全 文 ：第 4 期
1. 8 7 年
东 北 师 大 学 报 自 然 科 举 版
.
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9 8 7
红 缘 层 孔 菌 多 糖 的 研 究 I
— F P ` 、 F P “ 的分离与鉴定
张 丽 萍
摘 要
尽红缘层孔菌中提 取水溶性多棺 , 经脱蛋白 、 D E A E一纤维素 ( O H 一 型 )
性层析 、 琼脂拾 4 B桂层析分离纯化得 F P , 与 F P : 两多蛤 , 由凝胶过滤 , 琼脂
铃凝胶电泳证 明 F P : 与 F P : 为单一组份 。
经纸层析及气相层析桑析鉴定 , F P : 含 D “ 菊萄拾 、 D一半乳格 、 T一 岩
藻格及 D一甘露拾 、 其单格摩尔此为 l : 2 . :7 2 : 1 . 6 ; F P : 只含 D一箱 萄拾 。 经
红外光谱 、 紫外光 谱分析 , 此旋光度 , 枯度及分子 圣 等 测 定 , 发 现 F P : 与
夕 P : 均有显著差异 。
红缘层孔菌粗多拾对四 氧化碳引起的小 且血清谷丙转乞酶活性的升高有一
定的抑 制作用 , 可加快肝胜时磺澳酞钠的排泄 。
多糖类具有复杂的 , 多方面的生物活性对于真菌类多糖的研究 , 国内外 已 有 不 少
报导 ` ” 。 红绿层孔菌 F o m os F i二 一 io ol a s w o x F )r o k 。属担子菌 纲 , 多 孔 菌 目 , 广
泛分布在东北长白山区 , 是一种极特开发的野生资源 ` 空 ’ 。 本文首先从红缘层孔菌 中提
取水溶性多糖 , 对多糖组份分离纯化 , 并进行了初步的理化性质鉴定及生物学作用的观
察 。
一 、 水溶性多糖的提取
红绿层孔菌子实体经干燥 、 粉碎后 , 在 90 一 10 0 ’ C 蒸馏水中提取 3 一 4 小时 。 用八
层纱布过滤 , 残渣重复提取 3 次 。 合并提取液 , 60 ℃ 水浴浓缩至小 体积 , 加 3倍乙 醉 沉
淀。 醉析物干燥后按 2 % 浓度加水溶胀歹磁力搅拌 6 小时 , 3 0 0 0 : . p . m 离心 20 分钟 ,
收集上清液浓缩后加肠% 乙醇至醇浓度达 60 % , 收集沉淀 , 经 95 % 乙醇 、 无水乙醇 、 乙
醚依次股水干燥得红绿层孔菌粗多糖 , 收率为5 . 6% 。 将该多糖 (约 10 飞翔 .) 加 Z N H : 8 0 ` ,
充氮气封管 , 10 0℃水解 8 小时 。 水解液经碳酸胡中和 , 浓缩后点样于层析 纸上 。 _七行
层析 , 用正丁醉— 乙酸— 水 (4 ` 1 胜5 ) 上层展层 , 苯胺邻苯二 甲酸显色 。 根 据标准单糖在相同条件下的层析图谱 ,对多糖组份定性 ` . ’ 。 另取 3m ; , 红绿层孔菌粗多糖加H OI
DOI : 10. 16163 /j . cnki . 22 -1123 /n. 1987. 04. 026
东 北 师 大 学 报 自 然 科 学 版 9 8 17年
一甲醉 , 充氮气封管 , 于 80 ℃反应 1 6小时 , 甲醇解样品经中和与三 甲基硅烷衍生化后 ,
进行气相层析 〔 咭 , ” ’ ( s p 一 5 01 型气相色谱仪 、 氢焰离子化检测 器 , Zm x 4m m 不锈钢
柱 , 担休 为 C h r o m ot or b G A w 一 DM 0 3 60 一 80 目 , 3% S E一 30 为固定液 , 柱 温 为
l “ ℃ , 氮气做载气 , 流速为 65 m l/ 分钟 ) 。 纸层析与气相层析的结果均表明该多糖含
D 一葡萄糖 、 D一半乳糖、 D一甘露糖和 I J一岩藻糖。
二 、 多糖的分离与纯化
用凯氏定氮法 测得红绿层孔菌粗多糖含蛋白质 1 6 . 9% 。 先以链霉蛋白酶脱蛋白一次
(按 1% 蛋白量加酶 , 二甲苯封 口 、 37 ’ C保温 48 小时 ) 再按 .S 一 v 二卿 法 〔 6 ’ 加入正丁 醇 :
熟仿 ( 4 : 1) 混合溶剂 , 一 f 振荡器上剧烈振播 3 一 4 小时 。 离心去蛋白质 , 水层按上 述
方法重复多次 , 至有机相无蛋白沉淀时为止 。
脱蛋白的红绿层孔菌粗多糖先经 D E A E一好维素 ( O H 一型 ) 柱层析 ` 盛’ (柱床体积
2 x 3 5 0 nI )
, 分别用蒸馏水 , 0 . I N免 o H o . S N N a O N洗脱 , 流速为 4二 l / 10 分钟 , 自动分
部收集 。 各取单一洗脱峰合并 , 水洗 部分经醇析干燥后得白色粉末 , 简称 F p , 。 碱洗的
主要部分 , 0 . I N N 二 u H 洗脱组份 , 加 H C I 中和后 , 对蒸馏水透析两天 , 经浓 缩 醇析
后得含色素的棕色多糖 ,简称 F P : 。 将 F P : 和 F 尸 : 分别上样到琼脂糖 4 B柱上 ( 4 x 9 c5 m ) ,
用蒸馏水洗脱 , 流速为 12 0 1 /20 分钟。 用硫酸苯酚法检测多糖的高峰部位 , 合并浓缩至
小体积后 , 加 3 倍含 0 . 1% 醋酸钾之乙醇 , 沉淀如 前述方法脱水干燥 。 经两次柱层析纯
化后 , F P , 收率为 1 . 6% 、 F 护 : 收率为 28 . 4% 。
F 护: 、 F F : 经琼脂糖凝胶电泳 ` ” ( 卜H 8 . 6巴比妥— 巴比妥钠缓冲液 , 电压 2 1OV ,电 泳 40 分 钟 ) , 甲苯胺兰染色 , 各呈单一色带 (见图 1 ) 。 两组份经琼脂糖 4B柱层析
( l
.
s x g o “ 坦 ) , 硫 酸苯酚法检测各为一 单峰 (见图 2 ) 以上结果初步表明 , F护 : 与 F 护 :
为纯化多糖 。
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图 1 r P , 与 万 P Z 的琼脂摘凝胶电泳
第 4 张 丽 、铺 缘层孔菌多枷的 研究 I一F r :、 F P Z 的分离与鉴定
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图 2 r P : 与 r P : 的琼脂箱 4B 凝胶层析
将 F p : 与 F P : 分别加 H C I一甲醇 , 按前述方法进行气相层析 。 结果与标准单糖的
层析图谱相对照 , 以各峰面积之比计算多糖中各种单糖的摩尔比 。 结果表明r P : 合葡萄
糖 , 半乳糖 、 岩藻糖及甘露糖 , 其单糖摩尔比为 1 , 2 . 7 : 2 : 1 . 6。 F P : 只含葡萄糖 。
三 、 部分理 化性质的鉴定
1
. 分子筛法测分子量 〔 4 ’ : 样品 F 匕 与 F P : 分别上琼脂糖 4 B 柱 l( . 5 x 9 0。 。 ) 。
蒸魄水洗脱 , 流速为 .2 7 m l / 12 分钟 , 硫 .酸苯酚法检测多糖分布 。 结果发现 F护 : 洗脱体
积高峰在 1 24 毫升 , F F : 户5 6 . 7 毫升 。 用相同条件下已知分子量葡 聚糖制得的标准曲线
相对照 、 测得 F P ; 的分子量约为 .7 2万 。 F护 : 的分子量约为 1 76 万。
2
. 红外光谱分析 〔 . ’ : F P I在红外光谱指纹区 8 1 o o m 一 `与 8 7 o c m 一 ` 处有两小的吸
收峰 , 显示其具甘露糖组份的特征吸收。 F P Z在 8 1o c m 一 ’ 与 8 7 o c m 一 ’ 处无明显吸收峰 ,
什 1 0 0 0一 1 1 0 “ m 一 l 及 1 3 0。一 1 60 0 “ m 一 ’ 处 , F .l , E P : 的峰形及吸收强度也有明显差 异
(见图 3 ) 。
4
. 比旋光度测定 : F P : 含棕色色素可在H : O : 的缓慢作用 ` . ’ 下氧化脱色 。 脱色多
糖液对蒸馏水透析一昼夜 , 浓缩 、 醇析 、 干燥后同 F P , 一道用 W x G一 6 型 自 动旋光
仪按常规方法进行旋光测定 。 结果表明 , 两者比旋光度均为正值。 F P : 为 〔a 〕石. + 36 。
( C = o 一 2 , H : ( , ) , F p : 为〔a 〕石. + 4 , “ ( C = 0 . 1 6 , H : O ) 。
北 师 大 学 自 然 I洲 7年
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图 3 r P , 与 夕 P : 的红外吸收光谱 ( X B ; ) 图
3
. 紫外光 i普分析 : F P , 右一 28 0毫微米处无明显吸收峰 ,而 F P : 则有较强的吸收峰 ( 见
图 4 ) 与硫酸苯酚法测得 F P : 在 4的 lI lu 的糖吸收峰位相一致 , 此结果提示 F P Z具有结
合的蛋自质 , 是一种蛋白多糖 。
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图4 r P I 与 F 尸 , 的隽外吸收先谱分析 (虚线示多箱分布 )
第 4 期 张丽萍 : 红缘层孔菌多糖的研究 I一F r, 、 F P “ 的分离与鉴定
4
. 粘度测定 : 用奥氏粘度计于 20 ℃对 F P : 与 F P : (水溶液浓度同比旋度测定 ) 进
行粘度测定 。 结果为 F p : 刀· p o . 0 6 ; F p 必 s p o . 2 2。
5
. 溶解性质等 : F P ,易溶于水 , F P : 钓一冷水中膨胀 , 在热水中可溶 。 两者均不溶
于高浓度的乙醇及丙酮中 , F P , 与 F P : 均不与几一 K 一 l 试剂反应 , 与咔哩反应替为阴性 ·
四 、 对小鼠实验性肝损伤的保护作用
1
. 对小鼠血清转氨酶 ( 日出 T ) 含量的影响 〔 ”
将体重 20 一 2 克瑞士小白鼠随机分 为三组 , 每组 10 只 。 第 1组 为正常对照 , 第 2组
为四氛化碳中毒对照 , 第 3 组为给药组 。
给药组以 10 m到 k ` 体重的剂量 , 给小鼠灌胃红绿层孔菌粗多糖液 任企二次醇析 ,
未脱蛋白 ) , 每 日一次 , 连续给药 7 天 。 其余两组每 日灌胃同体积生理盐水 。
于末次给药后 24 小时 , 给药组 、 四氯化碳中毒对照组均按 10 m l lc/ g 体重剂量由腹
腔注射 。 . 1% C C I ; 豆油溶液 。 正常对照组注射同体积豆油 , 1 6小时后 , 对三组小白鼠
剑眼球取血 。 分离血清 , 按 K i飞 氏法测定谷丙转氨酶活性 , 结果见表 1 。
2
. 对磺澳酞钠 ( B 卜P ) 排泄的影响 ` ’ “ 〕
小白鼠分组 , 给药剂量及途径如前所述 。 连续给药 7 日 , 末次给药后 1 小时 , 2 ,
3 组腹腔注剔 0 . 1% C C I . 豆油溶液 ( 10 0 1/ 大g 体重 ) , 1 组注射同 体积豆油 , 16 小时
后 , 给每只小鼠由尾静脉注人 E E P ( 2 0。。 f’/ 玉g 体重 ) , 20 分钟后 , 刻 眼 球 取 血 制
血清 。 取血清 0 . l m l , 加 0 . ol N H o ls m l , 用 7 21 型分光光度计于5 20 h 二比色后 , 加入
ZN N a O只 1 滴再比色 , 以前后两次光密度之差代表血中 B S P 滞留量 (查 标 准曲线 ,
将 O D 值换算成 B卜P 含量 ) 测定结果见表 1 。
裹 1 红缘层孔菌多抽对刀C l ` 中毒小鼠 S G r T 含一及 B S P 排 泄的影晌
S (千P T ( u % )
M 士 S D l
,
B S P ( m g /d I
J
)
M士 S D
正 常 对 照 组 :
0 0 1` 中 毒 组
2 0 2 士 1 7 1 . 8 2士 0 . 4 2
3 3 6士 3 4 3 . 2 1上 0 . 5 8
夕冬于曰
门 .目 . . 口 . . 口 . . 川 阳
F 了 0 . 0 5组 …
P > 0
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05
2 1 7士 2 3 2 . 2 3士 0 . 3 7
S G rP r 和血 中 B S P 的滞留量在一定程度上可反映肝细胞损份的情况 。 由表中数据
可见 , 红绿层孔菌多糖对四氯化碳中毒小鼠肝脏 B S P 的排泄功能有较明显的促进作用 。
对因 C C I ` 中毒引起的 S ( ; P T 升高也有一定的抑制作用 。
东 北 师 大 学 报 自 然 科 学 版 198 7年
五 、 讨 论
红绿层孔菌在我省山区 , 特别是长白山区分布广 、 储量多。 从开发资源及我室多年
从事多糖研究的有利条件出发 , 首先从红绿层孔菌中提取水溶性多糖 , 并对该多糖有无
保护肝脏机能的生物学作用进行了初步的观察 。 已知 C C 1 4 进入动物机体后可直接进人
肝细胞斗 使肝细胞变性坏死 。 当肝细胞受损伤时 , 肝脏对 B S P 的 排泄机能降 低 , 血中
B S P 滞留量升高 , (S ; P 几r 的含量也升高 , 本次实验的结果提示 , 红绿层 孔 菌 多糖 对
C CI
. 造成的小鼠肝脏机能障碍具有一定的缓解作用 。 因此有必要对 该 多糖 组 份 、 结
构 、 性质等做进一步的研究 。 本文仅对初步分离出的两多糖 F P , 、 F P : 进行 了部 分理
化性质的鉴定。 关于 多糖的结构 、 生物活性等工作尚注进行 。
参 考 文 献
〔 1 〕
〔 2 〕
〔 3 〕
〔 4 〕
〔 5 〕
〔 6 〕
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〔1 0〕
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1
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第 4期 张丽萍 : 红缘层孔菌多糖的研完 I一F P , 、 F P : 的分离与鉴定 9 !
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妙 la o t o s e * f u e o s 。 : m a n n o s o i n F P i wa : 1 : 2 . 7 : 2 : 1 . 6 .
T加 m o l o o u l a r w e s沙七 o f F P , w a 7 1 , 0 0 0 a n d t ha t o f F P : , 2 7 6 0 , 0 0 0 .
T加 s e two f 公a c t i o n : s ho w o d d i f f o r e n 乞 v a l u 。 ; o r P r o护公 t l o 3 u n d o r 。双 -
m l n a t i o n , o f s OP
c i f i o O tP 主c a l 公 o七a t主o n , v 主: 。 o · i t y I R a n d U R .
A n i m a l o x护 r l m e n t 3 o ho 和 d t ha t wa t o r 一 s o l u b l e OP l y s a e c ha 了 i d o ,
f r恤 F om a , iP n i c o al 秘 r e o f扣 。七i v e s n 主n h i b l七i n g t ho e l o v a t i o n o f
S G P T l o v o l 、 a n d rP恤 o t i n g t ho he r a t s o o l o a r a n 。 。 o f B S P i n m i e 〔
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