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ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.11No.3
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ArachidonicacidproductionfromcanemolassesbyMortierelaalpina
PENGChao1,HUANGHe1,2,JIXiaojun1,LIUXin1,NIEZhikui1,DENGZhongtao1
(1.ColegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,NanjingUniversityofTechnology,Nanjing211800,China;
2.StateKeyLaboratoryofMaterialsOrientedChemicalEngineering,NanjingUniversityofTechnology,Nanjing210009,China)
Abstract:Arachidonicacid(ARA)fermentationbyMortierelaalpinawascariedoutusingcane
molassesSeveraldiferentpreparationmethodswereinvestigatedtoevaluatetheoptimalprocessofcane
molassesmethodTheresultsindicatedthatsulfuricacidprocesswasthebestmethodThecultivation
parameterswereasfolows:reducingsugarconcentration80g/L,nitrogenresourceconcentration6g/L,
inoculumdensity20%,initialpH60,andcultivationtemperature25℃Theresultantdrycelweight,
totallipidcontent,arachidonicacidyield,andsugarutilizationwere285g/L,117g/L,368g/L,and
945%,respectively
Keywords:arachidonicacid;canemolasses;fermentation;Mortierelaalpina
T&UVW
(arachidonicacid,ARA)
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(4) 180 405 358 729 261 936
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(5) 163 346 323 564 182 835
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HI
:
[1] HeinzE.Biosythesisofpolyunsaturatedfatyacids[M]∥MooreT
S.LipidMetabolisminPlants.BocaRaton:CRCPress,1993:
3389.
[2] SinghG,ChandraRK.Biochemicalandcelularefectsoffish
andfishoils[J].ProgFoodNutr,1988,12:371419.
[3] GilI,ValivtryR.Polyunsaturatedfatyacids:part1.occurence,
biologicalactivitiesandapplications[J].TrendsBiotechnol,
1997,15(10):401409.
[4] SakuradaniE,HiranoY,KamadaN,eta1.Improvementof
arachidonic acid production by mutants with lower n3
desaturationactivityderivedfromMortierelaalpina1S4[J].
ApplMicrobiolBiotechnol,2004,66(3):243248.
[5] PengC,HuangH,JiX,etal.Efectsofnhexadecane
concentration and a twostage oxygen controlstrategy on
arachidonicacidproductionbyMortierelaaplinaME1[J].
ChemEngTechnol,2010,33(4):692697.
[6] ChenHC,ChangCC,ChenCX.Optimizationofarachidonic
acidproductionbyMortierelaalpinaWujiH4isolate[J]JAm
OilChemSoc,1997,74(5):569578.
[7] FakasS,PapanikolaouS,BatsosA,etal.Evaluatingrenewable
carbonsourceassubstratesforsingleceloilproductionby
Cunninghamelaechinulata and Mortierela isabelina[J].
BiomassBioenergy,2009,33:573580.
[8] DedyukhinaE G,ChistyakovaTI,KamzolovaSV,etal.
ArachidonicacidsynthesisbyglycerolgrownMortierelaalpina
[J].EurJLipidSciTechnol,2012,114(7):833841.
[9]
+,
,
©m$
,
ª«¬
.
9:÷4IJ&×]^_O`aWh
[dü
[J].
H&)
,2006,6(4):552556.
[10] LiNan,DengZhinian,QinYongling,etal.Productionof
polyunsaturatedfatyacidsbyMucorrecurvusspwithsugarcane
molassesasthecarbonsource[J].FoodTechnolBiotechnol,
2008,46(4):7379.
[11]
®¯
,
°±
,
²³´
.
%9:÷4µ¶ãIJ&×·¸W
[J].
))
,2008,59(6):14901495.
[12]
¹º»
,
+¼
,
N½¾
,
{
.
%9:÷4¿sIJ×ÀÁW
h78
[J].
¢Â{
,2010(5):3538.
[13] JohnsonV,SinghM,SainiVS,etal.EfectofpHonlipid
accumulationbyanoleaginousyeast:RhodotorulaglutinisIP30
[J].WorldJMicrobiolBiotechnol,1992,8(4):382384.
[14] PengC,HuangH,JiX,etal.Atemperatureshiftstrategyfor
eficientarachidonicacidfermentationbyMortierelaalpinain
batchculture[J].BiochemEngJ,2010,53(1):9296.
6
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