全 文 ： 生物技术通报
研究报告 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 2期
回收琼脂糖凝胶中 DNA的简便方法
蒋安 梁慧 陈旭 王洋 任琛 眭顺照 李名扬
(西南大学花卉实验室,重庆 400716)
摘 要: 多年来国内分子生物学实验室所采用的几种从琼脂糖凝胶中回收 DNA 的方法不同程度地存在着
各种问题。现介绍一种新的从琼脂糖凝胶上分离和提取 DNA 的简易方法, 采用实验室常用的吸附柱中的吸附膜
对 DNA 进行拦截、纯化和回收。实验证明这种方法回收 DNA 具有简便快捷、成本低和效率高等优点, 是一种切实
可行的方法。
关键词: 琼脂糖凝胶 DNA 回收 吸附柱
A Convenient Method of Recovering DNA from Agarose Gel
Jiang An Liang Hui Chen Xu Wang Yang Ren Chen Sui Shunzhao Li M ingyang
( Flow er L abor atory of sw u , Chongqing 400716)
Abstract: Since there ar e many problems in the methods o f DNA recover y fr om ag ro se gel in the labor ator ies
of molecular bio log y in these years, this paper intr oduce a novel method which can easily iso late and ex tr act DNA
from agrose gel, by using adsroption film of adsorption co lumn which is o rdinarily used in lab t o int ercept, purif y an
drecover DNA . It w as pr oved by experiments that this method has convenient, quick, low cost, and high r ate of re
covery advantag es, it is a v ery useful method.
Key words: Agrose gel DNA recover y Adso rption column
从琼脂糖凝胶中回收纯化 DNA 片段的方法已有多种, 如低融点琼脂糖凝胶回收, DEAE 纤维素滤膜回
收,电洗脱,冻融法, 透析袋法等[ 1, 2]。这些方法有的操作步骤繁琐 [ 3] ,有的成本太高, 有的 DNA 损失量大,
有的回收率低, 有的回收耗时长,这些问题一直没有得到比较好的解决,经过长期的实践,摸索出了从凝胶中
直接回收 DNA 的方法,充分利用了国内常用的质粒提取吸附柱能够高效吸附 DNA 的特点,使得 DNA 片
段的回收及纯化变得简便快捷,而且成本极低,结果稳定可靠。
1 材料和方法
1. 1 材料
常规质粒提取试剂盒所用吸附柱(下部有几个孔的平底柱为好) ,镊子, 剪刀, 夹钳, 手提式紫外灯,核酸
浓度测定仪,离心机,电泳装置,含目的 DNA 片段的溶液, 3M 乙酸钠,无水乙醇, 70%乙醇, T E溶液。
1. 2 方法
1. 2. 1 用夹钳夹住干净铁钉的尖头部位,将其头部伸进吸附柱内,钩出压紧吸附膜的塑料环,用镊子取出吸
附膜, (吸附柱保留备用) ,将适量厚度的吸附膜剪成方型,以刚好插入图 1中 B孔为宜。
1. 2. 2 按图 1所示制作一块 1. 2% 的琼脂糖凝胶。A 为加样孔,长 0. 6cm ,宽 0. 12 cm, B为回收孔,长 0. 8
cm, 宽 0. 15cm。B孔要比 A 孔宽,以防止 DNA 侧漏,两孔位置要刚好错开,间距可根据回收片段大小进行
调整。
1. 2. 3 准备好新配制的T AE缓冲液以及含有目标片段溶液5 0l , 用的是含1 . 5kb的外源片段的
收稿日期: 20060224
作者简介:蒋安 (1970) ,男,畜牧师,籍贯:四川彭州,硕士研究生,主要从事植物基国工程研究。电话: 02368250086 Email: ja_9700@ 126. com
通讯作者:李名扬, Email: limy@ swau. edu. cn
图 1 回收 DNA片段的琼
脂糖凝胶制作图
A.加样孔,长0. 6cm 宽
0. 12cm B. 回收孔,长 0. 8
cm 宽 0. 15 cm
pBssk质粒, 用 kpnⅠ和 xbaⅠ双酶切后可得 2. 9kb和 1. 5kb 两条带。
1. 2. 4 回收步骤 A.用镊子将准备好的吸附膜插入 B孔, 再将凝胶放入电泳槽。
B.在反应液中,加入 0. 25%溴酚蓝 5l ,混匀,小心上样,进行琼脂糖凝胶电泳。
缓冲液以略高于凝胶上界面为准。
C. 用手提式紫外灯观察目的 DNA 片段迁移的位置, 当目的 DNA 片段与回收
孔 B在一条直线上时, (如果目的 DNA 片段跑过 B 孔, 可反向电泳进行调整) ,暂停
电泳,将凝胶小心水平旋转 90( B孔向正极)继续电泳。
D. 当目的片段完全进入吸附膜后, 停止电泳, 用镊子小心取出吸附膜, 放入 1.
5ml离心管中,加入 300l无水乙醇和 10l 3M 乙酸钠,室温静置 20m in [ 4]。
E. 从离心管中取出吸附膜小心放回吸附柱里铺平,然后用 70%乙醇漂洗, 40
烘干,将吸附柱放入一干净离心管, 在吸附膜中央加入 50l T E 溶液静置 2min, 9
200r pm 离心 1min, 将收集到的液体取少量检测浓度, 其余放入20 保存。(空吸附
柱可重复使用)。
2 回收效果与讨论
用核酸浓度测定仪检测回收前后样品浓度,计算得出回收率为 80%。由于回收
前后的溶液总量一致,所以各取 3l上样电泳对比检测(图 2) ,可见回收后条带亮度接近原条带。
图 2 琼脂糖凝胶电泳检验 DNA回收结果
M . DL2000Mar ker. 1.回收前样品 (含 1. 5kb 的外源片段的
pBssk质粒用 kpnⅠ和 xbaⅠ双酶切) 2.回收的 1. 5kb片段 3.回收
的 2. 9k b片段
我们做了一个对比实验,分别用本法与胶回收
试剂盒回收 pBssk酶切后的两条带, 用核酸浓度仪
检测回收片段浓度, 然后分别进行连接,同样取 5l
转入大肠杆菌,在含有 IPTG, XGal的 LBAmp平
板培养基上培养, 以白色菌落数计算转化效率, 结果
用试剂盒的白色菌落数为 5 107Clonies/g pBssk
DNA, 本法为 3. 5 107Clonies/g pBssk DNA,两
者差异不显著, 证明本法所回收的 DNA 较纯。实
践证明,用这个方法制备的 DNA 可用于连接或直
接用来进行 DNA 测序, PCR 等后续操作。将回收
后的琼脂糖凝胶进行紫外光检测, 结果发现回收孔
中几乎没有荧光, 表明目的 DNA 片段已基本被吸
出,残留的 DNA 较少。曾试过不用吸附膜插入,而
试图采用吸取孔内缓冲液直接上柱的办法,结果发
现吸取液体量大, 在吸附膜上难于吸附完全,孔内残
留较多,影响回收率。而用吸附膜拦截 DNA 片段效果却较为理想,但要注意凝胶浓度不能过高, 以免电泳
缓慢, DNA 从膜中溢出。由于本方法无须捣碎琼脂糖, 也就避免了为去除杂质而采用繁琐的抽提沉淀步骤,
充分利用了吸附膜有效吸附 DNA 的特性, 使得整个操作过程快捷方便, 所用试剂少,非常适合推广。
参 考 文 献
1 S am brook J, Frit sch EF, Maniatis T . New York: Cold spring HarborLaboratory, 1989, ( 6) : 22~ 31.
2 颜子颖译. 精编分子生物学试验指南.北京: 科学出版社, 1998, 41~ 50.
3 陈志瑾,朱军民,等.免疫学杂志, 2001, 17( 6) : 482.
4 苏明,窦科峰,赵爱志,李福洋.第四军医大学学报, 2002, 23( 6) : 482.
1032006年第 2期 蒋安等:回收琼脂糖凝胶中 DNA 的简便方法