插入到转座子
Tn4430 末端反向重复序列( Inverted repeats, IRs)
里,其插入位点序列特征为 5- GGG( N) 5CCC-3。但
是,由于插入位点侧翼序列的差异, 它在 T n4430 两
个 IR的插入频率不同 [ 2]。
Tn4430 是在B t 中广泛存在的一种转座子, 大
小为 4. 2 kb,两端为 38 bp 的 IRs, 内含重组酶基因
( tnp I )和转座酶基因( tnpA ) , 在 tnp I 基因上游 208
bp区域有一个解离位点 Res, 以复制型进行转座。
Tn4430 属于 T n3 家族, 为 Ò类转座子, 转座时由
TnpA 识别两端的 IRs序列, 并将两个 IRs 及其中
间的序列转移到靶位点。在转座过程中可形成共整
合二聚体, T npI使共整合二聚体之间的 Res位点发
生同源重组,使得在靶位置出现一个转座子拷贝,原
来的转座子仍保留 [ 3]。
在研究过程中,人们发现 Bt形成伴孢晶体的能
力很容易丢失,而且不能回复,其特征与质粒的特性
相似。最终人们发现大多数 cry 基因定位于大质粒
上,而且在基因组结构上与插入序列或转座子紧密
联系在一起[ 4] 。如在 B t以色列亚种 112kb质粒上
存在 着 插 入 序 列 I S231 F、I S231 V、I S231W、
I S240A 和 I S240B [ 5 ] 。核苷酸 序列分 析发现
cry1A 基因的两侧有两套反向重复序列, 这些重复
序列具有典型的插入序列特征, 它们被命名为
IS231 和 IS232 [ 6 ] 。IS231 属于 IS4 家族,在 Bt中
分布广泛,已经在半数以上的已知血清型的 Bt标准
菌株和 107株中国分离株中检测到它们的存在[ 7, 8]。
IS232 属于 IS21 家族,存在的范围较小[ 7 ]。
第一个芽孢杆菌属的转座子 Tn4430 是从 Bt
中分离克隆出来的, 它是通过随机插入粪肠球菌
( Enterococcus f aecali s )的接合转移质粒上被发现
的[ 9 ]。另一个 B t转座子 Tn5401 则是从对鞘翅目
有活性的 Bt var. t enebr ionis 中分离得到的 [ 10]。
综合各项研究结果,人们发现 Bt存在着多种转
座因子,主要包括 IS3、IS4、IS6 和 IS21 四大插入
序列家族以及 Tn4430 和T n5401 转座子[ 2, 8~ 13] 。
3 与功能基因的联系
研究发现, IS231 类插入序列经常与 cr y 基因
联系在一起, 如 IS231W 与 cr y11A a 相邻[ 14] , 而
IS231 I 位于 cry4基因下游[ 15]。本室从 Bt 中克隆
的插入序列 IS231J( Genbank登录号 AY566168)从
5c端反向重复序列开始的 495 bp 与与一个已报道
的 v ip 1A c基因( Genbank 登录号 AY245547)下游
105 bp处开始的 495 bp序列同源性为 99% ,只有 3
个 bp不同,我们首次发现了在紧挨着 v ip 类基因旁
边存在着 IS231。而本室从 Bt 山东亚种中克隆的
M IC231H( Genbank 登录号 AY566175)与 E sche-
r ichia col i K12 的 glgP 基因 3c端有高度同源性
( 1116 bp/ 1116 bp) [ 8]。利用 cr y2 基因作为探针进
行杂交, 人们从两个 B t菌株中得到了克隆子。测
序结果表明 cr y2B 基因和属于 IS2 或 IS3 家族的
插入序列在结构上紧密相连 [ 12]。Ellar DJ 在克隆
2 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 1期
cry1C基因时, 在其上游近 200 bp处发现了 IS3 家
族的插入序列 ISBT1 [ 16]。对鳞翅目害虫有效的
cry1 A 基因常被发现位于一个复合转座子内部。研
究人员据此克隆了全长为 2 184 bp 的 IS232A [ 11]。
cry4A 基因两侧是一对反向重复序列, 具有插入序
列的特征,被命名为 IS240 [ 17 ] 。IS240 广泛存在于
Bt 中, 在 Bt以色列亚种 cry11B 基因下游, 以及在
Bt subsp. f ukuokaensi s 亚种的质粒上也发现了
IS240 变种。此外, 在 cr y1Ca、cr y2A b、cy t1 Ab、
cy t2 Bc 和p21 基因附近都发现了插入序列[ 12 , 16 , 18 ]。
在对鳞翅目害虫有活性的 cry1A 基因附近经常能
发现 T n4430 , 而在 cry3 Aa 基因下游则存在着另一
个转座子 T n5401。Bt 中仅有的两个转座子
Tn4430 与 T n5401 是否能存在于同一菌株中目前
还不清楚。
关于 B t转座因子的作用,有几种假说。有的认
为它与细胞内 cry 基因的转移有关, 但至今未得到
实验证实。第二种假说认为它的作用是转移质粒,
这种功能是通过传导过程实现的。接合试验已经表
明 Tn4430 可通过传导过程调节非接合质粒的转
移[ 19]。因此,上述研究结果使得人们推测转座因子
与质粒的丢失及基因的重组现象等存在着某种关
系,还没有直接的试验证据。
4 在现代农业生物技术中的应用
由于转座因子的特殊性质和它们的广泛寄主
性,使它们在现代农业生物技术中有着广泛的应用
前景。转座因子可以通过插入突变,使基因失活或
者被激活。这种方法在国外多被用于人类病原菌功
能基因组的研究当中。科学家也可以利用这种方法
研究 B t各种基因的表达与调控。
转座因子还可以作为基因克隆与表达的重要工
具。首先,它们可以通过转座,将目的基因插入到受
体菌的染色体或质粒上。这种方法已经成功应用到
现代微生物农药的高效多功能工程菌构建当中 [ 20]。
此外,研究人员利用 IS231 末端反向重复序列作为
引物,采用 PCR技术区分了炭疽芽孢杆菌、蜡质芽
孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌[ 21]。
在 Bt 工程菌构建中常用到质粒载体。该类载
体常包括在研究过程中所必需但在最终产品遗传工
程菌中并不需要的基因或 DNA 片段,如各种抗生
素标记等。这些基因存在着潜在的生态安全性问
题。有效的解决办法就是在载体的适当位置引入特
殊单元,以去掉不必要的 DNA 片段。利用转座因
子的转座效应和位点特异性解离特性可以进行同源
重组,从而构建多价工程菌,既可将目的基因转入到
染色体上,又能去掉质粒载体上的抗性基因。这种
构建 Bt工程菌的方式由于解决了工程菌在环境中
的安全释放的问题, 以及导入的外源基因具有较好
的稳定性而受到广泛关注。国内外学者利用它们构
建了一系列载体, 主要包括转座载体、整合载体和解
离载体。例如, 国外利用插入序列 IS232A 和
IS231A 等构建了 pGIC055、pGIC057 和 pGI21 等
转座载体,通过转座载体的转座效应, 将 ICPs基因
整合于受体菌的内生质粒或染色体上[ 22, 23]。利用
转座子 T n5401 和 Tn4430 的位点特异性解离特
性,美国 Ecogen公司、法国巴斯德研究所和华中农
业大学发展了位点特异性解离载体系统, 其特点是
ICPs基因的两侧连接转座子的解离位点, 导入 Bt
受体菌后通过位点特异性重组而消除非必需外源片
段和抗生素抗性基因[ 5, 24, ]。特别值得一提的是,
T n5401 已成功地用于构建 Bt 转座子插入文库,进
行基因表达调控的研究 [ 25]。本室利用克隆的
IS231 构建了 1个同源重组载体和 3个温敏整合载
体,成功将 cry3A a7 基因整合到含有 cr y1Ba 基因
的B t 野生菌株中。
5 展望
虽然在 B t转座因子的性质、遗传特性和转座机
理等方面已取得可喜的进展,部分研究成果已经应
用于现代农业生物技术实践中, 但是仍有一些问题
还需要进一步深入研究和探讨:
( 1)研究转座因子与 Bt物种进化的关系。虽然
人们发现转座因子经常和 cry 基因联系在一起, 但
是,人们还没有直接的证据证明 Bt转座因子与 cr y
基因和 v ip 基因等功能基因存在直接的连锁关系。
今后可以在这方面加强研究,以期揭开其中的奥秘。
( 2)借鉴其它生物中转座因子的研究成果, 有望
研究和开发 B t转座因子作为体外分子克隆的有力
工具。
( 3)将转座因子应用于突变体库的构建,从功能
基因组层面系统研究基因的表达、调控和生物功能,
32006年第 1期 黄天培等:苏云金芽孢杆菌转座因子研究进展
分离克隆新的 Bt毒力基因, 选育高毒力突变株。其
依据的主要原理是,每种转座子均有各自独特的末
端反向重复序列,而这些末端反向重复序列随转座
子的转座而移动。因此可作为可移动的 DNA 合成
引物。进行基因 DNA 顺序测定时, 首先分离基因
克隆的一系列转座子插入突变体、并分别对它们作
限制性内切酶分析,初步确定转座子在每个突变体
中的插入位点, 然后以插入的转座子末端反向重复
序列为引物,分别进行双向或单向顺序测定。这种
方法不仅能确认突变, 还能够发现新的基因。它必
将成为 Bt反向遗传学研究的有效工具。
( 4)研究 Bt转座因子的系统进化。这可以使人
们更加深入了解 Bt遗传、变异, 认识转座因子介导
的基因重组及其对基因表达的影响,发现表达活跃
的转座因子,为更好地利用它们奠定基础。
( 5)转座因子的命名法有待进一步改进。鉴于
目前转座子的命名还没有国际命名委员会进行标准
化命名。建议今后可考虑成立一个由国际知名专家
组成的类似于 Bt 内毒素基因国际命名委员会的组
织进行统一命名。而后, 在适当的时机将插入序列
数据库和转座子数据库甚至是反转座子数据库进行
整合。
大量所谓的/自私基因0 (转座因子)的发现为
Bt的研究提出了崭新的课题。它使得人们不禁要
去思考:为了适应转座因子的突变所带来的影响, Bt
细胞要做怎样的改变,转座因子与 B t间是否存在一
个/马拉松0式的比赛, 大量新发现的转座因子的转
座功能和特性还有待于进一步研究。此外, 在实际
应用方面,人们对食品和环境安全意识的加强,绿色
食品的需求量越来越大, 这也使得构建对环境友好
的工程菌已经成为当务之急。上述问题的深入研究
必将极大的推动和促进 Bt 基础研究和应用研究的
迅猛发展。
参 考 文 献
1 M ahi llon J, Chan dler, M . Microbiol Mol Biol Rev, 1998, 62( 3) :
725~ 774.
2 H allet B, Rez sÊ hazy R, M ah illon J, et al. Mol M icrobiol, 1994,
14( 1) : 131~ 139.
3 孙明,乐超颖,等. 农业生物技术学报, 2000, 8( 4) : 321~ 325.
4 Whiteley H R, S chnepf HE . Annu Rev Microbiol, 1986, 40: 549~
576.
5 RezsÊ hazy R, H allet B, Mahillon J, et al . Plasmid, 1993, 30( 2) :
141~ 149.
6 Lereclus D, Ribier J, Klier A, et al. EMBO J, 1984, 3( 11) : 2561
~ 2567.
7 Lon ard C, Ch en Y, Mahillon J . M icrobiol, 1997, 143: 2537 ~
2547.
8 H uan g T , Liu J, Song F, et al. FEMS Microbiol L et t , 2004, 241
( 1) : 27~ 32.
9 Lereclus D, Mahillon J , Men ou G, et al. J Bacteriol, 1994, 176
( 10) : 2835~ 2845.
10 Baum . AJ , Gilmer JA, M et tus MLA. J Bacteriol , 1999, 181
( 20) : 6271~ 6277.
11 Menou G, Mah illon J , Lecadet M M, et al. J Bacteriol, 1990,
172( 12) : 6689~ 6696.
12 H odgm an T C, Yu Z, S hen J , et al. FEMS Micr obiol L et t ,
1993, 114( 1) : 23~ 30.
13 Dunn M G, Ellar DJ . Plasmid, 1997, 37( 3) : 205~ 215.
14 RezsÊh azy R, H al let B, Delcou r J, et al . Mol M icr ob iol , 1993,
9: 1283~ 1295.
15 Ohgushi A, S aitoh H , Wasano N, et al. Curr M icrobiol , 2005,
51( 2) : 95~ 99.
16 Smith GP, El lar DJ, Keeler SJ, et al. Plasmid, 1994, 32( 1) : 10
~ 18.
17 Deleculu se A, Bourgouin C, Kl ier A, et al . Plasmid, 1989, 21
( 1) : 71~ 78.
18 Jur ez-Prez V, Guerchicof f A, Rubinstein C, et al. Appl En-
viron M icrobiol, 2002, 68( 3) : 1228~ 1231.
19 Green BD, Bat ti st i L, T horne CB. J Bacteriol, 1989, 171 ( 1 ) :
104~ 113.
20 Chaufau x, Didier L ereclus , et al. Appl En vir on Microbiol ,
1999, 65( 9) : 4032~ 4039.
21 Ian H , Yu D, Peter C BT . FEMS Microbiol Let t , 1995, 128( 2) :
113~ 118.
22 Lereclus D, Vallade M , C haufaux J , et al. Bio/ T ech, 1992, 10:
418~ 421.
23 Lon ard C, Zekri O. Infect Immun, 1998, 66( 5) : 2163~ 2169.
24 Sacnchis V, Agaisse H, Ch aufau x J, et al. Appl Environ M-i
crobiol, 1997, 63( 2) : 779~ 784.
25 Malvar T , Baum JA. J Bacteriol, 1994, 176( 15) : 4750~ 4753.
4 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 1期