全 文 ：离子胁迫诱导洋葱鳞茎内表皮细胞凋亡*
李昊文
李鹏
印莉萍
(首都师范大学生命科学学院,北京
100037)
摘
要:
通过不同浓度离子胁迫诱导剂( NaCl、CaCl2 )对洋葱鳞茎内表皮细胞进行不同时间的处理, 发现0. 1
M、0. 5M 的 NaCl和 CaCl2处理 2小时即可诱导出细胞凋亡现象,随处理时间延长直至 10 小时,细胞核凋亡的形态
学变化和凋亡小体更加明显,基因组 DNA 降解更加梯状条带化。本实验对离子诱导的洋葱鳞茎内表皮细胞凋亡
现象做了较系统的描述,为植物细胞凋亡的研究及细胞凋亡实验教学提供了经济、快捷、有效的诱导方法。
关键词:
细胞凋亡
离子胁迫
洋葱
Apoptosis Induced by Ionic Stress in Endocuticle
Cells of Onion Squamous Bulb
Li Haow en
Li Peng
Yin Liping
( Col le ge of L i f e S ci ence , Cap ital N ormal Univ ersi t y , B eij in g
100037)
Abstract:
Ionic stress ( NaCl, CaCl2 ) caused apopto sis in endocuticle cells of onion squamous bulb only w ithin
two hour s by different concentrat ions ( 0. 1M and 0. 5M respectiv ely) . W ith ex tending tr eat ment in NaCl, CaCl2 ( 2
to 10 hours) , the cell nuclei w ere highly v acuolated and DNA w ere g reatly fragmented in endocuticle cells. M ean

w hile, the apopto sis body and DNA ladder could be clearly observ ed like animal cells. T his paper made det ailed de

script ion about plants apoptosis inducted by ionic str ess. We could like to pro vide an economica l, speedy and effec

tive method for t he apoptosis r esear ch and experimental teaching .
Key words:
Apopto sis
Ionic stress
Onion
细胞凋亡( apoptosis)是细胞受到内、外因子刺激后发生的由基因调控的生理性死亡行为, 是一个主动和
高度有序的过程。细胞凋亡对生物体的生长发育有着重要的作用。近年来, 它已成为生命科学的热点研究
领域,并取得许多突破性进展。迄今已发现许多与凋亡相关的基因及蛋白 [ 1] , 对凋亡的分子机制及信号转
导[ 2, 3]也有了深入研究。
细胞凋亡的研究最早始于对动物的研究。植物细胞由于覆有细胞壁, 难于操作与检测。因此,凋亡研究
相对起步较晚。现在许多研究证明,植物中也普遍存在凋亡现象,如植物正常生长发育过程(胚的发育, 导管
筛管的形成,根、茎、叶的发育等) , 对环境的胁迫反应, 及被病原体侵入引起的超敏反应( hypersensit ive re

sponse, HR) [ 4]中等。
本实验以洋葱鳞茎内表皮细胞为材料,以不同浓度 Ca2+ 和 Na+ 作为凋亡诱导剂,得到明显的诱导效果,
观察到大量凋亡小体和较清晰 DNA梯状条带( DNA ladder)。与以往报道的植物细胞中凋亡小体及 DNA
ladder 不易观察相比较是一个长足的进步。特别是在本实验中, 2h 就出现了细胞凋亡的形态学变化,处理
时间延长至 10h,大部分细胞发生了凋亡。本实验的诱导方法具有取材方便、重复性好、高效、省时且经济等
特点。
收稿日期: 2005
10
21

* 基金项目:首都师范大学精品课建设基金资助
作者简介:李昊文( 1983
) ,女,现为中国农业科学院生物技术研究所生物化学及分子生物学专业攻读硕士研究生
通讯作者:印莉萍,教授,博士生导师,电话: 010
68901692,传真: 010
68981191, E
mail: yinlp@ mail. cn u. edu. cn

生物技术通报

研究报告
          BIOTECHNOLOGY
BULLETIN







2006年第 1期
1
材料与方法
1. 1
实验材料
洋葱鳞茎内表皮
1. 2
实验方法
1. 2. 1
预处理及洋葱鳞茎内表皮细胞凋亡的诱导
取新鲜洋葱室温下于清水中培养数小时,使其活化。自
培养好的洋葱鳞茎上切取 1 cm2左右的内表皮若干,分成三组。第一组是正对照, 为正常细胞。第二组是试
验组,分四管, 每管 10片洋葱内表皮,分别于 0. 1 M NaCl; 0. 5 M N aCl; 0. 1 M CaCl2 ; 0. 5 M CaCl2中培养。
第三组是负对照,为煮沸 5 min的坏死细胞。
1. 2. 2
细胞凋亡的形态学观察
分别于 2、4、6、8、10 h 取样,改良苯酚品红染液染色 20 m in后制片。观察
细胞形态变化, 照相,并对试验组细胞进行凋亡计数统计。
1. 2. 3
DNA 梯状条带的检测
CTAB法提取洋葱鳞茎内表皮细胞总 DNA [ 5]。在 1. 2%琼脂糖凝胶, 75 V
电压条件下电泳, 45 m in 左右,紫外灯下观察并照相。
2
结果与分析
2. 1
细胞凋亡的形态学变化
未经处理的正对照组,细胞膜完整,细胞核呈球形、染色均匀,细胞质均匀透明 (图 1
a)。经煮沸处理 5
min的负对照组, 细胞壁、细胞膜裂解,细胞核有裂解现象,细胞质内分布有不均匀碎末状物质, 细胞内物质
外溢,不能保持细胞的完整性 (图 1
b) 。
据实验观察,经 0. 1 M NaCl, 0. 5 M NaCl, 0. 1 M CaCl2 , 0. 5 M CaCl2处理的洋葱内表皮细胞,均能诱导
产生凋亡现象。随处理时间的增长,凋亡细胞数目大大增加,凋亡的形态学变化也越来越明显。本文就 8h
后四种处理的细胞形态作简要描述(表 1)。如果继续延长处理时间,凋亡现象更加明显,但同时坏死细胞数
量大大增加。细胞膜破损,细胞核裂解,细胞内含物外泄,不能保持细胞完整性。
表 1
四种处理的细胞凋亡形态学描述
处理 凋亡形态学描述
NaCl 0. 1
M 细胞轻度质壁分离,细胞的染色质大都浓缩,边缘化。大部分细胞核呈长条形,处于细胞的边缘,有些细胞
核呈不规则形状。(图 1
c)
0. 5 M
质壁分离现象明显,细胞膜皱缩,细胞质浓缩,胞质内分布有不均匀的块状物。细胞核内出现许多泡状结构
(图 1
f ) ,染色质浓缩聚集,凝聚的染色质与细胞质成分包裹在一起,形成较多的近球状凋亡小体。
CaCl2 0. 1 M
细胞轻度质壁分离,细胞的染色质聚集呈块状,边缘化。有些细胞胞质浓缩。大部分细胞核呈不规则形状(梅
花样细胞核,图 1
e) ,有些细胞核呈长条形,紧贴细胞膜分布。出现少量凋亡小体。
0. 5 M
质壁分离现象明显,细胞膜明显皱缩,细胞质高度浓缩。核内染色质明显浓缩,细胞核内出现许多泡状结构,
有些细胞细胞核消失,形成大量凋亡小体(图 1
d)。也有部分细胞呈坏死状态,不能保持细胞完整性。
2. 2
细胞凋亡计数统计
0. 1M CaCl2 ; 0. 5M CaCl2 ; 0. 1M NaCl; 0. 5M NaCl处理的洋葱鳞茎内表皮于 2、4、6、8 h 取样、制片。
每种处理各选取三个视野,统计总细胞数和凋亡细胞数(以细胞核染色质出现明显的边缘化凝集为标志) ,计
算凋亡率( %) = (凋亡细胞数/总细胞数)
100%。以处理时间为 X 轴,凋亡率为 Y轴作图。
2. 3
细胞凋亡的生化鉴定
凋亡细胞的形态变化往往伴随染色质 DNA 的断裂。细胞凋亡时,染色质 DNA在 Ca2+ 和 Mg2+ 依赖性
核酸内切酶作用下,在核小体单位之间被随机切断, 形成 180bp~ 200bp或其整数倍的寡聚核苷酸片段。经
琼脂糖凝胶电泳后, DNA 梯带状分布,电泳图谱表现为 DNA ladder。能否形成 DNA ladder 是细胞是否发
生凋亡的一个重要指标。而当受到外界极端刺激引起细胞坏死时,常由细胞损伤因子引起 DNA 无规律的
70







生物技术通报 Biotechnology
Bullet in







2006年第 1期
断裂,在琼脂糖凝胶电泳上呈模糊的弥散状条带。
图 1
不同处理的细胞形态变化

a. 未经处理的细胞(正常细胞)









b. 煮沸 5 min处理的细胞(坏死细胞)

c. 用 0. 1M NaCl 处理 8 h的细胞(凋亡细胞) d. 用 0. 5M CaCl 2处理 8 h的细胞(凋亡细胞)

e. 用 0. 1M CaCl2处理 8 h的细胞(凋亡细胞) f. 用 0. 5M NaCl处理 8 h的细胞(凋亡细胞)
图 2
不同处理洋葱葱鳞茎内表皮细胞凋亡率
注:各种处理如图示;虚线示观察过程中统计的未处
理洋葱鳞茎内表皮细胞自身的凋亡率;每组实验
平行重复三次,图示凋亡率平均值和标准差
正常细胞 DNA 电泳后为一条明显主带,分子量较大, 是
较完整的基因组 DNA。煮沸处理的细胞 DNA 完全降解, 电
泳为模糊的弥散状条带,说明 DNA 发生无规则断裂, 为坏死
状态。图 3中的 3~ 6泳道为离子胁迫诱导剂处理的细胞的
DNA 电泳图, DNA 发生特异性断裂, 均表现为较明显的
DNA ladder。
大部分植物细胞凋亡诱导剂都具有细胞毒性, 诱导凋亡
的同时也损伤细胞。离子胁迫诱导剂在诱导细胞凋亡的同
时,也可能使细胞产生坏死, 电泳产生弥散带。因此, 在图 2
的 3~ 6泳道中,细胞凋亡与细胞坏死并存,可能造成 DNA 梯
状条带不十分清晰。
3
讨论
3. 1
试材的选择
试材是研究工作成败的关键, 动物细胞凋亡的成功始于
线虫,而植物中一直没有很得心应手的试材。目前人们多采
用细胞核或原生质体(烟草、胡萝卜等) [ 6, 7] , 材料获得较繁锁,细胞凋亡的诱导时间很长( 24~ 48h) ,并且凋
亡小体和 DNA ladder 也不易观察。本实验以洋葱为材料, 在短时间内观察到较明显的凋亡现象。实验证
明植物细胞凋亡时确实出现了一些类似动物细胞凋亡的形态学特征,即细胞膜皱缩, 细胞核固缩, 核染色质
聚集,形成凋亡小体等。在生物化学变化方面,植物与动物细胞凋亡也具有一定的相似性, 可以诱导出较明
显的 DNA ladder。
3. 2
NaCl、CaCl2等诱导细胞凋亡的可能机理
NaCl、CaCl2等离子胁迫剂能刺激线粒体外膜上的受体,使线粒体膜通透性改变孔( M itochondr ion per

meability t ransition por e, PT 孔)不可逆性开放,线粒体跨膜电位的消失,线粒体通透性增高,从而导致细胞
712006年第 1期







李昊文等:离子胁迫诱导洋葱鳞茎内表皮细胞凋亡
图 3
不同处理的细胞 DNA电泳图谱
M
DNA 标准分子量
1
未经处理的细胞(正对照)
2
煮沸 5min处理的细胞(负对照)
3
0. 1M NaCl 处理 10 h
4
0. 1M CaCl 2处理 10 h
5
0. 5M NaCl 处理 10 h
6
0. 5M CaCl 2处理 10 h
色素 C( Cyt C)、凋亡诱导因子( AIF)等促凋亡物质的释放,
最终导致细胞凋亡[ 8] 。
目前的研究表明, 在许多细胞凋亡过程中, 都伴随胞内
自由 Ca2+ 的大幅增加, 特别是在凋亡早期, Ca2+ 往往表现出
急剧增加, 提示 Ca2+ 可能是启动细胞凋亡的早期信号 [ 9]。
细胞内、外的一些凋亡因子,可能激活内质网、线粒体上的钙
通道,使其中的 Ca2+ 大量释放, 并打开质膜上的钙通道, 使
胞外 Ca2+ 内流, 导致细胞质内 Ca2+ 增加, 进而诱导细胞凋
亡[ 10]。而 Ca2+ 依赖的凋亡信号途径又可以被高盐( NaCl)
所诱导。本实验中 CaCl2中的 Ca2+ 可能通过细胞质膜上的
钙通道进入细胞质, 使细胞质内 Ca2+ 浓度急剧增加,从而高
效诱导细胞凋亡。并且, Ca2+ 还能激活相应的核酸内切酶及
参与凋亡相关信号的转导等[ 11]。因此 CaCl2对凋亡的诱导
效率比单纯的盐胁迫剂 NaCl略高。
3. 3
结论和展望
经过实验得出, 在一定范围内,随处理时间延长和处理
浓度增加,细胞凋亡率大大提高。但如果继续延长时间或增
加浓度,坏死细胞数目也会随之增加。
细胞凋亡在植物正常生长发育过程及对各种环境胁迫
产生的反应中都有着重要作用。对植物细胞凋亡进行研究,
将有助于进一步了解植物生长发育过程中正常的细胞死亡
现象,对植物的抗病和抗逆境研究, 提高农产品的品质和质
量等的具体应用具有重大意义。
参 考 文 献
1
张莹,丁明孝. 细胞生物学杂志, 1997, 19( 4) : 158~ 164.
2
孔建强,赵琦. 生物技术通报, 2002( 3) : 15~ 18.
3
Thornb ery NA, Lazebn ik Y. Caspases : enem ies w ithin Science, 1998, 281: 1312~ 1316.
4
杨征,蔡陈峻,宋运淳. 生物化学与生物物理进展, 1999, 26( 5) : 439~ 443.
5
印莉萍,等.分子细胞生物学实验技术,北京:首都师范大学出版社, 2001, 13.
6
孙英丽,赵允,刘春香,等.植物学报, 1999, 41( 4) : 379~ 383.
7
李艳红,马小娟,柴小清. 首都师范大学学报, 2002, 23( 4) : 60~ 63.
8
浦雪艳,高洪,段纲. 动物科学与动物医学, 2003, 20( 8) : 37~ 39.
9
Xu H, H eath MC. Plant Ce11, 1998( 10) : 585~ 597.
10
刘欣梅,项黎新,邵健忠,等.细胞生物学杂志, 2004, 26( 3) : 235~ 240.
11
C hen HM, Yan CH , Dai YR, et al . Cell Mol Life Sci, 1999, 55( 2) : 303~ 309.
《生物技术通报》征订 2006年刊物和广告
邮发代号: 18- 92



定介: 10. 00元



全年定价: 60. 00元
电话: ( 010) 68919925(可传真)






电子信箱: bio tech@ mail. caas. net . cn
地址: 100081

北京中关村南大街 12号

中国农科院信息所《生物技术通报》编辑部
72







生物技术通报 Biotechnology
Bullet in







2006年第 1期