全 文 ：小金海棠总 RNA提取方法比较及 cDNA的 LD-PCR扩增
张玉刚 成建红 韩振海 许雪峰 李天忠
(中国农业大学农学与生物技术学院,北京 100094)
摘 要: 用 CT AB 和 SDS-酚两种方法提取了小金海棠根的总 RNA, 以 CT AB 法提取的总 RNA 为模板, 用
长距离 PCR( LD-PCR)的方法合成了双链 cDNA 并进行了扩增。结果表明, CTAB 法比 SDS-酚法提取的总 RNA
纯度高、完整性好, 宜于进行 RT- PCR和 cDNA 文库的构建, SDS-酚法操作简单易行, 提取产物可以直接用于转膜
进行 Nort hern 杂交。
关键词: 小金海棠 总 RNA 分离提取 LD-PCR
Comparison of Methods for Total RNA Isolation fromMalus
Xiaoj inensis and cDNA LD-PCR Amplification
Zhang Yugang Cheng Jianhong Han Zhenhai Xu Xuefeng Li T ianzhong
( Col l eg e of Ag r onomy and Biotech nology , China Ag ri cul tural Univ er si t y , B ei j ing 100094)
Abstract: The total RNAs fr om roots o f Malus x iaojinensis w ere isolated by the methods o f CTAB and SDS-
Pheno l. U sing the CTAB method, double- strand ( ds) cDNA w as synt hesized and amplified by Long-D istance( LD)
PCR. The results show ed that CT AB method is mo re suitable than SDS-Pheno l for iso lating to tal RNA o f M alus x-i
ao jinensis, the CTAB method ex tracted mo re integr ative and higher pur ity RNA for RT-PCR and cDNA libr ary con-
struction , the procedure of SDS-Pheno l method is more simple fo r isolat ing the RNA used to t ransfer ring to nylon
membrane fo r Nor thern blot.
Key words: Malus x iaoj inensis To tal RNA Iso lation LD-PCR
小金海棠 (Malus x iaoj inensi s Cheng et Jiang )是近年来筛选出的一个高效抗缺铁胁迫基因型苹果
种[ 1]。提取高质量的小金海棠总 RNA 合成 cDNA, 是构建小金海棠根系缺铁条件下的 cDNA 文库以及筛
选、克隆根系缺铁情况下特异表达或增强表达铁高效基因的前提和基础。目前提取 RNA 的方法常用有异
硫氰酸胍法 [ 2, 3]、T rizo l试剂盒、热酚法[ 4]等,由于多年生果树中含有大量的多糖和多酚等物质[ 5] , 用以上方
法很难获得高质量的 RNA。本实验在参照他人研究基础上 [ 6~ 9] ,经过不断摸索和方法改进, 首先用 SDS-酚
法提取出了质量较好的根系总 RNA,又进一步借鉴了 CT AB法获得了纯度高、完整性好的目的 RNA, 以此
继续进行 LD-PCR合成了双链 cDNA,成功构建了小金海棠根系缺铁条件下的消减 cDN A 文库 [ 10] , 为小金
海棠铁高效基因的克隆打下了基础。
1 材料和方法
1. 1 材料
实验用小金海棠种子采自北京市林果所。2002年 9月在中国农业大学果树分子生物学实验室播种,水
培苗长至 6~ 7片真叶时进行缺铁胁迫处理( EDTA-Fe2+ , 4Lmo l/ L, 其它元素与完全营养液相同) ,正常供铁
( EDT A-Fe
2+
, 40 Lmol/ L)为对照,处理后按不同时间段取白色新生根, 立即放入液氮冷冻,-80 e 冰箱中保
存备用。
收稿日期: 2005-04-26
作者简介:张玉刚( 1973- ) ,男,山东枣庄人,讲师,博士研究生,主要从事果树生物技术研究
通讯作者:韩振海
生物技术通报
#研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 4期
1. 2 实验方法
1. 2. 1 小金海棠根系总 RNA提取 ( 1) SDS-酚法 取小金海棠根 1g ,液氮研磨,立即加入 2. 5 m l酚/氯仿/
异戊醇( 25: 24: 1) ,再加入 2. 5 ml SDS提取 Buffer( 1% SDS, 10mMTris-HCl( pH8. 0) , 10 mM EDTA, 100
mM NaCl) ,振荡器上剧烈振荡 1~ 2min, 冰浴 5m in; 4 e 12 000rpm 离心 15min后, 转上清入新管,再加等体
积氯仿/异戊醇( 24: 1)抽提一次;取上清,加 2 m l异丙醇,-20 e 沉淀 20min; 12 000rpm 离心 10min;沉淀用
70%乙醇洗, 8 000rpm离心 5m in;沉淀凉干,溶于适量 DEPC水(无 RNase水) ,-70 e 保存。
( 2) CT AB 法 65 e 预热 CTAB 提取 Buffer ( 2% ( w/ v ) CTA B, 2% ( w / v) PVP, 10mM Tris-HCl( pH
8. 0) , 25 mM EDT A, 2. 0mM NaCl, 0. 5g/ L 亚精胺( sperm ide) , 1% B-巯基乙醇(用前加) ) ; 取小金海棠根
1g, 液氮研磨, 迅速加入预热好的 Buf fer, 涡旋振荡 30~ 60 sec, 65 e 水浴 10 m in,期间振荡摇匀 1~ 2次,加
入等体积氯仿/异戊醇( 24: 1) ,振荡摇匀,冰浴 10 min; 4 e 10 000 rpm 离心 10 min; 取上清液,加入等体积氯
仿/异戊醇( 24: 1) ,振荡摇匀, 冰浴 10 min; 4 e 10 000 rpm 离心 10 m in, 取上清液, 加入 1/ 3 体积的 10M
LiCl混匀, 4 e 沉淀 6~ 8 hr ; 4 e 10 000 r pm 离心 20 min, 弃上清, 1ml 0. 5% SDS 溶解沉淀,加入等体积氯
仿/异戊醇( 24: 1)抽提一次, 冰浴 10 m in; 4 e 10 000 rpm 离心 10 min, 取上清, 加入 2 倍体积无水乙醇,-
70 e 沉淀 30 m in; 4 e 10 000 rpm 离心20 min, 弃上清;沉淀用 75%的乙醇洗涤, 4 e 7 500 r pm 离心20 min;
凉干沉淀 5~ 8 min; 用适量无 RNase水溶解沉淀,-70 e 保存。
1. 2. 2 RNA样品纯度、浓度及完整性检测 取少许 RNA 样品稀释, 加入微量比色杯中, 用 UnicPC-2102
型紫外分光光度计测定 RNA 样品的 OD260、OD280、OD230值(以无 RNase 水为空白液调零) , 每样品重复 3
次,取其平均值。
1%的琼脂糖凝胶电泳检测样品 RNA 的完整性。
1. 2. 3 cDNA 合成与 LD-PCR扩增 按照 Clontech公司的 SMART TM PCR cDNA Synthesis kit 说明书进
行。
2 结果与分析
2. 1 小金海棠根总 RNA两种提取方法的比较
2. 1. 1 总 RNA纯度、浓度及完整性检测 SDS-酚法和 CT AB法提取的总 RNA 经过紫外分光光度计检
测,准确计算 RNA 的产率和纯度,其吸收值和产量见表 1。
表 1 小金海棠根总 RNA不同提取方法纯度及产率比较
RNA 提取方法 OD260 / OD230 OD 260 / OD 280 RNA 产率(Lg/ g)
SDS-酚法 1. 47 1. 54 60
CTAB法 2. 32 1. 86 95
高质量 RNA 溶液的 OD260 / OD280值应
介于 1. 7~ 2. 0 之间, OD260 / OD230值应大于
2. 0。表 1结果中 CT AB 法提取的总 RNA
值分别为 1. 86和 2. 32, 均在此范围, 表明此
法提取的 RNA 具有相当高的纯度,而 SDS-酚法提取的 RNA 样品 OD260 / OD280值较小,为 1. 54,表明样品中
有蛋白或苯酚存在, 且 OD260 / OD230值远小于 2. 0,显示样品中含有大量的小分子物质或盐类物质存在。
2. 1. 2 总 RNA 的完整性检测 两种方法所获得的总 RNA 经 EB 染色, 1%的琼脂糖凝胶电泳, 紫外光检
测结果显示 28S和 18S条带清晰整齐。SDS-酚法提取的RNA 28S: 18S大约为 1: 1,有较亮的 5S 条带, 点样
孔有少量的蛋白质污染; CTAB 法提取的 RNA 28S: 18S大致为 2: 1,无明显的 5S条带, 总RNA完整性和纯
度较高(图 1)。
2. 2 小金海棠 cDNA 的合成与 LD-PCR扩增
采用 Clontech 公司的 LD-PCR 方法, 以 CTAB 法提取的小金海棠根总 RNA 为模板, 利用引物
SMART II A Oligonucleot ide 和 3cSMART CDS Primer II A 在反转录酶作用下首先合成两端带有接头的
cDNA ,通过特定引物 5 PCR Primer II A 继续合成并扩增双链 cDNA。实验进行了 PCR 15、18、21、24个循
512005年第 4期 张玉刚等: 小金海棠总 RNA 提取方法比较 cDNA 的 LD-PCR扩增
图 1 小金海棠根总 RNA的鉴定
1为正常供铁 ( E DT A-Fe2+ , 40 Lmol/ L) 小金海棠根总
RNA
2为缺铁( EDTA-Fe2+ , 4Lm ol / L)小金海棠根总 RNA
环的优化摸索, 图 2第一泳道显示 PCR第 15个循环几乎无明
显扩增产物,第 18个循环出现了较清晰的弥散带,产物大小主
要集中在 300~ 3 000bp之间, 21和 24个循环数的扩增产物几
乎无明显的增加,从而确定 17个循环数为小金海棠根总 RNA
ds cDNA PCR扩增的最优循环参数。
3 讨论
3. 1 两种小金海棠根总 RNA提取方法的比较分析
RNA 酶在细胞中是区隔化存在的, 细胞中大约 70% ~
80%的 RNA 酶活性存在于液泡中[ 11] 。当细胞破碎后, RNA
酶会释放出来, 在没有防护措施的情况下, RNA 会被 RNA 酶
迅速降解。所以在提取植物组织 RNA 的过程中, 选择合适的
变性剂抑制 RNA 酶的活性是试验成功的关键。SDS 是一种
阴离子去污剂, 能破碎细胞, 使核蛋白体解聚,释放核酸, 同时
对 RNA 酶和 DNA 酶有抑制作用。但 Chir gw in等认为 SDS-
图 2 LD-PCR双链 cDNA的合成
M DNA Maker. 1、2、3、4 分别为 15、18、
21、24个 PCR 循环次数扩增的双链 cDNA 条
带
酚不足以使 RNA 酶迅速变性以防止 RNA 酶的降解[ 12] , 从试验结果
看, CT AB法提取的 RNA 纯度与产率都较 SDS-酚法高,表明 CTAB
对蛋白质的变性效果的确明显优于 SDS法。
在沉淀剂的选择上, SDS-酚法采用的是异丙醇沉淀, CT AB 法选
择 LiCl和无水乙醇进行了两次沉淀。从产物的电泳效果看, L iCl能
够沉淀出较多大分子量的 RNA, 沉淀的较为彻底, 所需沉淀时间较
长;异丙醇沉淀速度较快, 但是产物含有较多的 5S RNA 和少量的杂
蛋白。
本实验所用的小金海棠在水培条件下进行了缺铁处理,逆境增加
了根中酚类和多糖物质的含量。提取过程中酚类物质氧化成醌后很
容易与 RNA 结合, 形成难溶的沉淀, 使 RNA 提取更加困难[ 13] 。
CT AB方法在 RNA提取过程中加入了 PVP 和 B-巯基乙醇, 可以有效
的抑制多酚的氧化, 从而容易获得质量较高的目的产物。
综上所述, CTAB法比 SDS-酚法提取小金海棠根总 RNA 更为适
合,提取的总 RNA 纯度高、完整性好,可以进一步进行 RT-PCR 和 cDNA 文库的构建; SDS-酚法简单易行,
提取的 RNA 可用于转膜进行 Norther n杂交,是一种方便快捷的 RNA 提取方法。
3. 2 LD-PCR是合成双链 cDNA 的有效手段
cDNA 合成方法依赖于在第一链合成中 mRNA 反转录成单链 cDNA 的能力。对于长链 mRNA,特别
是当第一链的合成仅由 olig o( dt) 做引物, 或 mRNA 有一个稳定的二级结构时,基因 5c端在常规 cDNA 合
成中不能完全获得转录。实验用 Clontech公司的 SMART cDNA合成技术, 一个 5c端带有限制性酶切位点
的 oligo ( dt )引物( the 3c SMART CDS Primer Ⅱ A)引导了第一链的合成反应。当 mRNA 5c端反转录时,
酶的末端转移活性在其 3c末端附加了一个 oligo C3序列。反转录转换模板, 引物 SMART Ⅱ A o lig onucle-
o tide 3c端的酶切位点后带有一 olig o G 3序列与 olig o C3互补, 转录后构成了一个两端延伸扩大的模板。
SMART 的锚定序列及 poly A 序列作为随机引物的位点用于两端 cDNA 的扩增, 结果包含 mRNA 完整 5c
末端以及被补充到 SMART 寡聚核苷酸的序列得到了全长转录。通过 SMART cDNA 合成技术, 样品
RNA 中最大量的 mRNA 得到了尽可能的全长序列扩增, 其产物还有利于建库时双链 cDNA的连接转化。
52 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 4期
本实验还对 LD-PCR条件及循环数进行了优化, 为避免非特异性扩增确定 17个循环数作为小金海棠
根总 RNA双链 cDNA PCR扩增的最优循环参数,合成的 ds-cDNA 大小主要集中在 300~ 3 000bp 之间,符
合实验的要求, 并以此进一步构建了缺铁条件下小金海棠根系抑制性消减 cDNA 文库 [ 10]。
参 考 文 献
1 H an ZH , Xu XF. Annual Review of Hort icu ltural S cience, 1995, ( 1) : 1~ 16.
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3 张玉进,孟祥春,潘瑞炽,等. 植物学通报, 2001, 18( 6) : 722~ 726.
4 郑军.玉米幼苗水分胁迫相关基因的克隆与分析[博士学位论文] .中国农业大学, 2004, 18.
5 曹秋芬,孟玉平,孙毅. 农业生物技术学报, 2003, 11( 4) : 428~ 429 .
6 刘志,杨永华. 生物技术通讯, 2004, 15( 4) : 372~ 373.
7 李玉英,王转花,张政.生物技术, 2004, 14( 3) : 23~ 24.
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9 杜希华,陆海,高述民,等. 北京林业大学学报, 2003, 25( 1) : 10~ 13 .
10 张玉刚, 许雪峰,韩振海,等. 中国农学通报, 2005, 21( 3) : 77~ 80.
11 Green P. J Plant Mol Biol, 1994, 45: 421~ 445.
12 C hirgw in JM , Przybyla AE, MacDonale RJ, et al. Biochem, 1979, 18: 5294~ 5299.
13 S chn eiderbau er A, S andermann H Jr, E rnst D. Anal biochem , 1991, 197: 91~ 95.
#国内信息 #
菊花转抗虫基因植株的 PCR快速鉴定
华中农业大学园艺与林学学院蒋细旺和包满球教授用 PCR法快速鉴定了菊花转抗虫基因植株。他们
对经过卡那霉素抗性筛选所得的菊花转苏云金芽孢杆菌蛋白 Bt 基因和转雪花莲外源凝集素 GNA 基因所
得的抗性植株, 利用改良 SDS 法提取菊花 DNA,然后利用 NPTII引物对 6个菊花品种的抗性植株所得出的
DNA 进行 PCR扩增, 发现了符合 NPT II 基因片段大小的亮带,初步证实获得了转 Bt 基因和转 GNA 基因
的菊花植株。
所得到的抗性再生植株分别为 Y 1172株, / 97180112株, 及 H3 83株; Y2 68株, /抗0162株, /紫066株,分
别用改良 SDS 法提取 DNA 进行 PCR检测后电泳,发现 Y1 和/ 97180中有的单株在 872bp和 603bp之间有
一明显亮带,即大小为 768bp,表明 N TPII 基因已整合进去,而同时其他再生植株在此区段无带, 这说明出
现了假转化体。
6个不同菊花品种用农杆菌法导入 GNA 基因后经卡那霉素筛选,得到的抗性再生植株分别为: Y 1176
株, / 97180110株 RH3 84株, Y 2 64株, /杭0136 株, /紫062株。提取 DNA 进行 PCR 检测后电泳,发现 Y1
和 RH 3 中有单株 1条 768bp大小的明显亮带,与阳性对照一致,表明 NPT II基因已导入同样再生植株也出
现了许多假转化体。这种现象,在菊花对卡那霉素是极为敏感的,实际上经卡那霉素筛选存活下来的再生植
株进行 PCR检测后发现,并非所有的存在非抗性和植株都转入了外源基因。这表明产生了较多假转化体,
它们没有整合进外源基因却逃脱了选择压力的影响,这种假转化体的产生是目前遗传转化实验中比较普遍
的现象。 秦春圃
532005年第 4期 张玉刚等: 小金海棠总 RNA 提取方法比较 cDNA 的 LD-PCR扩增