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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第5期
收稿日期 : 2011-09-05
基金项目 : 河南省重点科技攻关计划（092102110030）, 河南省教育厅自然科学研究计划项目（2011B240002）
作者简介 : 李莉 , 女 , 博士 , 副教授 , 研究方向 : 水产动物病害与免疫 ; E-mail: lily-fish@163.com
三种提取柱状黄杆菌基因组 DNA方法的比较
李莉 李春梅 谢旭阳
（河南师范大学生命科学学院，新乡 453007）
摘 要： 采用酚氯仿抽提法、CTAB法和 SDS-蛋白酶 K法分别对鱼类病原菌柱状黄杆菌提取基因组 DNA。使用超微量紫外
分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测所提取的基因组 DNA的产量和质量，并用 PCR扩增对 DNA进行了评价。结果显示，3种方法
均可提取到柱状黄杆菌的基因组 DNA，并能有效扩增细菌 16S rDNA序列，但 CTAB法提取的 DNA产量和质量最高，CTAB法可
以作为柱状黄杆菌 DNA提取以开展分子生物学研究的首选方法。
关键词： 柱状黄杆菌 基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增
Comparison of Three Methods for Extracting Genomic DNA from
Flavobacterium columnare
Li Li Li Chunmei Xie Xuyang
（College of Life Sciences，Henan Normal University，Xinxiang 453007）
Abstract: The genomic DNA was isolated from fish pathogenic bacteria Flavobacterium columnare by phenol and chloroform method，
CTAB method and SDS-protease K method. The quality and concentration of the genomic DNA were evaluated with ultramicrospectrophotometer，
agarose gel electrophoresis and PCR amplification of the 16S rDNA. The result showed that genomic DNA can be obtained using the three
different methods，and 16S rDNA were successfully amplified from samples extracted by the three methods. But the genomic DNA extracted
with CTAB method had the best quality and yield. Therefore，the CTAB method was the best one to gain the genomic DNA of Flavobacterium
columnare for the study of molecular level.
Key words: Flavobacterium columnare Genomic DNA Agarose gel electrophoresis PCR
柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）是一种
菌体细长、柔软的革兰氏阴性丝状菌，具有滑动能
力和团聚性，是世界范围内广泛分布的可以感染多
种淡水鱼类的病原菌，由柱状黄杆菌引起的烂鳃病
给水产养殖造成了很大的经济损失［1］。随着分子生
物学的不断发展，核酸技术已在生物学各领域得到
广泛应用，致病菌基因组 DNA 提取是其分子生物学
研究的基础，快速地提取高质量的 DNA，可大大提
高工作效率。国内外已有多种关于细菌 DNA 的提取
方法，如碱裂解法［2］、酚 - 氯仿抽提法［3］、CTAB
法［4］、改良的 CTAB 法［5］、SDS-酶裂解法［6］和水煮法［7］
等，由于许多方法耗时长、提取基因组 DNA 纯度低，
无法用于分子生物学下游工作的研究。本研究以从
患烂鳃病鲤鱼（Cyprinus carpio）鳃部分离的柱状黄
杆菌为试验材料，在参考前人工作的基础上将有关
提取方法进行优化，分别使用了酚 - 氯仿抽提法、
CTAB 法和 SDS-蛋白酶 K 法提取基因组 DNA，对提
取结果进行比较分析，以期探索适合柱状黄杆菌基
因组 DNA 提取的最佳方法，为进一步对柱状黄杆菌
的分子生物学研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源 柱状黄杆菌由河南师范大学生命
科学学院水产保护学实验室从患烂鳃病的黄河鲤鳃
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期164
部分离、纯化和鉴定，-80℃保存。
1.1.2 菌种培养和收集 培养柱状黄杆菌使用 shieh
培养基［3］。主要成分为（1 L）：培养基中含胰蛋
白胨 5 g，酵母粉 0.5 g，CH3COONa·3H2O 0.01 g，
BaCl2·2H2O 0.01 g，K2HPO4 0.1 g，KH2PO4 0.05 g，
MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2·2H2O 0.0067 g，FeSO4·
7H2O 0.001 g，NaHCO3 0.05 g， pH7.2。
将冻存的柱状黄杆菌菌种按照 1% 的接种量接
种于含 1 mL shieh 培养基的 1.5 mL EP 管中，28℃条
件下 150 r/min 振荡培养复苏后，转接到 100 mL 锥
形瓶中扩大培养 18 h 至菌液处于对数生长期，用以
提取基因组 DNA。
1.1.3 主要试剂 三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二
烷基硫酸钠（SDS）、饱和酚购于北京鼎国生物技术
有限责任公司 ；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、
蛋白酶 K、RNase A 为 Genview 产品，乙二胺四乙酸
（EDTA）购于天津市凯通化学试剂有限公司生产 ；
Ex Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、dNTP、Marker（DL-
2000）购于 TaKaRa 公司。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取方法
1.2.1.1 酚 - 氯仿抽提法 参照王良发等［3］的方法
稍作改动。取 1.5 mL 培养至对数生长期的菌液于 2.0
mL 的离心管中，8 000 r/min 离心 5 min，弃上清 ；
加入 600 μL 消化液（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mol/L
EDTA，1% SDS，200 μg/mL 蛋 白 酶 K，20 μg/mL
RNase A），37℃消化 30 min ；加入等体积的酚 / 氯
仿 / 异 戊 醇（25 24 1） 混 合 液， 轻 摇 10 min，
12 000 r/min 离心 5 min，取上清，重复抽提 1 次 ；
加入等体积的氯仿 / 异戊醇（24 1）混合液抽提 1 次；
加入 1/10 体积的 3 mol/L 的醋酸钠和 2 倍体积的冰
乙醇混匀，静置 10 min，12 000 r/min 离心 10 min，
弃上清 ；沉淀加入 1 mL 70% 乙醇洗涤 2 次，每次
8 000 r/min 离心 5 min，弃乙醇，待沉淀中残余乙醇
挥发后，加入 50 μL 超纯水溶解 DNA。4℃保存备用。
1.2.1.2 SDS-蛋白酶 K 法 参考张春辉等［6］的方法
略加改进。取 1.5 mL 对数生长期的菌液于 2.0 mL 离
心管中，8 000 r/min 离心 5 min，弃上清 ；加入 600
μL 消 化 液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，
0.2 mol/L NaCl，1.1% SDS，200 μg/mL 蛋白酶 K，20
μg/mL RNase A），50℃温育3 h；加入等体积的氯仿/异
戊醇（24 1）抽提 2 次，加入 0.6 倍体积的预冷异丙
醇，轻轻颠倒混匀，置于室温 10 min，直至 DNA 呈
絮状沉淀下来，8 000 r/min 离心 10 min，小心去除
上清，加入 1 mL 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀 2 次，弃
乙醇，将离心管放置于洁净工作台吹干残留乙醇，
DNA 溶于 50 μL 超纯水。4℃保存备用。
1.2.1.3 CTAB 法 参照周延清等［4］方法略加改进。
取 1.5 mL 菌液置于 2.0 mL 离心管中，8 000 r/min 离
心 5 min，弃上清 ；沉淀中加入 420 μL 消化液（10
mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1% SDS，200
μg/mL 蛋白酶 K 和 20 μg/mL RNase A），37℃温育 30
min ；加入 100 μL 的 5 mol/L NaCl，充分混匀 ；加
入 80 μL 65℃ 预 热 的 CTAB/NaCl（10% CTAB，0.7
mol/L NaCl）溶液，65℃温浴 10 min ；加入等体积的
酚 / 氯仿 / 异戊醇（25 24 1）抽提 2 次，接下来的
步骤同酚 - 氯仿法。
1.2.2 DNA 样品的质量检测 使用 Thermo Scientific
NanoDrop 2000 超微量分光光度计测定 DNA 的纯度
和浓度，分别吸取 2 μL 提取的基因组 DNA，测定样
品在 260 nm 和 280 nm 的吸光值，根据 A260/A280 判
定所提DNA的纯度。吸取基因组DNA样品 5 μL，1%
琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶成像系统拍照记录
图像，鉴定 DNA 的完整性。
1.2.3 16S rRNA 基因扩增 用于 PCR 扩增的 16S
rRNA 基因的引物为细菌 16S 通用引物［4］，序列为 ：
27f ：5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3，1492r ：
5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3，引物由上海生
物工程公司合成。25 μL PCR 反应体系 ：10×buffer
2.5 μL；10 mmol/L dNTP 0.5 μL；Ex Taq（5 U/μL）0.15
μL ；上游和下游引物（均为 10 μmol/L）各 1.0 μL ；
DNA 模板 0.5 μL ；加入无菌双蒸水至总体积为 25
μL。PCR 扩增程序：94℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，
72℃ 1.5 min，35 个循环 ；72℃延伸 10 min。反应结
束后取 5 μL PCR 产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，凝
胶成像系统拍照。
2 结果
2.1 基因组DNA样品的浓度和纯度
3 种提取方法获得的基因组 DNA 通过超微量紫
2012年第5期 165李莉等 ：三种提取柱状黄杆菌基因组 DNA 方法的比较
外分光光度计测定其 A260/A280 值及浓度的结果详见
表 1。从 A260/A280 比值分析，CTAB 法提取的 DNA，
A260/A280 是 1.85±0.08，酚 - 氯仿法提取的 DNA，
比值为 1.88±0.12，SDS-蛋白酶 K 法提取的 DNA，
比值为 1.70±0.11 ；将提取的 DNA 溶解于相等体
积的超纯水，DNA 浓度最高的是 CTAB 法（107.2
μg/mL），其次是酚 - 氯仿法（88.9 μg/mL），SDS-蛋
白酶 K 法最低（82.3 μg/mL） 。
从提取 DNA 的试验用时，3 种提取基因组方法
中的 CTAB 法和酚 - 氯仿法试验耗时较短，而 SDS-
蛋白酶 K 法试验时间较长。
3 种方法提取的 DNA 均为白色沉淀，溶于超纯
水后溶液清亮，无黏稠感，提取出了较高质量的基
因组 DNA。比较而言，CTAB 法试验重复性好、用
时短、DNA 产率较高。
2.3 DNA样品的PCR检测
3 种方法提取的基因组 DNA 样品，经 PCR 扩
增，全部扩出目的片段，1% 琼脂糖凝胶电泳检测所
得 16S rRNA 基因片段大小为 1 500 bp 左右，条带清
晰、无非特异扩增（图 2）。
表 1 三种方法提取基因组 DNA的比较
提取方法 浓度（μg/mL） A260/A280 试验用时（h）
酚 - 氯仿法 88.9±8.3 1.88±0.12 3
SDS-蛋白酶 K 法 82.3±10.5 1.70±0.11 5
CTAB 法 107.2±6.8 1.85±0.08 3
2.2 DNA质量的琼脂糖凝胶电泳检测
不同方法提取的柱状黄杆菌基因组 DNA 琼脂
糖凝胶电泳检测结果见图 1。3 种方法提取的 DNA
均条带清晰，所得基因组 DNA 大分子较为完整，
CTAB 法和酚 - 氯仿法法提取的 DNA 无明显的弥散
带和 RNA 带，纯度较高，完整性好，SDS-蛋白酶 K
法所得 DNA 尽管大分子区有明显条带，但有拖尾现
象，说明基因组 DNA 存在着一定程度的降解。
1. 酚 - 氯仿法 ；2. SDS- 蛋白酶 K 法 ；3. CTAB 法 ；M. DL2000 Marker
图 1 三种方法提取细菌基因组 DNA电泳图
M. DL2000 Marker; 1. 酚 - 氯仿法 ；2. SDS-蛋白酶 K 法 ；3. CTAB 法
图 2 三种方法提取基因组 DNA的 PCR电泳图谱
3 讨论
提取高质量的基因组 DNA 是进行病原菌分子
生物学研究的基础，目的 DNA 的浓度、纯度和结构
的完整性是进行基因工程各项研究的必需条件，而
高效、高纯度的 DNA 分离方法是扩增检测成功的
关键［2］。本试验在传统的酚 - 氯仿抽提法、SDS-蛋
白酶 K 法和 CTAB 法的基础上，对 3 种方法进行适
当的优化，并对提取的柱状黄杆菌基因组 DNA 进
行了比较分析。琼脂糖凝胶电泳显示，3 种方法所
提取的 DNA 均主带清晰完整，未见有 RNA 存在，
其中 SDS-蛋白酶 K 法所提取的 DNA 有拖带现象，
DNA 中可能混有蛋白质或有少量降解。紫外分光光
度计检测 3 种提取方法所得 DNA 样品的 A260/A280 均
在 1.7-1.9，一般认为其 A260/A280 比值在 1.80 左右
说明 DNA 纯度最高，若该值小于 1.8 说明所提取的
DNA 含蛋白质较高，大于 1.9 则说明 RNA 未抽提干
净［2］。本试验中 CTAB 法和酚 - 氯仿法提取的 DNA
A260/A280 均在 1.8-1.9，说明所提取的基因组 DNA 纯
度较好，样品中基本无蛋白质、RNA 等杂质的污染，
可以用于后续试验。使用细菌 16S rRNA 基因的通
用引物进行 PCR 扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳
显示目的条带清晰、无杂带，3 种方法提取的 DNA
均能获得一致的扩增结果，说明酚 - 氯仿抽提法、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期166
SDS-蛋白酶 K 法和 CTAB 法提取的柱状黄杆菌基因
组 DNA 样品基本满足分子生物学对 DNA 质量要求，
结果也显示只要确定了 PCR 体系中各种成分的最适
浓度，模板中少量的蛋白质对扩增结果没有影响，
该结论与 Smith［8］的观点相一致。
柱状黄杆菌是鱼类柱形病的病原，由其导致的温
水性鱼类的主要症状表现为烂鳃，研究发现柱状黄杆
菌对鱼类鳃组织的黏附能力很强，而粘附能力与其表
面的多糖成分相关，毒性强的柱状黄杆菌菌株具有
密度高而厚的荚膜多糖层［1, 3］。多糖是影响 DNA 纯
度的重要因素，其可与 DNA 共沉淀，形成不溶于水
的黏稠的透明胶状物，DNA 被包埋在这种复合物中
难以溶解，且不易被限制性内切酶和 Taq酶识别，
影响酶切反应和 PCR 扩增［9, 10］，提取高质量的 DNA
关键是有效的除去多糖。CTAB是一种阳离子去污剂，
具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖
的特性，在此条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在
溶液里，而在高离子强度的溶液里，CTAB 与蛋白
质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物［4］。
使用 CTAB 法提取 DNA 时，在 DNA 粗提液中加入
适量的 5 mol/L NaCl 和 65℃预热的 CTAB/NaCl 溶液，
在高钠离子条件下，CTAB 与蛋白质和多糖结合形
成复合物（而不会沉淀核酸），并能经苯酚、氯仿
抽提除去。但需注意的是，离心管反应液中 NaCl 的
终浓度不应低于 0.5 mol/L，否则 DNA 将与 CTAB 共
沉淀。本试验无论是酚 - 氯仿法还是 CTAB 法，在
经酚 / 氯仿 / 异戊醇抽提后，均使用高浓度的预冷
NaAc 和无水乙醇沉淀 DNA，使 DNA 在高盐浓度下
优先沉淀，在一定程度上有效地去除多糖，DNA 黏
稠度大大降低，纯度和产量也有所提高。
常规酚 / 氯仿抽提法、SDS-蛋白酶 K 法和 CTAB
法提取的柱状黄杆菌基因组 DNA 样品中有 RNA 污
染。为了去除样品中的 RNA，曾尝试在 DNA 溶于
无菌双蒸水后，加入 RNase A 至终浓度为 20 μg/mL，
37℃水浴 30 min，再加入等体积的酚 / 氯仿 / 异戊醇
抽提 2 次，虽然能去除 RNA，但多次反复使用酚抽
提，不但耗时，且使 DNA 的产量也大大减少。基于
RNA 酶的热稳定性，又尝试在提取前的消化液中加
入 RNase A 至终浓度为 20 μg/mL，然后按照正常的
提取程序进行，多次试验结果表明，RNase A 处理
和细菌消化裂解同步进行，对 DNA 产量没有影响，
结果免除了 DNA 提取后的 RNA 酶处理纯化步骤，
有效防止了 RNA 对基因组 DNA 的干扰。
4 结论
本研究选用的 3 种方法均可提取到柱状黄杆菌
的基因组 DNA，CTAB 法得到的 DNA 样品浓度高于
酚 - 氯仿法和 SDS-蛋白酶 K 法，CTAB 法和酚 - 氯
仿法提取用时短，SDS-蛋白酶 K 法则耗时长。CTAB
法提取的 DNA，无论纯度还是产率都优于其他两种
方法，产量稳定，重复性好，可以作为柱状黄杆菌
DNA 提取以开展分子生物学研究的首选方法。
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（责任编辑 马鑫）