全 文 ：一种棉花线粒体 DNA的提取方法
胡建斌1, 2
黄晋玲1, 2
郭三堆1
( 1中国农业科学院生物技术研究所,北京
100081; 2山西农业大学,太谷
030801)
摘
要:
线粒体是重要的细胞器 ,它有自身的基因组。其基因组 DNA 与细胞核基因组 DNA 相比, 含量较
低。棉花当中富含棉酚、丹宁等物质, 这对提取 DNA 有很大的影响。因此我们根据棉花自身的特点,找到了一种
提取棉花线粒体 DNA 经济有效的方法, 其质量可以满足限制性酶切、PCR、分子杂交等实验的要求。
关键词:
棉花
提取
线粒体 DNA
AMethod for Extraction of Mitochondrial DNA from Cotton
Hu Jianbin
1, 2
Huang Jinling1, 2
Guo Sandui1
( 1Biotechn olog y R easearch I nst itut e of CA A S , B eij in g
100081;
2Shanx i Ag ri cul ture Univ e rsi ty , T aigu
030801)
Abstract:
The mitochondria l is impo rtant cell o rg an, w hich has its ow n genome. The amount of m itochondr ial
genome DNA in cell is few er than genome DNA of cell nucleus. T he cott on is abandous of g ossypol and t annin, and
these components can br ing larg e negativ e effection when w e ext ract DNA fr om mit ochondr ial. Acco rding to cot ton
s character we has found an effective method for ex traction of mito chondria l DNA from cotton, and the quality of m-i
to chondrial DNA go tten can be suitable for t he exper iments demand, such as r estr iction dig estion, PCR and mo lecule
hybridization.
Key words:
Cotton
Ex traction
M itochondrial DNA
线粒体是植物细胞的主要细胞器, 它是具有自身基因组的一定遗传功能结构、它能够自我复制、可编码
一些呼吸代谢过程中的重要酶成分。对许多高等植物细胞质雄性不育研究表明,线粒体与细胞质雄性不育
有密切关系。因此对它的研究也尤为重要。
植物线粒体 DNA 与核 DNA 相比,在细胞内含量甚微,提取过程中极易被核及叶绿体 DNA 污染, 而且
棉花富含棉酚、丹宁等特殊物质,棉酚含有酚基和羟基,是一类相当活跃的化合物,在植物组织细胞破碎时能
与核酸作用形成稳定的不可逆的复合物 [ 1]。因此,采用其它作物的常规方法,所提取 mtDNA 的效果较差。
作为棉花细胞质雄性不育分子生物学研究的一部分,在棉花 mtDNA 的提取上,我们查阅了大量文献,借鉴
了其它作物的 mtDN A提取方法[ 1~ 10]。在借鉴这些方法的基础上,考虑棉花本身的特点,我们找到了一条既
经济,适合一般实验条件又能获得高纯度和高分子量 mtDNA 的方法。
1
材料与方法
1. 1
材料
棉花晋 A细胞质雄性不育系。
1. 2
方法
1. 2. 1
材料的准备
将棉花晋 A的种子经浓硫酸脱绒后, 种在灭菌的营养土中, 31
黑暗培养 6~ 10天,
收取黄化苗植株备用。
收稿日期: 2005-07-21
作者简介:胡建斌: ( 1978- ) 男,研究方向:棉花分子育种工作
通讯作者:郭三堆,中国农业科学院生物技术研究所

生物技术通报

研究报告
          BIOTECHNOLOGY
BULLETIN







2005年第 6期
1. 2. 2
线粒体的制备
线粒体制备的关键是分离完整的细胞器和在高离子强度的介质中裂解细胞核。质
体通过低速离心被清除掉。整个操作必须在 2~ 4
条件下操作。
将收获的黄化苗组织和缓冲液 A ( 0. 05mol/ L Tris-Cl, 0. 5mo l/ L Sucrose, 0. 005mol/ L EDTA. N a2 ,
0. 1% BSA, 0. 005mol/ L
-巯基乙醇, 1%~ 2% PVP即聚乙烯吡咯烷酮, pH7. 5) ,以 1/ 4( W/ V)的比例混合;
经低速 5S 2次和高速 10S 3次匀浆后, 4层纱布过滤;
取上清液以 1 400g 离心 10m in,以除去质体;
将上清液转入新的离心管中, 16 000g 离心 35m in弃上清液;
将每管中沉淀再用缓冲液 B ( 0. 05mo l/ L T ris-Cl, 0. 3mol/ L Sucrose, 0. 01mol/ L M gCl2 , 1% PVP,
pH7. 5)悬浮;
软毛笔轻轻悬浮后, 16 000g 离心 20min,弃上清液;
将每管中沉淀再悬浮到缓冲液 C中( 0. 05mo l/ L T ris-Cl, 0. 3mol/ L Sucro se, 0. 01mol/ L M gCl2 ) ,加入
DNaseⅠ至终浓度 30
g / ml, 37
反应 40min, 以除去线粒体外的核 DNA;
用长针头注射器向管底缓缓注入 20ml缓冲液 D( 0. 01mol/ L T ris-Cl, 0. 6mol/ L Sucro se, 0. 002mo l/ L
EDTA. Na2 , pH7. 5) , 作成一个 step梯度,冰浴 30min,然后 16 000g 离心 20min,弃上清液;
沉淀再用 20ml缓冲液 D同前一样悬浮、洗涤、离心 2~ 3次,得到的沉淀即为纯净完整的线粒体。
1. 2. 3
线粒体的裂解
将线粒体悬浮在 3m l裂解液( 0. 02mo l/ L EDT A. Na2 , 0. 05mol/ L T ris-Cl, 2%
SDS)中,再加入 20mg / ml 的蛋白酶 K 至终浓度 500
g/ ml, 37
水浴中消化 90m in, 打开线粒体, 释放出
mtDNA,并加入 RNaseA以消化 RNA;
向消化液中加入 8mo l/ L NH 4Ac至终浓度为 0. 8mol/ L ,加入等体积的平衡酚, 充分混匀后, 12 000g 离
心 5min;
然后用氯仿:异戊醇( 24: 1)反复抽提至界面干净;
向水相中加入 1/ 10体积的 8mo l/ L NH 4A c,混匀后加入 2倍体积的预冷无水乙醇,-20
过夜;
12 000g 离心 20m in得沉淀,沉淀用 70%乙醇洗一次;
得到纯化的 mtDNA,溶于适量 TE 缓冲液,-20
保存备用。
图 1
棉花 mtDNA琼脂糖凝胶
电泳
1. 3
DNA 的检测
在 PE U V/ VIS spectrometer Lambda Bio40上, 测定 A 260和 A 280值, 并计
算 A 260 / A 280的比值以检测样品的纯度。并用 0. 8%琼脂糖凝胶电泳, 检测
DNA 提取情况。
2
结果分析
经 PE Lambda Bio40型紫外可见光光度计测定(表 1) ,其 A 260 / A 280的比值
为 1. 750,符合 A 260 / A 280经验比值在 1. 7~ 1. 9之间, DNA 纯度较高的要求。
mtDNA 样品用0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测,电压 1~ 6V/ cm , 3~ 6h。电泳观察
结果(图 1) , 所得条带在 21. 2kb 处。
3
讨论
提取的 DNA 质量的好坏会直接影响
限制性酶切、PCR、分子杂交等工作。
本实验采用暗箱培养的黄化苗作为提
取材料,可以有效的避免叶绿体 DNA 的
污染;在匀浆器中高速匀浆取代用液氮研
磨,可以避免线粒体的损伤。
表 1
棉花 mtDNA紫外分光光度分析
A 260 0. 457
A 280 0. 261
A 260/ A 280 1. 750
892005年第 6期









胡建斌等:一种棉花线粒体 DNA 的提取方法
棉花与其它植物相比,酚类物质的含量很高, 易被氧化并与 DNA 结合形成粘稠的褐色复合物 [ 11]。在我们的
实验当中,曾经产生了褐色的絮状不溶物。因此, 在提取 DNA 溶液 A 中, 加入了一定量的 PVP、
-巯基乙醇
和 BSA,可以很好地消除了色素杂质, 防止氧化。PVP 是一种酚结合剂, 能有效地结合棉花苗中的酚类物
质;
-巯基乙醇是抗酚类物质氧化的 [ 3] ; BSA 可提供一种环境介质的作用,也是起保护作用的。因此, 三者的
结合可以有效地减少棉酚、丹宁等特殊物质对 mtDNA 的伤害, 提高 mtDNA 的质量。在与大多数植物
mtDNA 提取的方法当中甘露醇作为渗压剂和 NaCL 作为匀浆缓冲液的渗压剂 [ 1]相比, 本实验选择 Sucro se
作为匀浆缓冲液的渗压剂,从表 1和图 1得知效果是比较好的。
以上研究表明, 本方法提取的棉花 mtDNA,其分子量、纯度和产量均较高, 可满足限制性酶切、PCR、分
子杂交等生物学研究工作,而且避开了高费用的氯化铯梯度超速离心过程,适用于普通实验室的操作。
参 考 文 献
1
王学德,朱军,朱英国.棉花学报, 1998, 10( 4) : 205~ 209.
2
李俊英,闻颖达,蒋嫦英,等. 南开大学学报(自然科学) , 2000, 33 ( 4) : 49~ 52.
3
殷剑美,张天真.分子植物育种, 2004, 2( 3) : 354~ 357.
4
涂珺,朱英国.氨基酸和生物资源, 1997, 19( 3) : 4~ 7.
5
陈学军,陈竹君,张耀洲,等.浙江大学学报(农业与生命科学版) , 2000, 26( 3) : 321~ 324.
6
Do
ce R, Bo
rg
ignon J, Bro
q
is se R, Ne
b
rgeg er M . Meth Enzymol, 1987, 148: 403~ 415.
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Kemble RJ. T heor Appl Genet , 1987, 73: 451~ 458.
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P
re C, Bonavent JF, Bervill
A. Plant Mol Biol Rept r, 1990, 8: 104~ 113.
9
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sh S, Danilenk o NG, Davydenk o OG. M ol Biol Rept r, 1998, 16: 183~ 189.
10
Wils on AJ, C ho
rey PS. Plant C ell Rep, 1984, 3: 237.
11
孙鑫,崔洪志,胡宝忠,等.生物技术通报, 2004, 5: 45~ 47.

国外动态

第一头克隆鹿在美诞生
AgBio tech 2004年 21卷 1期 9页报道: 美国得克萨斯农工大学兽医学院的科学家马克
韦斯特胡信及
其同事,最近首次成功地培育出世界上第一头克隆白尾鹿。这头小鹿是由一头借腹代育母鹿
甜豌豆
所产。
并根据一研究人员的姓名
Duane Kraemer
, 而将其命名为
杜威
( Dew ey)。克隆鹿的诞生日期原为 2003
年 5月 23日,但由于需要对这头克隆鹿进行 DNA分析,以确证亲本和后代在遗传上的等同性,所以直至最
近才公布这一消息。
在这头克隆鹿的培育过程中, 科学家们首先从一头已经死亡的雄性白尾鹿的皮肤样品中分离出成纤维
细胞,对其进行人工培养,并冰冻和保存于液氮。再从一头雌白尾鹿的卵巢中分离出卵母细胞,并将其置于
试管内培养成熟。最后由维亚金公司的科学家完成了细胞核移植和克隆胚的转移培育。
至此美国得克萨斯农工大学兽医学院,已成为世界上第一个克隆出包括牛、山羊、猪和猫以及最近的白
尾鹿等 5个物种的个体的研究机构。 汪开治
90





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