全 文 ：第 １１ 卷第 ６ 期
２０１３ 年 １１ 月
生 物 加 工 过 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ． １１ Ｎｏ． ６
Ｎｏｖ． ２０１３
ｄｏｉ：１０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １６７２ － ３６７８． ２０１３． ０６． ０１３
收稿日期：２０１２ － ０９ － ２９
基金项目：国家自然科学基金（２１１７６１２４）；国家自然科学基金重点项目（２０９３６００２）；国家科技支撑计划（２０１１ＢＡＤ２３Ｂ０３）；江苏省高校优势学
科建设工程
作者简介：刘 欣（１９８３—），女，吉林长春人，博士研究生，研究方向：微生物发酵与代谢工程；黄 和（联系人）：教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｂｉｏｔｅｃｈ＠ ｎｊｕｔ．
ｅｄｕ． ｃｎ
高山被孢霉淬灭方法及胞内代谢
产物的气相色谱 质谱分析比较
刘 欣１，傅宁华１，张红漫２，纪晓俊１，张 鑫２，杨健健１，黄 和１
（１．南京工业大学 生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室，南京 ２１０００９；
２．南京工业大学 理学院，南京 ２１０００９）
摘 要：在花生四烯酸生产菌高山被孢霉代谢组学研究中，需利用胞内代谢物的提取手段并基于气相色谱 质谱
（ＧＣ⁃ＭＳ）分析方法对其进行检测。 比较了 ３ 种胞内代谢物提取方法及不同色谱柱条件下 ＧＣ⁃ＭＳ 分析结果。 研究
表明：采用冷甲醇淬灭分别较液氮直接淬灭及真空过滤后，减少了胞内代谢物的泄露并更好地实现了胞外及胞内
代谢物的分离。 在对代谢物分析的比较中，极性色谱柱（ＤＢ⁃ＦＦＡＰ）检出的代谢物仅为 １１ 种，主要为有机酸、醛类；
而代谢物经衍生化后采用非极性色谱柱（ＤＢ ５）共检出 ３２ 种化合物，主要为糖、糖苷及醇类。
关键词：花生四烯酸；高山被孢霉；代谢组学；代谢产物； 取样；ＧＣ⁃ＭＳ分析
中图分类号：Ｓ１８２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２ － ３６７８（２０１３）０６ － ００６３ － ０５
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ
Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｂｙ ＧＣ⁃ＭＳ
ＬＩＵ Ｘｉｎ１，ＦＵ Ｎｉｎｇｈｕａ１，ＺＨＡＮＧ Ｈｏｎｇｍａｎ２，ＪＩ Ｘｉａｏｊｕｎ１，ＺＨＡＮＧ Ｘｉｎ２，ＹＡＮＧ Ｊｉａｎｊｉａｎ１，ＨＵＡＮＧ Ｈｅ１
（１． Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ⁃Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９；
２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ １０００９）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ， ｓａｍｐｌｉｎｇ
ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＧＣ⁃ＭＳ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｒｅ ｎｅｅｄｅｄ． Ｔｈｅ
ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ＧＣ⁃ＭＳ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｔｗｏ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｃｏｌｕｍｎｓ ｗｅｒｅ
ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｃｏｌｄ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｃａｕｓｅｄ ｌｅｓｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｌｅａｋａｇｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ
ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａ⁃ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｔｈａｎ ｄｉｒｅｃｔ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ
ｖａｃｕｕｍ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ． Ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，
ｏｎｌｙ １１ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｐｏｌａｒ ｃｏｌｕｍｎ （ ＤＢ⁃ＦＦＡＰ ）， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ
ａｌｄｅｈｙｄｅｓ． Ｈｏｗｅｖｅｒ，３２ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｎｏｎ ｐｏｌａｒ ｃｏｌｕｍｎ （ＤＢ⁃５）， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｕｇａｒｓ，
ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ，ａｎｄ ａｌｃｏｈｏｌｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ；Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ；ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ；ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ；ｓａｍｐｌｉｎｇ；ＧＣ⁃ＭＳ ａｎａｌｙｓｉｓ
花生四烯酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＡＲＡ），即全顺式
５，８，１１，１４ 二十碳四烯酸，是属于 ω ６ 系列的必
需长链多不饱和脂肪酸（ＰＵＦＡｓ），对促进大脑功能
和提高视网膜发育是不可或缺的物质［１］。 此外，
ＡＲＡ还具有降低血脂、增强免疫力、抗癌等功效，被
广泛应用于功能保健、生物医药、化妆品及饲料添
加剂等方面［２］。
高山被孢霉（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）是生产 ＡＲＡ 的
重要工业菌株，利用代谢组学技术可以深入了解微生
物代谢产物之间的相互关系［３］，对以高山被孢霉为代
表的工业微生物进行研究有利于进一步认识和改造
它们。 微生物代谢组学研究中，试样的采集和代谢物
分析是获取代谢物组数据并进行生物学解析的前提，
对它们的方法进行研究是十分必要的。
试样采集过程为保持细胞收集时刻的生理状
态不发生改变，需要对细胞进行快速取样及淬灭。
液氮淬灭技术作为一种标准方法常用于丝状真菌
及其他生物中［４］。 此方法的优点是淬灭代谢反应
迅速，且淬灭剂无极性、无残留。 但直接对发酵液
进行淬灭后，得到的试样包含了胞内及胞外的所有
代谢物。 因此，淬灭前的分离是改进此方法的重要
环节。 由于丝状真菌的培养基具有高黏度、非均一
且不易收集的特点［５］，通常采用真空过滤的方式分
离［６］。 此外，冷甲醇溶液（ － ４５ ℃）也被广泛用于
细菌［７］、酵母［８］及丝状真菌［５，９］的代谢反应淬灭中，
此方法具有较温和的特点。 笔者拟考察基于 ３ 种不
同淬灭方法的取样技术对于胞内代谢物泄露的影
响，为后续的实验奠定基础。
气相色谱 质谱（ＧＣ⁃ＭＳ）系统在代谢物的分离
与鉴定中起着关键作用。 除仪器型号不同外，其主
要的区别归于色谱柱型号。 对于非极性色谱柱
ＤＢ ５而言，对试样进行分析前需要进行柱前衍生
化。 而对于极性柱 ＤＢ ＦＦＡＰ 而言，试样无需衍生
化就可以直接进样。 同时基于 Ｄｅａｎｓ ｓｗｉｔｃｈ 的 ＧＣ⁃
ＭＳ直接进样的方法，在 ＤＢ ＦＦＡＰ极性柱上可以实
现对代谢物水溶液进行直接分析的过程。 笔者主
要比较非极性 ＤＢ ５ 及极性 ＤＢ ＦＦＡＰ ２ 种色谱柱
对代谢物的分析能力，以获得最适合用于 Ｍ． ａｌｐｉｎａ
胞内代谢物的分析方法。
１ 材料与方法
１． １ 菌种
经紫外诱变后获得的高山被孢霉 ＭＥ １
（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ ＭＥ １）菌株在马铃薯葡萄糖琼
脂（ＰＤＡ）斜面上于 ４ ℃ 条件下保藏，每 ３ 个月进行
转接。
１． ２ 培养基与培养条件
取已培养好的新鲜斜面菌种，用无菌水洗下菌
丝，接种于种子培养基中（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ３０，酵母膏
５ ０ ，ＫＨ２ＰＯ４ ３ ０。 转速 １２０ ｒ ／ ｍｉｎ，２５ ℃培养 ４８ ～
７２ ｈ。 待种子生长至对数生长期转接 ５ ｍＬ 种子液
至 ５０ ｍＬ 发酵培养基中（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ８０，酵母膏
６ ０，ＫＨ２ＰＯ４ ４ ０，ＮａＮＯ３ ３ ０，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １ ０，ｐＨ
６ ０ ～ ８ ０。 培养条件为转速 １２０ ｒ ／ ｍｉｎ，温度 ２３ ℃，
发酵 ７ ｄ，于对数生长后期取样（约 ９６ ｈ）。
１． ３ 淬灭方法
１． ３． １ 液氮直接淬灭
５ ｍＬ发酵液直接投入装有 ５０ ｍＬ 液氮的研磨
钵中迅速淬灭。 淬灭后于 － ５０ ℃、２ ｋＰａ 真空度条
件下冻干除去发酵液中的水分 （ ＦｒｅｅＺｏｎｅ Ｐｌｕｓ
２ ５ Ｌ、低压冻系统，美国 Ｌａｂｃｏｎｃｏ 公司），干菌体用
于胞内代谢产物提取。
１． ３． ２ 真空过滤后于液氮中淬灭并研磨
５ ｍＬ发酵液通过直径 ６０ ｍｍ 的滤纸（孔径 ５
μｍ）于真空抽滤装置中迅速过滤除去发酵液，同时
采用去离子水清洗菌丝细胞。 过滤后的菌体直接
迅速地投入装有 ２５ ｍＬ 液氮的研磨钵中迅速淬灭，
并伴随快速持续的机械研磨，直至被研成粉末，菌
粉用于胞内代谢产物提取。
１． ３． ３ 甲醇淬灭
５ ｍＬ发酵液直接投入 － ４０ ℃的 ２５ ｍＬ 甲醇溶
液中（体积分数 ６０％ ，含 １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ４ 羟乙基哌嗪
乙磺酸 （ ＨＥＰＥＳ）， ｐＨ ＝ ７ ０ ）。 混合物于 ６ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ、 － １０ ℃条件下离心 ３ ｍｉｎ，菌体沉淀物用于
胞内代谢物提取。
１． ４ 提取方法
细胞淬灭后得到的上述干菌体、菌体沉淀及菌
粉于 １ ｍＬ含 ６０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＨＥＰＥＳ缓冲液的乙醇溶液
中 （体积分数 ７５％ ， ８０ ℃） 提取 ３ ｍｉｎ 后于
１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ， － １０ ℃条件下离线 ２ ｍｉｎ，收集上清
液用于代谢产物的检测。
１． ５ ＧＣ⁃ＭＳ检测方法
１． ５． １ 基于 ＤＢ ＦＦＡＰ色谱柱的分析方法
气质色谱仪，５９７５Ｃ ＭＳＤ ／ ７８９０Ａ ＧＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ 公
司）。 进样体积 １ μＬ，分流比，１０ ∶ １，石英毛细管色
谱柱 （３０ ｍ × ０ ２５ ｍｍ × ０ ２５ μｍ，ＤＢ ＦＦＡＰ，
４６ 生 物 加 工 过 程 第 １１ 卷
Ａｇｉｌｅｎｔ公司）；进样口温度，２５０ ℃。 升温程序为初
始温度 ７０ ℃，以 ５ ℃ ／ ｍｉｎ 升温至 １４０ ℃，以 ８
℃ ／ ｍｉｎ升温至 １８０ ℃，保持 １０ ｍｉｎ，最后以 ５ ℃ ／ ｍｉｎ
升温至 ２３０ ℃，并保持 ６ ｍｉｎ。 质谱条件为传输线温
度，２５０ ℃；离子源温度，２３０ ℃；电子轰击模式，ＥＩ
７０ ｅＶ。 四级杆质量分析器温度，１５０ ℃；采集质量
数范围为 ３０ ～ ５００ ａｍｕ。 Ｈｅ 为载气，采用横流模
式，流速 １ ５ ｍＬ ／ ｍｉｎ载气。 溶剂延迟，３ ｍｉｎ。 基于
Ｄｅａｎｓ Ｓｗｉｔｃｈ 系统，在特定时间将部分色谱柱流出
试样进入 ＴＣＤ 检测器而不通过 ＭＳ。 Ｄｅａｎｓ Ｓｗｉｔｃｈ
切割起始时间 ４ １０ ｍｉｎ，结束时间 ７ ００ ｍｉｎ。 ＴＣＤ
检测器温度，２２０ ℃。
１ ５ ２ 基于 ＤＢ ５ 色谱柱的柱前衍生化及分析
方法
１００ μＬ提取物于 Ｎ２ 浓缩仪中干燥。 干燥后的
试样加入 ５０ μＬ甲氧基铵盐酸盐（２０ ｍｇ ／ ｍＬ的吡啶
溶液），于 ４０ ℃条件下反应 ８０ ｍｉｎ，其后加入 ８０ μＬ
Ｎ 甲基 Ｎ （三甲基硅氧烷 ） 三氟乙酰胺
（ＭＳＴＦＡ），４０ ℃条件下反应 ８０ ｍｉｎ。
衍生化后的试样用于 ＧＣ⁃ＭＳ分析检测。 进样体
积 １ μＬ，不分流进样。 石英毛细管色谱柱（３０ ｍ ×
０ ２５ ｍｍ ×０ ２５ μｍ，ＤＢ ５ＭＳ，Ａｇｉｌｅｎｔ公司）；进样口
温度，２５０ ℃。 升温程序为初始温度 ７０ ℃，保持 ２
ｍｉｎ，以 ５ ℃ ／ ｍｉｎ 升至 ３００ ℃，保持 ３ ｍｉｎ。 质谱条件
为传输线与离子源温度 ２８０ ℃，电子轰击模式，ＩＥ ７０
ｅＶ。 采集质量数范围为５０ ～ ６００ ｍ／ ｚ。 Ｈｅ 为载气，采
用横流模式，流速 １ ｍＬ ／ ｍｉｎ［１０］。
２ 结果与讨论
２． １ 淬灭方法对代谢产物泄漏的影响
由于 ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ、丙酮酸（ ｐｙｒｕｖａｔｅ）、葡萄
糖 ６ 磷酸（Ｇ６Ｐ）、ＮＡＤＰ、ＮＡＤ以及 ＡＴＰ的快速降
解速率，因此它们常作为不稳定的代谢物代表被用
于考察采样技术对代谢产物的泄漏情况［５，１１］。 代谢
物的胞外含量占总量的百分比定义为代谢物的胞
外相对含量。 其中采用液氮对发酵液直接进行淬
灭可以得到胞内及胞外代谢产物的总量，通过检测
发酵液上清中代谢物含量，计算得到代谢物的胞外
相对含量，反映了淬灭前原始的胞外代谢产物信
息，并将其作为对照；采用真空过滤后于液氮中淬
灭的方法是通过检测滤液中代谢物含量与其和胞
内代谢物之和的比值得到代谢物的相对含量；而采
用甲醇淬灭的方法则通过淬火后混合物上清中代
谢物的含量与其和胞内代谢物之和的比值得到代
谢物的相对含量。 本文中笔者通过后 ２ 种淬灭方法
计算得到代谢物的胞外相对含量与对照的差异，从
而比较它们对胞内代谢物泄露的影响。 考察不同
淬灭方法对 Ｍ． ａｌｐｉｎａ胞内代谢产物泄漏的影响，结
果见图 １。
图 １ 淬灭方法对 Ｍ． ａｌｐｉｎａ胞内代谢
产物泄漏的影响
Ｆｉｇ． １ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ ｔｈｅ
ｌｅａｋａｇｅ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ Ｍ． ａｌｐｉｎａ
由图 １ 可知：采用甲醇淬灭及过滤后液氮淬灭
２ 种采样技术时，ＮＡＤ 和 ＮＡＤＰ 几乎不会从细胞中
泄漏出来。 与对照相比，过滤后于液氮中淬灭的方
法导致 ＮＡＤＰＨ、Ｇ６Ｐ 和 ＮＡＤＨ 的胞外相对泄漏量
分别为 ４４ ７％ 、２１ ３％ 和 １６ ２％ ，差异十分显著。
这可能由于真空过滤时细胞内外的巨大压力差对
细胞产生胁迫从而导致代谢产物的大量泄漏。 虽
然这一方法从整体的淬火过程处理来看与 ＭＳ 相比
耗时短、过程简单，但从代谢产物的完整性和稳定
性上来看并不是最好的。 而采用甲醇淬灭时胞外
代谢物的相对含量与对照相比相差范围在
－ ５ ８％ ～２１ ９％ 。 由此，采用甲醇淬灭的方法所产
生的泄漏相对较小，可以作为 Ｍ． ａｌｐｉｎａ 于天然培养
基条件下进行代谢反应淬灭的最佳方法。
２． ２ 基于 ＤＢ⁃ＦＦＡＰ质谱柱的代谢产物检测
表 １ 为 Ｍ． ａｌｐｉｎａ 胞内代谢产物经极性质谱柱
ＤＢ⁃ＦＦＡＰ分离后检测出的代谢产物结果。 由表 １
可知：经分析检测出的代谢产物总数为 １１ 个，其中
包括有机酸、酮类、醛类及醇类等极性化合物。
２． ３ 基于 ＤＢ ５ 质谱柱的代谢产物检测
表 ２ 为 Ｍ． ａｌｐｉｎａ 胞内代谢产物经非极性柱
ＤＢ ５分离后的检测结果。 由表 ２ 可知，总检出代谢
物个数为 ３２，主要为糖类、糖苷类及醇类代谢产物。
５６ 第 ６ 期 刘 欣等：高山被孢霉淬灭方法及胞内代谢产物的气相色谱 质谱分析比较
表 １ 基于 ＤＢ⁃ＦＦＡＰ色谱的 ３组平行实验中重现的代谢产物
Ｔａｂｌｅ １ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｓｅｔｓ ｏｆ ｐａｒａｌｌｅｌ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＤＢ⁃ＦＦＡＰ ｃｏｌｕｍｎ
分类 保留时间 ／ｍｉｎ 化合物名称
匹配度 ／
％
有机酸
１４ ２９ 乙酸 ９１
１５ ８７ 甲酸 ４７
２０ ３１ ２ 氯苯胺 ５ 磺酸 ６４
酮类
１１ ４１ １ 羟基，２ 丙酮 ４６
１７ ９４ ２ 环戊烯 １，４ 二酮 ６４
醛类
１４ ９３ 呋喃醛 ９０
１６ ２４ Ｎ，Ｎ 二甲基酰胺二异丙基乙缩醛 ４７
１７ ５２ ５ 甲基 ２ 呋喃羟基乙醛 ９４
醇类
１３ ６９６ １ 庚烯 ４ 醇 ９０
１９ １１ ２ 呋喃甲醇 ８６
胺类 ２７ １５ 三亚乙基二胺 ９６
表 ２ ＤＢ ５ 分离得到的代谢产物检出情况
Ｔａｂｌｅ ２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ＤＢ⁃５ ｃｏｌｕｍｎ
分类 保留时间 ／ｍｉｎ 化合物名称
匹配度 ／
％
糖类
１８ １４ 木酮糖 ６６
１９ ２４ Ｄ 呋喃核糖 ７２
１９ ５２ β ＤＬ 树胶醛吡喃糖 ９６
１９ ６５ Ｄ 木呋喃糖 ９０
１９ ８１ α Ｌ 甘露呋喃糖 ４２
２０ １３ Ｌ 阿卓糖 ６０
２０ ２０ 乙酰氨基葡糖 ８２
２０ ４７ Ｄ 果糖 ６５
２０ ９８ 吡喃葡萄糖 ４３
２１ ２４ Ｄ 葡萄糖 ５１
２１ ３４ 吡喃半乳糖 ４３
２１ ５９ 甘露糖 ８５
２１ ６４ β ＤＬ 来苏吡喃糖 ７３
２２ ０４ 塔罗糖 ６４
２２ ３８ Ｄ 阿卓糖 ６８
２２ ６１ Ｄ 吡喃甘露糖 ８２
２３ ７９ 半乳糖 ８０
２９ ０５ 麦芽糖 ６４
３０ ３３ Ｄ 果糖 α Ｄ 葡萄糖吡喃糖基 ３２
３０ ７９ 己吡喃糖 ４２
３１ ６８ 松二糖 ６２
表 ２（续表）
分类 保留时间 ／ｍｉｎ 化合物名称
匹配度 ／
％
糖苷
１９ ７０ 来苏吡喃糖苷 ８８
２１ ６７ α Ｄ 呋喃糖苷 ９４
２９ ２８ α Ｄ 吡喃葡萄糖苷β Ｄ 果糖呋喃糖基 ８１
醇
１５ ０６ １，２，３，４ 四羟基丁醇 ５２
１８ ８２ １，２，４，５，６ 五羟基 己糖醇 ５４
１９ ３６ ３ 脱氧 Ｄ 核己糖醇 ９６
２１ ３９ Ｄ 甘露醇 ６３
有机酸
７ ０５ 丙酸 ７０
３０ ６ β Ｄ 吡喃葡萄糖苷糖醛酸 ３２
其他
１１ ０６ 磷酸 ９８
２２ ８９ 十六烷酸，软脂酸，棕榈酸 ８４
２． ４ ＤＢ ＦＦＡＰ及 ＤＢ ５ 质谱柱对代谢产物分析
比较
表 ３为极性色谱柱及非极性色谱柱对代谢产物
的分析比较结果。 由表 ３ 可知：极性色谱柱 ＤＢ
ＦＦＡＰ在无衍生化条件下有利于酮类、醛类等极性的
代谢产物的分析；而基于非极性柱（ＤＢ ５）的分析代
谢产物经衍生化后具有更好的稳定性和挥发性适合
于糖类、糖苷类、醇类等带有羟基的化合物的气相色
谱的检测，因此在实际试样分析中对于以全部代谢物
为目标的分析需同时采用 ２种柱子，对于特定目标的
代谢产物应采用不同特性的色谱柱进行分析。
表 ３ 代谢产物总检出情况
Ｔａｂｌｅ ３ Ｔｏｔａｌ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ
分类 ＤＢ ＦＦＡＰ色谱柱检出代谢物数量
ＤＢ ５ 色谱柱检出
代谢物数量
糖 — ２１
糖苷 — ３
醇 ２ ４
有机酸 ３ ２
酮 ２ —
醛 ３ —
胺 １ —
其他 — ２
总计 １１ ３２
６６ 生 物 加 工 过 程 第 １１ 卷
３ 结 论
在对 Ｍ． ａｌｐｉｎａ胞内代谢物采集方法中，甲醇淬
灭方法产生的代谢物泄露比真空过滤后再于液氮
中淬灭的结果要低。 对于极性的代谢产物可以无
需衍生化采用极性的质谱柱直接实现分离；而对于
难挥发的糖类、糖苷类等化合物的检测较适合经衍
生化后通过非极性质谱柱分离。 对于同一生物试
样采用不同极性的色谱柱可以实现不同种类化合
物的定性检测。 因此根据目标需求可以采用单一
色谱柱或两种色谱柱进行分析。
参考文献：
［ １ ］ 袁成凌，姚建铭，余增亮．花生四烯酸及其代谢物的生物学作
用［Ｊ］ ．中国药物化学杂志，２０００，１０（１）：７５⁃７８．
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ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ［ Ｊ ］ ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，
１９９７，１５（１０）：４０１⁃４０９．
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ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ
［Ｊ］ ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ，２００５，８（３）：２４２⁃２４８．
［ ４ ］ Ｇｕｍｍｅｒ Ｊ Ｐ Ａ，Ｋｒｉｌｌ Ｃ，Ｄｕ Ｆａｌｌ Ｌ，ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｆｏｒ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ［Ｃ］∥Ｂｏｌｔｏｎ Ｍ Ｄ Ｄ，Ｔｈｏｍｍａ，Ｂ Ｐ Ｈ Ｊ Ｐ．
Ｐｌａｎｔ ｆｕｎｇａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ： ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：
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７６ 第 ６ 期 刘 欣等：高山被孢霉淬灭方法及胞内代谢产物的气相色谱 质谱分析比较