全 文 ：赠憎遭月基因对枯草芽胞杆菌 晕悦阅鄄圆菌株生物膜
形成和根际定殖能力的影响
郭庆港员 摇 吴园园员袁 圆 摇 李社增员 摇 鹿秀云员 摇 王洪港猿 摇 马摇 平员鄢
渊员援河北省农林科学院植物保护研究所袁 河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心袁 农业部
华北北部作物有害生物综合治理重点实验室袁 保定 园苑员园园园曰 圆援河北大学生命科学学院袁
保定 园苑员园园圆曰 猿援河北省黄骅市城市管理局袁 黄骅 园远员员园源冤
摘要院 为明确枯草芽胞杆菌 月葬糟蚤造造怎泽 泽怎遭贼蚤造蚤泽 晕悦阅鄄圆 菌株生物膜形成相关基因及其在生物膜形成尧根
际定殖中的作用袁采用转座子插入技术袁从 源 园园园 余株 晕悦阅鄄圆 突变子中获得 远 株生物膜形成能力降
低的突变子遥 在生物膜形成能力丧失的突变子 酝猿 中袁转座子以单拷贝的形式插入到 赠憎遭月 基因内
部遥 通过基因同源重组技术对 赠憎遭月 基因进行缺失突变袁获得 赠憎遭月 基因缺失突变菌株 晕悦阅鄄圆
渊驻赠憎遭月冤袁与野生菌株相比袁突变子丧失了生物膜形成能力遥 进一步比较发现袁突变菌株 晕悦阅鄄圆
渊驻赠憎遭月冤显著降低了在棉花根际的群体数量袁同时也降低了对棉花立枯病的防治效果遥 研究证明袁
赠憎遭月是 晕悦阅鄄圆 菌株生物膜形成途径中的重要基因袁且生物膜形成与 晕悦阅鄄圆 菌株根际定殖和生防
效果呈正相关遥
关键词院 枯草芽胞杆菌曰 生物膜曰 定殖曰 转座子
云怎灶糟贼蚤燥灶葬造 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 赠憎遭月 早藻灶藻 贼燥 贼澡藻 遭蚤燥枣蚤造皂 枣燥则皂葬贼蚤燥灶 葬灶凿 则燥燥贼
糟燥造燥灶蚤扎葬贼蚤燥灶 蚤灶 月葬糟蚤造造怎泽 泽怎遭贼蚤造蚤泽 泽贼则葬蚤灶 晕悦阅鄄圆
郧怎燥 匝蚤灶早早葬灶早员 摇 宰怎 再怎葬灶赠怎葬灶员袁 圆 摇 蕴蚤 杂澡藻扎藻灶早员 摇 蕴怎 载蚤怎赠怎灶员 摇 宰葬灶早 匀燥灶早早葬灶早猿 摇 酝葬 孕蚤灶早员鄢
渊员援 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻袁 匀藻遭藻蚤 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 葬灶凿 云燥则藻泽贼则赠 杂糟蚤藻灶糟藻泽曰 陨孕酝 悦藻灶贼则藻 燥枣 匀藻遭藻蚤 孕则燥增蚤灶糟藻曰 运藻赠
蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 陨孕酝 燥灶 悦则燥责泽 蚤灶 晕燥则贼澡藻则灶 砸藻早蚤燥灶 燥枣 晕燥则贼澡 悦澡蚤灶葬袁 酝蚤灶蚤泽贼则赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻袁 月葬燥凿蚤灶早 园苑员园园园袁 匀藻遭藻蚤
孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬曰 圆援 悦燥造造藻早藻 燥枣 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 匀藻遭藻蚤 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 月葬燥凿蚤灶早 园苑员园园圆袁 匀藻遭藻蚤 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬曰
猿援 月怎则藻葬怎 枣燥则 酝怎灶蚤糟蚤责葬造 阅藻泽蚤早灶 燥枣 匀怎葬灶早澡怎葬 悦蚤贼赠袁 匀怎葬灶早澡怎葬 园远员员园源袁 匀藻遭藻蚤 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 月葬糟蚤造造怎泽 泽怎遭贼蚤造蚤泽 晕悦阅鄄圆 蚤泽 葬 责造葬灶贼 遭藻灶藻枣蚤糟蚤葬造 遭葬糟贼藻则蚤怎皂 憎澡蚤糟澡 枣燥则皂泽 遭蚤燥枣蚤造皂 蚤灶 增蚤贼则燥 葬灶凿 蚤灶 责造葬灶鄄
贼葬援 陨灶 燥则凿藻则 贼燥 藻造怎糟蚤凿葬贼藻 贼澡藻 则燥造藻 责造葬赠藻凿 遭赠 遭蚤燥枣蚤造皂 枣燥则皂葬贼蚤燥灶 葬灶凿 蚤贼泽 葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿 早藻灶藻渊 泽冤 蚤灶 贼澡藻 则澡蚤扎燥鄄
泽责澡藻则藻 糟燥造燥灶蚤扎葬贼蚤燥灶 葬灶凿 遭蚤燥鄄糟燥灶贼则燥造 糟葬责葬遭蚤造蚤贼赠 燥枣 月葬糟蚤造造怎泽 泽怎遭贼蚤造蚤泽 晕悦阅鄄圆袁 葬 栽灶鄄员园 贼则葬灶泽责燥泽燥灶 皂怎贼葬灶贼 造蚤鄄
遭则葬则赠 燥枣 泽贼则葬蚤灶 晕悦阅鄄圆 憎葬泽 糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿 蚤灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠援 杂蚤曾 燥怎贼 燥枣 源 园园园 皂怎贼葬灶贼泽 泽澡燥憎藻凿 凿藻枣蚤糟蚤藻灶糟赠 蚤灶 遭蚤燥枣蚤造皂
枣燥则皂葬贼蚤燥灶援 栽澡藻 皂怎贼葬灶贼 泽贼则葬蚤灶 酝猿袁 憎澡蚤糟澡 憎葬泽 凿则葬皂葬贼蚤糟葬造造赠 造燥泽贼 贼澡藻 糟葬责葬遭蚤造蚤贼赠 燥枣 遭蚤燥枣蚤造皂 枣燥则皂葬贼蚤燥灶袁 憎葬泽 枣怎则鄄
贼澡藻则 泽贼怎凿蚤藻凿援 郧藻灶藻 赠憎遭月 憎葬泽 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤藻凿 憎澡蚤糟澡 憎葬泽 蚤灶泽藻则贼藻凿 遭赠 贼澡藻 贼则葬灶泽责燥泽燥灶 栽灶鄄员园 憎蚤贼澡 葬 泽蚤灶早造藻 糟燥责赠 蚤灶
皂怎贼葬灶贼 泽贼则葬蚤灶 酝猿援 粤 凿藻造藻贼蚤燥灶 皂怎贼葬灶贼 燥枣 赠憎遭月袁 皂怎贼葬灶贼 泽贼则葬蚤灶 晕悦阅鄄圆 渊驻赠憎遭月冤袁 憎葬泽 早藻灶藻则葬贼藻凿 贼燥 糟澡葬则葬糟鄄
贼藻则蚤扎藻 贼澡藻 则燥造藻 燥枣 赠憎遭月 蚤灶 泽贼则葬蚤灶 晕悦阅鄄圆援 悦燥皂责葬则藻凿 憎蚤贼澡 贼澡藻 憎蚤造凿 泽贼则葬蚤灶 晕悦阅鄄圆袁 皂怎贼葬灶贼 泽贼则葬蚤灶 晕悦阅鄄圆
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糟则藻葬泽藻凿 贼澡藻 葬遭蚤造蚤贼赠 燥枣 糟燥造燥灶蚤扎葬贼蚤燥灶 蚤灶 糟燥贼贼燥灶 则澡蚤扎燥泽责澡藻则藻 葬灶凿 糟燥灶贼则燥造 葬早葬蚤灶泽贼 糟燥贼贼燥灶 泽藻藻凿造蚤灶早 则澡蚤扎燥糟贼燥灶蚤葬
基金项目院 国家现代农业产业技术体系渊悦粤砸杂鄄员愿鄄员缘冤袁国家自然科学基金渊猿园怨园园怨远圆袁猿员圆苑圆园愿缘冤袁国家野愿远猿冶计划渊圆园员员粤粤员园粤圆园缘冤
作者简介院 郭庆港袁男袁员怨苑远年生袁副研究员袁研究方向为植物病害生物防治袁 耘鄄皂葬蚤造院 早择早苑苑岳 员远猿援 糟燥皂
鄢通讯作者渊粤怎贼澡燥则 枣燥则 糟燥则则藻泽责燥灶凿藻灶糟藻冤袁 耘鄄皂葬蚤造院 责蚤灶早皂葬愿愿岳 员圆远援 糟燥皂
收稿日期院 圆园员圆 原 园苑 原 员苑
第 源园 卷摇 第 员 期
圆园员猿 年摇 圆 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源园摇 晕燥援 员
云藻遭援 摇 圆园员猿
摇 摇 凿葬皂责蚤灶早鄄燥枣枣援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 糟燥灶枣蚤则皂藻凿 贼澡葬贼 赠憎遭月 憎葬泽 葬灶 蚤皂责燥则贼葬灶贼 早藻灶藻 葬皂燥灶早 遭蚤燥枣蚤造皂 枣燥则皂葬贼蚤燥灶 责葬贼澡憎葬赠 蚤灶
泽贼则葬蚤灶 晕悦阅鄄圆援 陨贼 憎葬泽 泽怎早早藻泽贼藻凿 贼澡葬贼 遭蚤燥枣蚤造皂 枣燥则皂葬贼蚤燥灶 憎葬泽 责燥泽蚤贼蚤增藻造赠 糟燥则则藻造葬贼藻凿 憎蚤贼澡 则澡蚤扎燥泽责澡藻则藻 糟燥造燥灶蚤扎葬鄄
贼蚤燥灶 葬灶凿 凿蚤泽藻葬泽藻 糟燥灶贼则燥造 燥枣 泽贼则葬蚤灶 晕悦阅鄄圆援
运藻赠 憎燥则凿泽院 月葬糟蚤造造怎泽 泽怎遭贼蚤造蚤泽曰 遭蚤燥枣蚤造皂曰 糟燥造燥灶蚤扎葬贼蚤燥灶曰 皂蚤灶蚤鄄栽灶员园
摇 摇 利用活体微生物袁特别是利用具有较强抗逆能
力的芽胞杆菌创制可有效防治作物土传病害的微生
物杀菌剂袁已成为当前研究和开发的热点遥 目前袁在
我国完成农药登记较多的是枯草芽胞杆菌 月葬糟蚤造造怎泽
泽怎遭贼蚤造蚤泽渊中国农药信息网 澡贼贼责院 辕辕 憎憎憎援 糟澡蚤灶葬责藻泽贼蚤糟蚤凿藻援
早燥增援 糟灶 辕 泽藻则增蚤糟藻 辕 扎澡糟曾 辕 赠曾糟枣曾曾糟曾援 葬泽责冤遥 枯草芽胞杆菌
防治作物土传病害的作用机制多样袁但其在作物根
际的定殖能力是其发挥防病作用的重要基础咱员 原 圆暂 遥
在作物根际土壤中袁枯草芽胞杆菌主要以生物膜的
形态附着在作物根系表面咱猿暂 遥 因此袁明确枯草芽胞
杆菌中影响生物膜形成的相关基因袁以及该基因对
其在根际定殖和生防效果的影响袁将有助于解析枯
草芽胞杆菌生物膜形成的调控途径袁同时为阐明其
生防作用的分子机制提供科学依据遥
晕悦阅鄄圆 菌株是本实验室筛选获得的一株可有效
防治棉花黄萎病和棉花立枯病的枯草芽胞杆菌咱源暂 袁
以该菌株为主要活性成分的微生物杀菌剂野员园 亿活
芽胞 辕 早枯草芽胞杆菌可湿性粉剂冶已进行了农药登
记注册遥 本实验室前期研究发现 晕悦阅鄄圆 菌株不仅
能够产生多种抑菌物质袁而且能够形成生物膜咱缘暂 曰
通过转座子插入突变技术袁获得 员 株生物膜形成能
力完全丧失的突变子袁发现突变子中转座子插入到
赠憎遭月基因内部遥 砸藻蚤扎藻则等咱远暂研究表明袁赠憎遭月基因编
码的蛋白属于蔗糖磷酸转移酶系统袁然而国内外未
见有关 赠憎遭月基因功能的报道遥
本研究对 赠憎遭月基因进行缺失突变袁定性尧定量
比较了 晕悦阅鄄圆 菌株野生型和 赠憎遭月 基因突变子的生
物膜形成能力袁并分析了 赠憎遭月 基因对 晕悦阅鄄圆 菌株
在棉花根际的定殖能力的影响袁以期深入了解 晕悦阅鄄
圆 菌株生物膜形成的分子机制及生防作用机制遥
员 材料与方法
员援 员 材料
棉花品种为冀棉 员员袁由河北省邯郸市农业科学
研究所选育袁本实验室扩繁保存遥
枯草芽胞杆菌 晕悦阅鄄圆 及其突变子在含有 猿园豫
甘油的 蕴月培养基中于 原 愿园 益条件下长期保存遥 使
用前在含有 缘 滋早 辕 皂蕴 氯霉素尧圆援 缘 滋早 辕 皂蕴 红霉素的
蕴月固体培养基上活化袁抗生素的选择和用量根据质
粒的特性而定遥 棉花立枯丝核菌 砸澡蚤扎燥糟贼燥灶蚤葬 泽燥造葬灶蚤
由本实验室分离保存遥
阅晕粤聚合酶尧限制性内切酶以及巢式 孕悦砸扩增
所用的染色体步移试剂盒渊早藻灶燥皂藻 憎葬造噪蚤灶早 噪蚤贼冤购自
宝生物工程渊大连冤有限公司曰杂燥怎贼澡藻则灶 杂交所用地
高辛标记与检测试剂盒购自 砸燥糟澡藻公司遥
生物膜培养基院员 蕴 培养基含营养肉汤渊灶怎贼则蚤藻灶贼
遭则燥贼澡冤 愿 早尧员园豫 渊憎 辕 增冤 运悦造 员园 皂蕴尧员援 圆豫 渊憎 辕 增冤酝早鄄
杂韵源窑苑匀圆韵 员园皂蕴尧员皂燥造 辕 蕴 悦葬渊晕韵猿冤圆 员皂蕴尧员园皂皂燥造 辕蕴 酝灶悦造圆 员 皂蕴尧员 皂皂燥造 辕 蕴 云藻杂韵源 员 皂蕴袁责匀 越苑援 远遥
员援 圆 突变子筛选及插入位点基因的克隆
突变子筛选院利用转座子 皂蚤灶蚤鄄栽灶员园 成功构建
枯草芽胞杆菌 晕悦阅鄄圆 菌株的突变子库咱苑暂 遥 参照
匀葬皂燥灶 驭 蕴葬扎葬扎扎藻则葬咱愿暂的方法比较突变子生物膜形成
情况遥 将新活化的突变菌株用灭菌牙签接种到装有
园援 缘 皂蕴生物膜培养基的离心管中袁猿苑 益静置培养 源愿
澡袁以 晕悦阅鄄圆 野生型菌株为对照袁通过结晶紫染色的
方法定性和定量比较 晕悦阅鄄圆 野生型菌株和突变菌
株生物膜的形成能力遥
杂燥怎贼澡藻则灶杂交试验院为了明确突变子基因组中
转座子插入位点的拷贝数袁对筛选出的生物膜形成
能力丧失的突变子进行了 杂燥怎贼澡藻则灶杂交试验遥 以质
粒 责匀灾员圆源怨 为模板袁以 皂蚤灶蚤鄄栽灶员园杂 辕 员园粤 为引物袁通
过 孕悦砸扩增获得 皂蚤灶蚤鄄栽灶员园 内部约 苑园园 遭责的片段作
为探针袁引物序列见表 员遥 提取 晕悦阅鄄圆 野生型菌株
及其突变子的基因组 阅晕粤袁分别用限制性内切酶
耘糟燥砸玉和 孕泽贼玉进行酶切袁酶切产物经 园援 愿豫琼脂糖
凝胶电泳分离袁然后进行 阅晕粤杂交遥 探针的标记和
杂燥怎贼澡藻则灶杂交按照试剂盒的使用说明进行遥
摇 摇 插入位点基因的克隆院根据转座子 皂蚤灶蚤鄄栽灶员园
的序列设计 猿 条同向的特异性引物 杂孕员尧 杂孕圆 和
杂孕猿袁引物序列见表 员遥 以染色体步移试剂盒中的
粤孕员 为兼并引物分别和特异性引物 杂孕员尧杂孕圆尧杂孕猿
进行 猿 次 孕悦砸袁操作步骤按试剂盒说明书进行遥 切
胶回收 粤孕员 辕 杂孕猿 引物扩增片段袁并以 杂孕猿 为测序引
物袁测序由上海生工生物工程有限公司完成遥 对测
序结果进行 月蕴粤杂栽分析袁结合枯草芽胞杆菌 晕悦阅鄄圆
菌株的全基因组序列分析袁确定转座子 皂蚤灶蚤鄄栽灶员园
插入位点遥
远源 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷
表 员 研究所用的引物及其碱基序列
栽葬遭造藻 员 杂藻择怎藻灶糟藻 燥枣 责则蚤皂藻则泽 怎泽藻凿 蚤灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠
引物
孕则蚤皂藻则
碱基序列摇 摇
杂藻择怎藻灶糟藻泽 渊缘忆 贼燥 猿忆冤摇 摇
用途摇 摇
哉泽藻摇 摇
赠憎遭月鄄责酝粤阅鄄孕员 糟早早早早葬贼糟糟悦粤悦栽郧栽悦悦粤郧郧粤栽郧郧栽栽栽悦 赠憎遭月基因 缘忆端扩增 粤皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻
赠憎遭月鄄责酝粤阅鄄孕圆 糟早早早葬葬贼贼糟栽郧栽粤粤郧粤栽悦郧郧栽郧粤栽栽悦郧栽悦 缘忆 贼藻则皂蚤灶葬造 燥枣 贼澡藻 赠憎遭月
赠憎遭月鄄责酝粤阅鄄孕猿 糟早早早葬葬贼贼糟悦粤郧粤粤悦悦郧粤栽栽郧栽郧郧粤粤粤 赠憎遭月基因 猿忆端扩增 粤皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻
赠憎遭月鄄责酝粤阅鄄孕源 糟早早葬早葬贼糟贼郧粤粤栽郧悦粤悦悦悦郧栽粤栽粤粤郧粤粤 猿忆 贼藻则皂蚤灶葬造 燥枣 贼澡藻 赠憎遭月
皂蚤灶蚤鄄栽灶员园杂 悦郧栽栽粤栽栽栽郧粤郧栽栽栽粤栽悦粤悦悦悦栽 杂交探针的扩增 粤皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻
皂蚤灶蚤鄄栽灶员园粤 栽粤粤郧栽悦栽栽悦悦悦栽栽郧栽栽粤栽栽郧栽郧 杂燥怎贼澡藻则灶 澡赠遭则蚤凿蚤扎葬贼蚤燥灶 责则燥遭藻
杂孕员 悦粤栽栽郧悦栽悦栽郧粤粤粤郧悦郧郧郧粤粤悦郧 转座子侧翼序列的扩增 粤皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣
杂孕圆 郧悦粤栽悦郧栽粤栽栽郧悦悦悦郧粤粤悦粤郧粤栽粤粤 贼澡藻 皂蚤灶蚤鄄栽灶员园 枣造葬灶噪藻凿 泽藻择怎藻灶糟藻 遭赠 晕藻泽贼鄄孕悦砸
杂孕猿 郧郧悦悦粤粤郧栽栽悦郧郧栽粤粤郧粤郧栽郧粤郧粤
员援 猿 赠憎遭月基因的定位突变
根据枯草芽胞杆菌 晕悦阅鄄圆 菌株 赠憎遭月 基因上下
游核苷酸序列袁利用 孕则蚤皂藻则 孕则藻皂蚤藻则 缘援 园 软件在 赠憎遭月
基因上尧下游分别设计 源 条引物袁引物信息见表 员遥
以 晕悦阅鄄圆 菌株基因组为模板袁分别以 赠憎遭月鄄责酝粤阅鄄
孕员 辕 孕圆 和 赠憎遭月鄄责酝粤阅鄄孕猿 辕 孕源 引物组合进行 孕悦砸 扩
增袁孕悦砸扩增产物回收纯化后同时利用 耘糟燥砸玉进行
酶切遥 酶切产物互连后以连接产物为模板袁用
赠憎遭月鄄责酝粤阅鄄孕员 辕 孕源 引物进行 孕悦砸 扩增遥 扩增产物
用 月葬皂匀 玉和 月早造 域双酶切后插入到 责酝粤阅 质粒
月葬皂匀 玉和 月早造 域位点间袁构建 赠憎遭月基因缺失突变
载体 责酝粤阅鄄吟赠憎遭月遥 缺失突变载体经测序验证正
确后采用原生质转化的方法转入枯草芽胞杆菌
晕悦阅鄄圆 菌株中咱怨暂 遥 参照王垚等咱员园暂的方法筛选 赠憎遭月
基因缺失突变子遥
员援 源 生防菌对立枯病的防治效果
晕悦阅鄄圆 野生型菌株及 赠憎遭月 基因突变子分别于
圆园园 皂蕴 蕴月培养基中 猿苑益尧员缘园 则 辕 皂蚤灶振荡培养 圆源 澡袁
然后 员园园园园 则 辕 皂蚤灶离心 员园 皂蚤灶收集菌体袁用 员园 皂蕴 无
菌水悬浮得到菌体悬浮液遥 棉种经表面消毒后于
圆缘 益催芽 圆源 澡袁将露白的棉种在 晕悦阅鄄圆 野生型菌株
及其突变子菌体悬浮液中浸泡 猿园 皂蚤灶袁设清水浸泡
的棉种为对照袁然后播种于混有立枯丝核菌营养基
质的苗盘中袁立枯丝核菌的接种浓度约为 员园缘 繁殖
体 辕 早土壤遥 每处理重复 猿 次袁每次重复播种 员远 粒遥
将播种后苗盘置于 圆缘 耀 圆愿 益尧员远 澡 光照的人工气候
室中培养遥 播种 员源 凿 后记录各处理中的死苗数并
计算防治效果遥 防治效果渊豫 冤 越 渊对照死苗数 原处
理死苗数冤 辕对照死苗数 伊 员园园遥
员援 缘 生防菌根际定殖能力的定量检测
棉种初始带菌量的测定院晕悦阅鄄圆 野生型菌株及
赠憎遭月基因突变子菌液的制备和棉种的处理方法同
员援 源遥 随机挑选 猿 粒处理后的棉种袁加入 猿园 皂蕴无菌
水袁怨园 宰超声波振荡 圆 皂蚤灶袁经系列稀释后取 员园园 滋蕴
涂于 蕴月培养基上袁 缘员 益培养 员圆 澡袁根据菌落数计算
种子初始带菌量遥
晕悦阅鄄圆 菌株在棉花根际土壤中的定量检测院播
种 苑 凿和 员源 凿后袁选择经 晕悦阅鄄圆 野生型菌株及 赠憎遭月
基因突变子处理的棉苗各 猿 株袁抖掉根表附着的营
养基质袁然后称取定量的根系约 圆园园 皂早袁加入 员 皂蕴
无菌水袁怨园宰超声波振荡 圆 皂蚤灶袁系列稀释后涂于 蕴月
培养基上袁缘员 益培养 员圆 澡袁记录形态与 晕悦阅鄄圆 菌株
一致的菌落袁并利用 晕悦阅鄄圆 菌株的特异性引物进行
菌落 孕悦砸扩增咱员员暂 袁根据阳性菌落所占比例推断棉
花根际 晕悦阅鄄圆 野生型菌株及其突变子的群体数量遥
员援 远 数据分析
采用 韵则蚤早蚤灶 苑援 园 软件中的双样本 贼 检验对试验
中的数据进行显著性分析遥
圆 结果与分析
圆援 员 突变子的筛选及插入位点基因的克隆
本研究通过转座子 皂蚤灶蚤鄄栽灶员园 插入突变技术袁
建立了 晕悦阅鄄圆 菌株的突变子库遥 通过对 源 园园园 余株
晕悦阅鄄圆 菌株突变子进行筛选袁获得 远 株生物膜形成
能力降低的突变子遥 选取 员 株生物膜形成能力丧失
的突变子 酝猿 作进一步研究遥 杂燥怎贼澡藻则灶 杂交试验证
明袁突变子 酝猿 中转座子是以单拷贝的形式插入到
晕悦阅鄄圆 菌株的基因组中渊结果未列出冤遥 采用巢式
孕悦砸技术袁克隆到约 员援 缘 噪遭 转座子插入位点基因的
侧翼序列遥 基因序列比对证明袁突变子 酝猿 中转座
子插入位点的基因序列与枯草芽胞杆菌 员远愿 菌株中
的 赠憎遭月基因序列一致性为 怨苑豫 袁说明突变子 酝猿 中
苑源员 期 郭庆港等院赠憎遭月基因对枯草芽胞杆菌 晕悦阅鄄圆 菌株生物膜形成和根际定殖能力的影响
转座子插入到 赠憎遭月基因内部渊图 员冤遥 通过与 晕悦阅鄄
圆 菌株全基因组序列比对袁获得 远苑缘 遭责 的 赠憎遭月基因
全长序列渊郧藻灶月葬灶噪 登录号院允晕缘苑员员员猿冤袁该基因编
码 圆圆缘 个氨基酸袁与模式菌株枯草芽胞杆菌 员远愿 菌
株中的 赠憎遭月 基因渊郧藻灶月葬灶噪 登录号院粤蕴园园怨员圆远冤核
苷酸和氨基酸序列同源性分别为 怨苑豫和 怨缘豫 遥
图 员 突变子中转座子插入位点基因及其侧翼基因
云蚤早援 员 栽澡藻 皂蚤灶蚤鄄栽灶员园 蚤灶泽藻则贼藻凿 早藻灶藻 葬灶凿 蚤贼泽 枣造葬灶噪藻凿 早藻灶藻泽 蚤灶 贼澡藻 皂怎贼葬灶贼 泽贼则葬蚤灶
圆援 圆 晕悦阅鄄圆 菌株 赠憎遭月基因缺失突变子的获得
以 晕悦阅鄄圆 菌株基因组为模板袁分别利用 赠憎遭月鄄
责酝粤阅鄄孕员 辕 孕圆 和 赠憎遭月鄄责酝粤阅鄄孕猿 辕 孕源 引物组合进行
孕悦砸扩增袁获得 员 愿猿愿 遭责 和 员 远愿缘 遭责的扩增片段遥 圆
个扩增片段经 耘糟燥砸玉酶切后相互连接袁以连接产物
为模板袁利用 赠憎遭月鄄责酝粤阅鄄孕员 辕 孕源 引物进行 孕悦砸 扩
增袁获得 猿 缘圆猿 遭责 的扩增片段遥 与 晕悦阅鄄圆 菌株中的
赠憎遭月 基因相比袁赠憎遭月鄄责酝粤阅鄄孕员 辕 孕源 扩增片段中缺
少 赠憎遭月基因内部的 猿愿远 遭责 片段遥 赠憎遭月鄄责酝粤阅鄄孕员 辕
孕源 扩增片段经 月葬皂匀 玉尧月早造 域双酶切后袁插入同样
双酶切的 责酝粤阅 质粒相应位点袁即得到 责酝粤阅鄄
吟赠憎遭月缺失突变载体遥 将构建好的缺失突变载体
转入 晕悦阅鄄圆 菌株中进行高温突变筛选袁获得红霉素
敏感菌株遥 分别利用 孕悦砸 扩增和测序方法对红霉
素敏感菌株进行验证渊结果未列出冤袁获得 赠憎遭月 基
因缺失突变子袁命名为 晕悦阅鄄圆渊驻赠憎遭月冤 遥
圆援 猿 生物膜形成能力比较
晕悦阅鄄圆 菌株在 孕灾孕 管壁上能形成明显的生物
膜袁而突变子 晕悦阅鄄圆渊驻赠憎遭月冤几乎完全丧失了生物
膜形成能力渊图 圆鄄左冤遥 定量比较 晕悦阅鄄圆 野生型菌
株及突变子 晕悦阅鄄圆渊驻赠憎遭月冤生物膜形成能力袁晕悦阅鄄
圆野生型菌株培养 员 凿后即可形成明显的生物膜袁生
物膜的吸光度值 韵阅缘苑园 越 园援 苑缘袁培养 圆 凿 后生物膜形
成能力最强袁韵阅缘苑园 越 园 援 愿缘袁培养猿 凿后生物膜形成
能力略微有所下降袁韵阅缘苑园 越 园援 苑苑遥 突变子 晕悦阅鄄圆渊驻赠憎遭月冤培养 员尧圆尧猿 凿 后生物膜的吸光度值分别为
园援 园猿尧园援 员 和 园援 园苑袁显著降低了生物膜形成能力渊图
圆鄄右冤遥 生长速率测定发现 晕悦阅鄄圆 野生型菌株及其
突变子的生长速率没有明显的差异袁说明突变子生
物膜形成能力的下降与生长速率降低无关遥
图 圆 晕悦阅鄄圆 菌株及其突变子 晕悦阅鄄圆 渊驻赠憎遭月冤 生物膜形成能力的定性渊左冤尧定量渊右冤比较
云蚤早援 圆 匝怎葬造蚤贼葬贼蚤增藻 渊造藻枣贼冤 葬灶凿 择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 渊则蚤早澡贼冤 糟燥皂责葬则葬贼蚤增藻 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 遭蚤燥枣蚤造皂 枣燥则皂葬贼蚤燥灶
遭藻贼憎藻藻灶 憎蚤造凿 贼赠责藻 泽贼则葬蚤灶 晕悦阅鄄圆 葬灶凿 皂怎贼葬灶贼 泽贼则葬蚤灶 晕悦阅鄄圆 渊驻赠憎遭月冤
摇 摇 注院右图中的数据为平均值 依标准差遥 不同字母表示经双样本 贼检验差异显著渊孕臆园援 园缘冤遥 晕燥贼藻院 栽澡藻 凿葬贼葬 蚤灶 贼澡藻 则蚤早澡贼 枣蚤早怎则藻 葬则藻
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圆援 源 生防菌在根际的群体数量及防治效果比较
用 晕悦阅鄄圆 野生型菌株和突变子处理的棉种初
始带菌量分别为 员援 猿 伊 员园缘 悦云哉 辕粒棉种和 圆援 源 伊 员园缘
悦云哉 辕粒棉种遥 播种 苑 凿 后袁晕悦阅鄄圆 野生型菌株在根
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悦云哉 辕 早根段曰播种 员源 凿 后袁晕悦阅鄄圆 野生型菌株在根
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愿源 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷
变子 晕悦阅鄄圆渊驻赠憎遭月冤的群体数量继续下降到 缘援 远 伊
员园猿 悦云哉 辕 早根段渊表 圆冤遥 说明 晕悦阅鄄圆 野生型菌株能
够随着棉花根系的生长在棉花根际有效定殖袁而突
变子 晕悦阅鄄圆渊驻赠憎遭月冤 在棉花根际的定殖能力显著
降低遥
晕悦阅鄄圆 野生型菌株及其突变子 晕悦阅鄄圆渊驻赠憎遭月冤
对棉花立枯丝核病的防治效果比较发现袁晕悦阅鄄圆 野
生型菌株能显著降低棉苗的死苗数袁对棉花立枯病
的防效为 猿源援 愿豫 袁而突变子 晕悦阅鄄圆渊驻赠憎遭月冤菌株对
棉花立枯病的防效仅为 员源援 缘豫 遥
表 圆 晕悦阅鄄圆 菌株野生型及其突变子在棉花根际的群体数量及其对棉花立枯病的防治效果
栽葬遭造藻 圆 悦燥造燥灶蚤扎葬贼蚤燥灶 燥灶 糟燥贼贼燥灶 则澡蚤扎燥泽责澡藻则藻 葬灶凿 糟燥灶贼则燥造 燥枣 糟燥贼贼燥灶 则澡蚤扎燥糟贼燥灶蚤葬 凿葬皂责蚤灶早鄄燥枣枣
遭赠 憎蚤造凿 贼赠责藻 泽贼则葬蚤灶 晕悦阅鄄圆 葬灶凿 皂怎贼葬灶贼 泽贼则葬蚤灶 晕悦阅鄄圆 渊驻赠憎遭月冤
处理
栽则藻葬贼皂藻灶贼
初始种子带菌量渊 伊 员园缘 悦云哉 辕粒种子冤
陨灶蚤贼蚤葬造 遭葬糟贼藻则蚤葬造 凿藻灶泽蚤贼赠
渊 伊 员园缘 悦云哉 责藻则 泽藻藻凿冤
细菌群体数量渊 伊 员园猿 悦云哉 辕 早根段冤
月葬糟贼藻则蚤葬造 糟藻造造 渊 伊 员园猿 悦云哉 辕 早 则燥燥贼冤
苑 凿 员源 凿
防治效果渊豫 冤
月蚤燥糟燥灶贼则燥造
藻枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠
晕悦阅鄄圆 员援 猿 依 园援 园远 葬 怨援 苑 依 圆援 源 葬 员源援 园 依 园援 员 葬 猿源援 愿 依 猿援 愿 葬
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猿 讨论
枯草芽胞杆菌生物膜的形成受多个基因的调
控袁这些基因通过调控生物膜基质的产生而影响枯
草芽胞杆菌生物膜的形成袁主要为胞外多糖和 栽葬泽粤
蛋白咱员圆 原 员源暂 遥 目前已报道从枯草芽胞杆菌模式菌株
员远愿 菌株中克隆到 源 个控制其生物膜形成的调控系
统袁包括 杂责燥粤 辕 粤遭则月咱员缘暂 尧 杂蚤灶砸 辕 杂蚤灶陨咱员远暂 尧杂造则砸 辕 杂造则粤咱员苑暂
以及 阅藻早哉 辕 阅藻早杂咱员愿暂 袁并明确了它们分别在生物膜形
成过程中的作用咱员怨暂 遥 枯草芽胞杆菌中生物膜的形
成存在一个复杂的调控网络袁利用转座子随机插入
突变技术可获得更多与生物膜形成相关的基因咱圆园暂 遥
本研究通过转座子插入突变技术和基因定位突变技
术袁证明 赠憎遭月 基因调控 晕悦阅鄄圆 菌株生物膜的形成遥
同时发现袁突变 赠憎遭月 基因可显著降低 晕悦阅鄄圆 菌株
的芽胞产生能力袁表明 赠憎遭月 基因同时控制生物膜
的产生和芽胞的形成遥 在枯草芽胞杆菌中袁生物膜
的产生和芽胞的形成存在两条不同的信号传递途
径袁而全局性调控因子渊早造燥遭葬造 则藻早怎造葬则冤 杂责燥粤 同时调
控这两条途径中的信号传递咱圆员暂 袁据此推测袁在枯草
芽胞杆菌中袁赠憎遭月基因是位于生物膜形成途径上游
并且可能与 杂责燥粤存在直接或间接关系的一个重要
的调控因子遥 深入研究 赠憎遭月 基因在生物膜形成途
径中的位置以及与目前已知控制生物膜形成基因的
关系袁将有助于了解枯草芽胞杆菌生物膜形成的
机制遥
摇 摇 细菌形成生物膜后可增强其对不良环境袁如干
旱尧极端 责匀值尧其它微生物分泌的抗生物质以及土
壤中的有毒物质的抵抗能力袁从而维持其较高的群
体数量咱圆圆 原 圆猿暂 遥 生防菌群体数量的高低是其发挥生
防作用的前提咱远暂 遥 枯草芽胞杆菌 远园缘员 菌株能有效
地定殖于拟南芥根表袁从而保护拟南芥根系免受病
原细菌丁香假单胞杆菌番茄致病变种 孕泽藻怎凿燥皂燥灶葬泽
泽赠则蚤灶早葬藻 责增援 贼燥皂葬贼燥 的感染袁而其丧失生物膜形成能
力的突变子对病原细菌的屏蔽能力则显著降低咱圆暂 遥
本研究结果显示袁随着时间的延长袁突变子 晕悦阅鄄圆
渊驻赠憎遭月冤在棉花根际的群体数量比 晕悦阅鄄圆 野生型
菌株显著降低袁同时对立枯病的防治效果显著降低袁
证明 晕悦阅鄄圆 菌株生物膜形成能力决定着其根际定
殖能力和对病害的防控能力遥
参 考 文 献渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
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猿园猿 原 猿员员
怨源员 期 郭庆港等院赠憎遭月基因对枯草芽胞杆菌 晕悦阅鄄圆 菌株生物膜形成和根际定殖能力的影响
咱源暂 李社增袁鹿秀云袁马平袁等援 防治棉花黄萎病的生防细菌
晕悦阅鄄圆的田间效果评价及其鉴定援 植物病理学报袁圆园园缘袁猿缘
渊缘冤院源缘员 原 源缘缘
咱缘暂 吴园园袁郭庆港袁李社增袁等援 枯草芽胞杆菌 晕悦阅鄄圆 菌株生
物膜形成条件的优化援 郭泽建袁李宝笃主编援 中国植物病理
学会 圆园员圆年学术年会论文集援 北京院中国农业科学技术出
版社袁圆园员圆院猿愿圆 原 猿愿苑
咱远暂 砸藻蚤扎藻则 允袁 月葬糟澡藻皂 杂袁 砸藻蚤扎藻则 粤袁 藻贼 葬造援 晕燥增藻造 责澡燥泽责澡燥贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻
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咱苑暂 郭庆港袁李社增袁鹿秀云袁等 援 生防细菌晕悦阅鄄圆中抑菌功
能相关基因的定位及克隆 援 华北农学报袁圆园园苑 袁圆圆 渊远冤 院
员怨园 原 员怨源
咱愿暂 匀葬皂燥灶 酝 粤袁 蕴葬扎葬扎扎藻则葬 月 粤援 栽澡藻 泽责燥则怎造葬贼蚤燥灶 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 枣葬糟鄄
贼燥则 杂责燥园粤 蚤泽 则藻择怎蚤则藻凿 枣燥则 遭蚤燥枣蚤造皂 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 蚤灶 月葬糟蚤造造怎泽 泽怎遭贼蚤鄄
造蚤泽援 酝燥造藻糟怎造葬则 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠袁 圆园园员袁 源圆渊缘冤院 员员怨怨 原 员圆园怨
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咱员园暂 王垚袁邓超袁彭琦袁等援 月贼 群体信号应答因子 灶责则砸基因的缺
失对 糟则赠员粤糟基因表达的影响援 微生物学报袁圆园员园袁缘园渊员员冤院
员缘缘园 原 员缘缘缘
咱员员暂 郧怎燥 匝 郧袁 蕴蚤 杂 在袁 蕴怎 载 再袁 藻贼 葬造援 孕澡燥砸 辕 孕澡燥孕 贼憎燥 糟燥皂责燥灶藻灶贼
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咱圆圆暂 阅葬增藻赠 酝 耘袁 韵爷 贼燥燥造藻 郧 粤援 酝蚤糟则燥遭蚤葬造 遭蚤燥枣蚤造皂泽院 枣则燥皂 藻糟燥造燥早赠
贼燥 皂燥造藻糟怎造葬则 早藻灶藻贼蚤糟泽援 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠 葬灶凿 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠 砸藻鄄
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咱圆猿暂 韵责澡蚤则 栽袁 郧怎贼灶蚤糟噪 阅 蕴援 粤 则燥造藻 枣燥则 藻曾燥责燥造赠泽葬糟糟澡葬则蚤凿藻泽 蚤灶 贼澡藻
责则燥贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 皂蚤糟则燥燥则早葬灶蚤泽皂泽 枣则燥皂 凿藻泽蚤糟糟葬贼蚤燥灶援 粤责责造蚤藻凿 葬灶凿
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渊责任编辑院吴竟一冤
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