全 文 ：Vol. 30 , No. 6
pp. 618～621 　June , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 6 期
2004 年 6 月 　618～621 页
转基因烟草表达高山被孢霉Δ62脂肪酸脱氢酶基因的研究
李明春　刘　莉　胡国武　财音青格乐　邢来君 Ξ
(南开大学微生物系 ,天津 300071)
摘 　要 　将高山被孢霉 ATCC16266Δ62脂肪酸脱氢酶 (D6D)基因亚克隆到植物表达载体 pBI121 中 ,构建了 CaMV35S启动
子驱动的植物表达载体 pBMACL6。经根癌农杆菌 LBA4404 的介导 ,采用叶盘法转化烟草 Xanthi ,得到一批转基因烟草植
株。转基因植株的 PCR 和 Southern blot 分析表明 , D6 D 基因已经整合到烟草基因组中。脂肪酸 GC 分析表明 ,与未转基
因的烟草苗对照相比 ,转基因植株有 D6 D 基因目标产物γ2亚麻酸的产生 ,说明高山被孢霉的 D6 D 基因在烟草中得到了
表达。
关键词 　高山被孢霉 ;Δ62脂肪酸脱氢酶基因 ;转基因烟草 ;γ2亚麻酸
中图分类号 :S572
Study on the Expression of Δ62Fatty Acid Desaturase Gene of Mortierella alpina in
Transgenic Tobacco
LI Ming2Chun , LIU Li , HU Guo2Wu , CAIYIN Qing2Gele , XINGLai2Jun
( Department of Microbiology , Nankai University , Tianjin 300071 , China )
Abstract 　The plant transformation vector pBMACL6 was constructed to expressΔ62fatty acid desaturase (D6D) gene of
Mortierella alpina cDNA under control of the CaMV35S promoter. Tobacco was transformed by co2cultivating leaf dics with
Agrobaterium strains harboring pBMACL6. The regenerated Kanamycin2resistant transformants were analyzed by PCR ,
Southern blot and GC analysis of fatty acids. These results indicated the D6 D gene integrated into the tobacco genomic
DNA and expressed efficiently.γ2linolenic acid (18∶3Δ6 ,9 ,12 , GLA) and a new fatty acid , Octadecatetraenoic acid(18∶4
Δ6 ,9 ,12 ,15 , OTA) was detected in all transgenic tobacco.
Key words 　Mortierella isabellina ;Δ62fatty acid desaturase gene ;Transgenic tobacco ;γ2linolenic acid
　　γ2亚麻酸 (γ2linolenic acid , GLA) 作为花生四烯
酸、前列腺素和白三烯等生理活性物质的前体 ,对人
体的激素调节及脂肪酸代谢起着重要的作用[1 ,2 ] 。
Δ62脂肪酸脱氢酶 (delta 6 fatty acid desaturase ,D6D)是
GLA 生产中的关键酶 ,催化亚油酸 (Linoleic acid ,LA ,
18∶2 Δ9 ,12) 的第六位碳原子脱氢转化为γ2亚麻酸
( GLA ,18∶3Δ6 ,9 ,12) [3 ] 。GLA 主要存在于低等的真菌
和部分植物 ,如月见草、琉璃苣等 ,而现存的传统的
微生物发酵和从天然植物种子中分离 GLA 的方法 ,
难以满足市场对 GLA 日益增长的需求[4 ] 。人们试
图通过分子生物学的手段 ,把 D6 D 基因导入含油
作物中 ,进行植物油品质的改良。烟草作为转基因
植物的模式植物 ,许多基因已经在其中得到了很好
的表达。Reddy A S 等[5 ]首先从 1 株产 GLA 的蓝细
菌 ( Synechocystis sp . PCC6803) 中克隆到 D6 D 基因 ,
并在 D6 D 缺陷的蓝细菌 ( Anabaena sp . PCC7120) 中
获得了功能性表达。后来又将此基因在 CaMV35S
启动子驱动下在烟草中得以表达[6 ] 。1997 年 ,英国
学者从高等植物琉璃苣 ( Borago officinalis) 中分离了
D6 D 基因 ,将其转入烟草并得到表达产生 GLA[7 ] 。
日本和美国的学者几乎同时报道从高山被孢霉中分
离了 D6 D 基因 ,并在米曲霉和酿酒酵母菌中得到
了表达[8 ,9 ] 。根据不同生物体 D6 D 基因序列的比
较 ,发现不同物种间氨基酸序列同源性差异显著 ,未
见从真菌克隆的 D6 D 基因在植物中表达的报道。
本研究是在克隆高山被孢霉 D6 D 基因并在酿酒酵
母表达的基础上[10 ] ,进一步把该基因导入模式植物
烟草中进行表达 ,为把该基因导入油料作物如大豆、Ξ基金项目 :国家自然科学基金项目 (30200176)和高等学校骨干教师资助计划项目。
作者简介 :李明春 (1968 - ) ,女 ,天津人 ,副教授 ,博士 ,从事转基因植物的研究。
Received (收稿日期) :2002210208 , Accepted(接受日期) :2003211204.

油菜中 ,改良食用油品质 ,创建新型含油作物种质提
供良好的基础。
1 　材料与方法
1. 1 　菌株与质粒
　　大肠杆菌 DH5α和根癌农杆菌 ( Agrobacterium
tumefaciens) LBA4404 ,携带有 D6 D 基因的 pTMACL6
质粒[10 ] ,它与植物表达载体 pBI121 均由南开大学真
菌实验室提供。
1. 2 　植物材料
烟草 ( Nicotiana tobacum cv. Xanthi) 为南开大学
真菌实验室提供。
1. 3 　PCR引物及扩增条件
PCR 目的产物为 D6 D 基因 ,上游引物 ( P1) , 引
入 Xba Ⅰ位 点 : 5′2GGCT TCTAGA ATGGCTGCT2
GCTCCCAGT23′,下游引物 (P2) , 引入 Sac Ⅰ位点 :5′2
CTGC GAGCTC TTACTGCGCCTTACC23′, PCR 扩增条
件 :94 ℃3 min ;94 ℃30 s ,55 ℃30 s ,72 ℃2 min ,循环
30 次 ,72 ℃10 min。
1. 4 　植物表达载体的构建
以质粒 pTMACL6 为模板 ,用 P1、P2 为引物进行
扩增。分别用 Xba Ⅰ和 Sac Ⅰ双酶切植物表达载体
pBI121 和 PCR 得到基因片段。连接以后所得质粒
为 pBMACL6 (图 1) 。质粒的提取、酶切、连接及转化
参照文献[11 ]进行。
图 1 　表达载体 pBMACL6 的结构图
Fig. 1 　The construction of expression vectors pBMACL6
1. 5 　烟草转化及转基因植株的培养
采用液氮冻融法[12 ]将构建好的植物表达载体
pBMACL6 转化到农杆菌 LBA4404 中。经检查克隆
正确后 ,按照叶盘法 ,通过农杆菌介导将重组质粒
pBMACL6 转化到烟草 ( Nicotiana tobacum cv. Xanthi)
中 ,按常规方法进行烟草的再生[12 ] 。
1. 6 　转基因烟草的 PCR鉴定
分别提取转基因烟草和未转基因烟草叶片的基
因组 DNA[13 ] ,取 2μL 作为模板 ,以 P1/ P2 为引物于
25μL 体系中进行 PCR 扩增 ,PCR 产物于 1 %琼脂糖
凝胶中电泳。
1. 7 　转基因烟草 Southern blot 分析
取15μg 烟草总 DNA ,用 Hind Ⅲ单酶解后在
018 %的琼脂糖凝胶上电泳。用真空转膜仪将凝胶
上的 DNA 转移到尼龙膜上。以高山被孢霉 D6 D 基
因为探针 ,按 Roche 公司地高辛标记及显色试剂盒
说明书进行标记和显色。
1. 8 　转基因烟草的脂肪酸分析
参照文献[9 ]提取转基因烟草的全苗脂肪酸并
甲酯化 ,然后于气相色谱仪 (岛津 GC29A) 上进行脂
肪酸分析。柱子为 SE252/ 25 m ;载气 : N2 , 50 mL/
min ;气化室温度 :280 ℃,柱温 :210 ℃;溶剂 :正己烷 ;
检测器 :氢火焰离子化检测器。分析软件 :津瑞公司
的色谱工作站。
2 　结果与讨论
2. 1 　植物表达载体的构建
　　以 pTMACL6 为模板 ,PCR 扩增出的目的带大小
为 1. 4 kb ,与预期的相符。用高山被孢霉 D6 D 基因
替换 pBI121 的 GUS 基因 ,启动子为 CaMV35S , GUS
基因的大小为 1. 9 kb , D6 D 基因的大小为 1. 4 kb。
pBI121 和重组质粒经 EcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ和 Xba Ⅰ+
Sac Ⅰ双酶切鉴定 ,分别得到 3. 0、2. 5 和 1. 9、1. 4 kb
的片段 ,说明在 pBI121 中用 D6 D 基因替换 GUS 基
因成功 ,把携带高山被孢霉 D6 D 基因的 pBI121 重
组表达载体命名为 pBMACL6。
2. 2 　农杆菌转化及转基因烟草的获得
采用液氮冻融法将构建好的植物表达载体 pB2
MACL6 转化到根癌农杆菌 LBA4404 中 ,然后在含有
125μg/ mL Str , 25 μg/ mL Rif 和 100 μg/ mL Kan 的
YEB 选择培养基上 ,28 ℃培养 48 h ,出现白色菌落
后 ,采用菌落 PCR 法鉴定农杆菌的转化子。电泳检
测表明其 PCR 产物大小一致 ,均为 1. 4 kb ,证明构
建的植物表达载体 pBMACL6 已转入农杆菌中。把
含有目的基因的农杆菌经过活化后 ,利用叶盘法对
烟草叶片进行转化 ,经 1～2 次继代培养 ,外植体产
生愈伤组织 ;经 2～3 次继代培养 ,愈伤组织分化出
916　6 期 李明春等 :转基因烟草表达高山被孢霉Δ62脂肪酸脱氢酶基因的研究 　　　

芽 ;把芽转移到分化培养基上继续培养 ,待芽长到 2
cm 左右 ,转到生根培养基上 ,长成完整植株 ;等根发
育完全后 ,移栽到花盆中 (图略) 。
2. 3 　转基因烟草的 PCR鉴定
提取 Kan 阳性植株总 DNA ,以质粒 pTMACL6 为
阳性对照 ,未转基因烟草的总 DNA 为阴性对照 ,用
引物 P1/ P2 对其进行 PCR 检测 ,进行初筛。结果表
明 ,部分 Kan 阳性植株总 DNA 的扩增产物同阳性对
照所扩增的产物大小一致 ,均为 1. 4 kb ,而未转基因
烟草没有扩增产物。在对得到的 20 株转基因植株
的 PCR 检测中 ,有 12 株为阳性 (图 2) 。
图 2 　转基因烟草的 PCR鉴定
Fig. 2 　Identification of transgenic tobacco by PCR
1 - 6 :Transgenic tobacco plants ;7 :Non transgenic tobacco plant ;
8 :DL2000 Marker ;9 :pTMACL6 PCR product
图 4 　转基因烟草总脂肪酸含量的分析
Fig. 4 　GC analysis of fatty acid methyl esters prepared from untransfromed and transgenic tobacco
2. 4 　转基因烟草的 Southern 杂交
取 PCR 鉴定为阳性的 3 株转基因烟草总 DNA
各 15μg ,用 Hind Ⅲ充分酶切 ,同样取未转基因的烟
草 DNA 作为阴性对照 ,用含有目的基因的过渡载体
pBI221MACL6/ Hind Ⅲ酶切产物作为阳性对照 ,以
D6 D 基因为探针 ,进行 Southern 杂交 ,3 株均为阳
性 ,杂交带的大小与阳性对照一致 (图 3) 。
图 3 　D6 D 转基因烟草的
Southern blot 杂交鉴定
Fig. 3 　Identification of D6 D gene in transgenic
tobacco plants by Southern blot hybridization
1 ,2 ,3 :Transgenic tobacco plants ;4 :CK,Non2tra2
sgenic tobacco plant ;5 : + CK,pBI221MACL6/ Hind Ⅲ
2. 5 　转基因烟草的脂肪酸含量分析
把经过 PCR 和 Southern 杂交鉴定为阳性的转基
因烟草全苗进行脂肪酸甲酯化 ,然后用气相色谱仪
测定脂肪酸含量。GC 测定结果如图 4 所示。与标
准品 GLA 和未转基因烟草对照相对比 ,在转基因烟
草植株 121MA 中 ,有出峰时间为 11. 58 的特殊峰 ,与
标准品 GLA 出峰时间 11. 6 一致 ,在对照中 ,不含
GLA。同时 ,在转基因植株中 ,还存在另外一个新的
特殊峰 ,出峰时间为 12. 78 (黑色箭头) ,推测可能是
十八碳四烯酸 (octadecatetraenoic acid ,18∶4Δ6 ,9 ,12 ,15
026 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

OTA) ,是烟草中的α2亚麻酸 (α2linolecin acid ,ALA) (C
18∶3Δ9 ,12 ,15) 由 D6 D 在 C6 上脱氢 ,形成 OTA。GC
分析表明 ,转基因烟草的苗中 GLA 和 OTA 含量分别
为小苗总脂肪酸含量的 2. 1 %和 2. 1 %。
综上所述 ,通过农杆菌介导转化烟草 ,获得一批
携带有高山被孢霉 D6 D 基因的转基因烟草 ,经 PCR
初筛及 Southern 杂交等分子检测 ,表明 D6 D 基因已
经整合到烟草的基因组染色体上。经脂肪酸的 GC
分析 ,说明已获得了产生 GLA 的转基因烟草 ,同时 ,
检测到一种新的脂肪酸OTA ,证明外源的 D6 D 基因
在烟草中得到了表达。本文一方面研究和证明了真
菌脂肪酸脱氢酶基因在高等植物中的表达 ,另一方
面为改良油品质 ,把该基因转入大豆、油菜等含油作
物 ,创立新型产 GLA 的含油作物新种质提供了可靠
的依据。
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